专利名称：肉鹅屠体性状微卫星分子标记选择方法
技术领域：
本发明涉及家禽选择技术领域，具体涉及肉鹅屠体性状的微卫星分子标记选择方法。
背景技术：
肉鹅屠体性状主要包括屠宰率、半净膛率、全净膛率、腹脂率、胸肌率和腿肌率，是肉鹅生产中的重要经济性状，在肉鹅育种中越来越受重视。由于屠体性状是不能采用活体度量的经济性状，传统的肉鹅屠体性状选择方法主要为(I)根据系谱资料选择，即将血缘优良的选留作种用，血缘差的淘汰；(2)根据同胞成绩选择，即根据全同胞或半同胞的屠体 成绩来估测种禽的屠体性状；(3)根据后裔成绩选择，即根据后裔的屠体成绩来选留亲本。由此可见，上述方法都是根据屠体性状的表型来进行选择，而选择的真正目的却在于选出优良的基因型。由于表型选择是一个长期的积累过程，其影响因素又很多，如选择强度、选择性状的数目、世代间距和环境条件等，都会对表型选择发生作用，其变异呈连续性，加之性状的表型与其基因型之间的关系复杂，在大多数情况下并不完全吻合，因而选择往往难以准确，只有多次重复同一方法，连续数代定向选择才能取得显著效果。为此，许多研究者正在不断探索新的更为有效的肉鹅屠体性状选择技术，以改变传统选择方法的不足。家禽的屠体性状属于数量性状。传统的数量遗传学认为，数量性状优势是由微效多基因控制的，它对数量性状有较大影响但又难以识别和分离，因而可以通过选择与数量性状相连锁的分子遗传标记来实现对基因型的选择，这已成为家禽育种过程中的一种重要手段和方法。分子遗传标记是以物种基因突变造成DNA片段长度多态性为基础的，具有许多优点(I)可以直接探测DNA水平的差异，不受时空的限制；(2)标记数量丰富、多态性高；(3)共显性标识，可以区分纯合子与杂合子；(4)可以解释家系内某些个体的遗传变异；
(5)可以鉴定不同性别、不同年龄的个体；同时，采用标记辅助选择可以在家禽的生命早期开始而不必等待生产性状完全表现出来；并在两性中同时选择任何生产性状，突破了限性性状只能从单种性状选择的局限；在选择屠体性状的过程中，不必做昂贵的屠宰试验。由此可见，利用分子遗传标记改良家禽品种是一门较为理想的新型学科，可以缩短世代间隔，提高选择强度，增加选择的准确性，从而加速家禽的遗传进展。目前，国际上对于肉鹅屠体性状的标记辅助选择还鲜有报道，也不曾提出肉鹅屠体性状的有效评定选择方法，在肉鹅屠体性状的分子标记选择领域尚属空白。因此建立一种评定肉鹅屠体性状的有效分子标记方法非常必要，同时也可为具有优良屠体性状的肉鹅品种选择提供可靠的依据。
发明内容
本发明目的是，针对传统肉鹅屠体性状表型选择方法易受多种因素影响，表型与其基因型之间不完全吻合，因而选择准确性低、周期长等缺陷，提供一种在鹅的生命早期即可开始、准确性高、选育周期短且不必做屠宰试验的依据肉鹅微卫星标记的基因型进行肉鹅屠体性状选择的分子遗传标记选择方法。
本发明所述的肉鹅屠体性状微卫星分子标记选择方法，是在完成下列基础工作后取得的
O鹅微卫星分子标记的筛选
根据生物素与链霉亲和素的亲和原理，应用上海英俊生物技术有限公司合成的生物素-ATAGAATAT (CA) 12探针和Biolabs公司的链霉亲和素磁珠，采用磁珠富集法构建鹅基因组微卫星富集文库，以PCR检验从中筛选出阳性克隆，测序分析获得197个微卫星序列片段；
对于肉鹅微卫星分子标记的筛选，首先根据上述197个微卫星序列片段两端的保守序列分别设计引物(RY001-RY197);然后对每个肉鹅群体中的100-200只肉鹅个体血样基因组DNA分别进行PCR扩增反应；最后将扩增产物进行PAGE电泳检测，从中选择有明显扩增产物的引物进行微卫星多态性分析；所采用的PCR扩增反应体系为IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1 dNTPs I. 0-3. 0 μ L, 5. OU· μ U1Bx Taq酶 O. 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 O. 4-0. 6 μ L，10 μ mol/L 下游引物 O. 4-0. 6 μ L，50ng. μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ;PCR 扩增反应程序为 94°C预变性 4min ；28-35 个循环(94°C 40 S, 50-60°C 30 S，72°C 30s ) ;72°C延伸 5min ;4°C保存；运用 genemapper version 3. 5软件分析确定微卫星片断长度和识别微卫星基因型；
2)肉鹅屠体性状测定
肉鹅屠体性状的指标有屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率，参照《畜禽遗传资源调查技术手册》(陈伟生，2006)操作；
3)屠宰性状与微卫星标记的关联性分析
采用SPSS 11. 5软件包中广义线性模型(General Linear Model，GLM)进行最小二乘法分析不同微卫星位点基因型与肉鹅屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率的相关性，结果发现RY36位点的AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9种基因型肉鹅个体的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率差异明显，其中AC基因型个体的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率显著高于其他基因型的个体，而基因型AD个体的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率最低，表明AC基因型个体的屠体性状最优；
在取得以上肉鹅屠体性状相关分子标记的基础上，本发明目的通过以下技术方案来实现。肉鹅屠体性状微卫星分子标记选择方法，该方法按以下步骤进行
(O设计鹅RY36位点的特异性引物根据鹅微卫星位点RY36两端的侧翼序列设计一对特异性引物，
其上游引物序列为 RYF: 5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ ；
其下游引物序列为 RYR:5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’ ；
(2)肉鹅屠体性状测定肉鹅屠体性状测定的指标有屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率，参照陈伟生，2006《畜禽遗传资源调查技术手册》操作；
(3)PCR扩增反应在每个肉鹅群体随机选择100-200只肉鹅个体，翅静脉采集血液，按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应,所采用的反应体系为 10X Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1dNTPs I. 0-3. 0μ L,5. 0U· μ U1Bx Taq 酶 0· 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0· 4_0· 6 μ L，10μ mol/L 下游引物 O. 4-0. 6 μ L，50 ng· μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ；PCR 扩增反应程序为 94°C预变性 4min，按 94°C 40 S、50_60°C 30 S、72°C 30S 28-35 个循环，72 °C延伸5min，4°C保存；
(4)PCR扩增产物的多态性分析先配制6%的变性聚丙烯酸胺凝胶用于PAGE电泳检测，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至60 ml后备用；取PCR产物5 μ I与等体积的6 X loading buffer混合，加样到6%的变性聚丙烯酞胺凝胶上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)为分子量标记，300 V电压电泳2. 5 h ;电泳结束后立即进行银染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去离子水清洗3次，每次2 min,再用已加入终浓度为I. 5 ml/L甲醛的O. I %AgN03染色30 min ;去离子水快速冲洗10 s ;再使用已加入终浓度为3 ml/L甲醒的3 %碳酸钠显影；最后再用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5软件分析微卫星位点RY36的基因型，筛选出AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9种基因型肉鹅个体；
(5)优胜肉鹅亲本个体的选择选留AC基因型的个体作为肉鹅选择亲本，淘汰AD、BD、 CC、CD、CG、DD、DE和EF基因型的个体。本发明的有益效果是
所提出的肉鹅屠体性状相关的微卫星分子标记在应用于肉鹅屠体性状的选择工作中，具有以下的有益效果
第一，本发明是根据基因型进行肉鹅屠体性状选择，精确度高，操作简单，费用低，选择成本约为O. 3元/只，并可以进行自动化规模检测；
第二，利用本发明的微卫星分子标记方法可以在肉鹅的生命早期(出生后I周内)即开始选择屠体性状，而不必做昂贵的成年肉鹅屠宰试验，可以缩短世代间隔，提高选择强度，能够较早地选择出优良的种鹅亲本，从而加速肉鹅的育种进程，与传统的屠宰试验选择方法比较每代可缩短选择时间3个月左右；
第三，利用本发明的微卫星分子标记方法对肉鹅屠体性状进行选择，不仅可为肉鹅育种工作中标记辅助选择提供一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时可以克服常规屠体性状选择方法工作量大、易受环境影响和育种周期长等缺点，为肉鹅屠体性状改良提供一种有效的分子标记育种手段，从而加速肉鹅的遗传进展。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但应当理解本发明并不受以下内容所限止。以下实施例所米用的」& Taq, dNTPs, 10 X Ex Taq Buffer, 6 X loading buffer和100 bp ladder molecular size standard均购自宝生物工程(大连)有限公司。实施例I :(太湖鹅屠体性状的选择)
(1)设计鹅RY36位点的特异性引物根据鹅微卫星位点RY36两端的侧翼序列设计一对特异性引物 RYF :5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ 和 RYR :5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’；
(2)太湖鹅屠体性状测定太湖鹅屠体性状测定的指标有屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率，参照陈伟生，2006《畜禽遗传资源调查技术手册》操作；
(3)PCR扩增反应在太湖鹅群体选择150只预留种个体，翅静脉采集血液，按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应，所采用的反应体系为 IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1 dNTPs3· 0 μ L，5. OU. μ Taq 酶 O. 25 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 下游引物
O.4 μ L，50 ng. μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 95 μ L ；PCR 扩增反应程序为 94°C预变性4min;28 个循环(94°C 40 S,60°C 30 S，72°C 30s )，72°C延伸 5min，4°C保存；
(4)PCR扩增产物的多态性分析先配制6%的变性聚丙烯酸胺凝胶用于PAGE电泳检测，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至60 ml后备用；取PCR产物5 μ I与等体积的6 X loading buffer混合，加样到6%的变性聚丙烯酞胺凝胶上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)为分子量标记，300 V电压电泳2. 5 h ;电泳结束后立即进行银染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去离子水清洗3次，每次2 min,再用已加入终浓度为I. 5 ml/L甲醛的0. I %AgN03染色30 min ;去离子水快速冲洗10 s ;再使用已加入终浓度为3 ml/L甲醒的3 %碳酸钠显影；最后用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5软件分析微卫星位点RY36的基因型，筛选出AC、AD、BD、CC、⑶、CG、DD、DE和EF 9种基因型的肉鹅个体；最小二乘法 分析获得150只预留种个体不同基因型与屠体性状的相关性；
这里以其中10只预留种个体为例说明，10只太湖鹅个体的基因型和测定得到的屠体性状数值见表I。表I RY36位点不同基因型太湖鹅个体的屠宰性能
权利要求
1.肉鹅屠体性状微卫星分子标记选择方法，其特征在于按以下步骤进行 (O设计鹅RY36位点的特异性引物根据鹅微卫星位点RY36两端的侧翼序列设计一对特异性引物， 其上游引物序列为 RYF: 5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ ； 其下游引物序列为 RYR:5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’ ； (2)肉鹅屠体性状测定肉鹅屠体性状测定的指标有屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率，参照陈伟生，2006《畜禽遗传资源调查技术手册》操作； (3)PCR扩增反应在每个肉鹅群体随机选择100-200只肉鹅个体，翅静脉采集血液，按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应,所采用的反应体系为 IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1dNTPs I. 0-3. 0μ L,5. 0U· μ U1Bx Taq 酶 0· 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0· 4_0· 6 μ L，.1(^11101/1下游引物0.4-0.6 4 1^，50 ng· μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ；PCR 扩增反应程序为 94°C预变性 4min，按 94°C 40 S,50-60°C 30 S、72°C 30S28-35 个循环，72 °C延伸5min，4°C保存； (4)PCR扩增产物的多态性分析先配制6%的变性聚丙烯酸胺凝胶用于PAGE电泳检测，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至.60 ml后备用；取PCR产物5 μ I与等体积的6 X loading buffer混合，加样到6%的变性聚丙烯酞胺凝胶上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)为分子量标记，.300 V电压电泳2. 5 h ;电泳结束后立即进行银染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去离子水清洗3次，每次2 min,再用已加入终浓度为I. 5 ml/L甲醛的0. I %AgN03染色.30 min ;去离子水快速冲洗10 s ;再使用已加入终浓度为3 ml/L甲醒的3 %碳酸钠显影；最后再用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5软件分析微卫星位点RY36的基因型，筛选出AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9种基因型肉鹅个体； (5)优胜肉鹅亲本个体的选择选留AC基因型的个体作为肉鹅选择亲本，淘汰AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF基因型的个体。
全文摘要
本发明公开了肉鹅屠体性状微卫星分子标记选择方法，属于家禽选育技术领域。该方法包括(1)设计鹅RY36位点的特异性引物上游引物为5’-TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’；下游引物为5’-GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’；(2)肉鹅屠体性状测定；(3)PCR扩增反应；(4)PCR扩增产物的多态性分析；(5)优胜肉鹅亲本个体的选择等步骤工艺。本发明是依据基因型进行肉鹅屠体性状选择，精确度高，操作简单；可以在肉鹅生命早期开始选择屠体性状，缩短世代间隔，加速肉鹅育种进程，每代可缩短选择时间3个月左右；该方法可在家禽育种领域中推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102719549SQ20121023664
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者卢立志, 徐坚, 李国勤, 李进军, 沈军达, 王德前, 田勇, 陈黎, 陶争荣 申请人:浙江省农业科学院