专利名称：一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记及其引物与检测方法
技术领域：
本发明涉及选择性分子标记和小黄鱼，具体涉及一种能检测小黄鱼种群结构的选择性遗传标记、引物及其检测方法。
背景技术：
渔业资源的保护和管理需要清晰了解鱼类的群体结构，但洄游性海水鱼类相比较于淡水鱼类群体结构通常并不明显，有的甚至可视为一个自由交配群体。这是由于开放的海洋环境中缺少遗传障碍并且不同洄游群体之间往往在产卵场或索饵场存在混合的现象，因而存在着很显著的基因流，不同地理群体之间的遗传分化很弱(Waples，The Journalof heredity 1998,89 438 - 450 ；Ruzzante 等，Proceedings of the Royal SocietyB-Biological Sciences 2006,273:1459 - 1464)。目前分析鱼类群体遗传结构的技术主要是使用中性的分子标记，但即使是灵敏度高的SSR和SNP标记，在分析这类洄游性鱼类的群体结构时往往也束手无策。值得指出的是，广阔而且多变的海洋环境为自然选择提供了更多的机会，适应性进化因而可能普遍存在于海洋鱼类中，因此用选择性标记去分析可能会检测到洄游性鱼类的群体结构，这对鱼类群体的保护和管理来说是至关重要的(Nielsen等，Molecular Ecology 2009,18:3128-3150)。/\、黄鱼XLarimichthys隶属于S卢形目、石首鱼科、黄花鱼属，为广泛分布于渤海、黄海和东海北部的暖温性底层鱼类，是我国重要的海洋渔业经济种类，曾被誉为我国“四大渔业”之一。近些年来，高强度的捕捞压力已经使得小黄鱼资源处于过度捕捞状态。为了保护和管理小黄鱼渔业资源，研究其种群遗传结构和遗传变异水平是非常必要的。然而，由于小黄鱼是一种洄游性海水鱼类，中性线粒体分子标记分析了小黄鱼的群体结构后认为整个小黄鱼是一个自由交配的群体(Xiao等,Environmental Biology of Fishes2009,85 :303-314)。显然，开发和应用小黄鱼选择性分子标记是解决问题的关键。
发明内容
本发明的目的在于针对现有中性分子标记难以检测出小黄鱼群体结构的不足，提供一种能够检测小黄鱼群体间遗传差异的选择性分子标记序列及其引物。本发明的另一个目的在于提供用上述选择性分子标记检测小黄鱼群体结构的方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记H16，其序列如SEQ ID NO. I所示。其引物序列为:
H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCAH16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA
一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记H16，其检测方法步骤如下
(1)基因组DNA的提取
采用酚氯仿法提取小黄鱼分布范围内采集到的32个产卵群体共1104尾小黄鱼个体的基因组DNA，步骤如下剪取20mg尾鳍于I. 5ml离心管中，加入570yL STE buffer(10mmol/L Tris-Cl, pH=8. 0; lOOmmol/L EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并将组织剪碎；加入IOyL 20mg/ml的蛋白酶K和20 μ L 20% SDS，55_56°C消化；加入600 μ L酚氯仿异戍醇(25:24:1)抽提两次，13000r/min离心5min,取上清；加入等体积_20°C预冷的无水乙醇，混匀，13000r/min离心5min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下晾干，然后加入 50-100yL TE buffer (lmmol/L EDTA, I Ommo I/L Tris-HCl, ρΗ=8· 0)溶解 DNA ;紫外分光光度计检测DNA浓度，用TE buffer将其稀释至100 μ g/mL,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；DNA样品存于_80°C冰箱中备用；
(2)PCR扩增反应及测序
扩增反应体系为20yL :0. 5μΜ引物(正向引物5’端用荧光染料HEX标记)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgCl2, IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及 50ng模板DNA ;反应程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min ;PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自动测序仪分离，片段长度用软件GeneMapper根据内标R0X-500确定；
(3)中性检测
采用如下方法一或方法二检测位点是否中性方法一是利用软件BAYESCAN中的贝叶斯模拟检测，界定群体-位点特异性效应对Fst的影响并用Markov chain Monte Carlo方法来评估其后验概率分布；方法二是利用软件Arlequin 3. 5进行结构性的岛模型分析；
(4)群体结构分析
小黄鱼的群体结构利用软件ARLEQUIN 3. 5通过计算Wright’s F统计用pairwise Fst矩阵来评估；为了比较不同类型标记及其遗传结构，采用SPSS vl6. O对pairwise Fst矩阵进行了多维尺度分析；以isolation by distance形式用Mantel tests检测地理隔离对小黄鱼遗传结构的影响。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明是国内外首次基于选择性分子标记建立的一种小黄鱼群体结构分析新方法，它利用来自小黄鱼的BAHCCl基因设计合成的一对特异性引物，进行PCR反应和测序片段分析就可以检测出小黄鱼的群体结构，而中性的分子标记很难检测到洄游性小黄鱼群体间的微弱遗传差异。
图I :基于选择性分子标记H16的小黄鱼群体结构多维尺度(MDS)分析图。BS :渤海群体；NYS :黄海北部群体；CYS :黄海中部群体；SYS :黄海南部群体；NECS :东海北部群体；CECS :东海中部群体。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记H16，其序列如SEQ ID NO. I所示。其引物序列为
H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA检测方法步骤如下
(I)基因组DNA的提取
采用酚氯仿法提取小黄鱼分布范围内采集到的32个产卵群体共1104尾小黄鱼个体的基因组DNA，具体步骤如下剪取20mg尾鳍于I. 5ml离心管中，加入570yL STE buffer(10mmol/L Tris-Cl, pH=8. 0; 10Ommol/T, EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并将组织剪碎。加入10 μ L 20mg/ml的蛋白酶K和20yL 20% SDS，55_56°C消化。加入600 μ L酚氯仿异戍醇(25:24:1)抽提两次，13000r/min离心5min,取上清。加入等体积的无水乙醇，混勻，13000r/min离心5min,弃上清,用70%乙醇洗漆沉淀2次,室温下晾干，然后加入 50-100 μ L TE buffer (lmmol/L EDTA, IOmmoI/L Tris-HCl, ρΗ=8· 0)溶解 DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度，用TE buffer将其稀释至100 μ g/mL,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。DNA样品存于_80°C冰箱中备用。(2) PCR扩增反应及测序
扩增反应体系为20yL :0. 5μΜ引物(正向引物5’端用荧光染料HEX标记)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgCl2, IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA。反应程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min。PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自动测序仪(Applied Biosystems)分离,片段长度用软件GeneMapper根据内标R0X-500确定。结果表明选择性分子标记H16检测到等位基因大小在216-256，杂合度为0.6332。(3)中性检测
采用两种方法检测位点是否中性一是利用软件BAYESCAN中的贝叶斯模拟检测，界定群体-位点特异性效应对Fst的影响并用Markov chain Monte Carlo(MCMC)方法来评估其后验概率分布。二是利用软件Arlequin 3. 5进行结构性的岛模型(hierarchical islandmodel)分析。结果表明BAYESCAN分析得出位点特异性效应α =3. 0859，后验概率分布Pr=L 0000 !hierarchical island model 分析得出概率值P-value=0. 0000。两种中性检测方法都得出H16处在显著的选择压力下，为选择性位点。(4)群体结构分析
小黄鱼的群体结构利用软件ARLEQUIN 3. 5通过计算Wright’s F统计用pairwise Fst矩阵来评估。为了比较不同类型标记及其遗传结构，采用SPSS vl6. O对pairwise Fst矩阵进行了多维尺度(MDS)分析。结果表明选择性分子标记H16检测到整个小黄鱼群体呈现出明显的结构(Fst=O. 092，P〈0. 001)，东海北部群体和东海中部群体之间存在显著分化，在其它分布区域内属于这两个类群的 混合存在(见附图I)。
权利要求
1.一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记，其特征在于所述的标记编号为H16，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.权利要求I所述选择性分子标记H16的引物序列，其特征在于如下所示H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCAH16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。
3.权利要求I所述选择性分子标记H16的检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)基因组DNA的提取 采用酚氯仿法提取小黄鱼分布范围内采集到的32个产卵群体共1104尾小黄鱼个体的基因组DNA，步骤如下剪取20mg尾鳍于I. 5ml离心管中，加入570 y L STE buffer(10mmol/T, Tris-Cl, pH=8. 0; 100mmol/L EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并将组织剪碎；加入IOiiL 20mg/ml的蛋白酶K和20 y L 20% SDS，55_56°C消化；加入600 y L酚氯仿异戊醇(体积比25:24:1)抽提两次，13000r/min离心5min，取上清；加入等体积_20°C预冷的无水乙醇，混勻，13000r/min离心5min,弃上清,用70%乙醇洗漆沉淀2次,室温下晾干，然后加入 50-100 ii L TE buffer (lmmol/L EDTA, IOmmoI/L Tris-HCl, pH=8.0)溶解DNA ;紫外分光光度计检测DNA浓度，用TE buffer将其稀释至100 u g/mL,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；DNA样品存于_80°C冰箱中备用； (2)PCR扩增反应及测序 扩增反应体系为20 ii L :0. 5 ii M引物(正向引物5’端用荧光染料HEX标记)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgC12，IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA ;反应程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min ;PCR 产物用 ABI PRISM 3730 DNA 自动测序仪分离，片段长度用软件GeneMapper根据内标R0X-500确定； (3)中性检测 采用如下方法一或方法二检测位点是否中性方法一是利用软件BAYESCAN中的贝叶斯模拟检测，界定群体-位点特异性效应对Fst的影响并用Markov chain Monte Carlo方法来评估其后验概率分布；方法二是利用软件Arlequin 3. 5进行结构性的岛模型分析； (4)群体结构分析 小黄鱼的群体结构利用软件ARLEQUIN 3. 5通过计算Wright’s F统计用pairwise Fst矩阵来评估；为了比较不同类型标记及其遗传结构，采用SPSS vl6.0对pairwise Fst矩阵进行了多维尺度分析。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测小黄鱼群体结构的选择性分子标记及其引物与检测方法，其序列如SEQIDNO.1所示。引物序列为H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA，H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。检测方法包括如下步骤基因组DNA的提取、PCR扩增反应及测序、中性检测和群体结构分析。本发明的选择性分子标记能检测出小黄鱼的群体结构。
文档编号C12Q1/68GK102758024SQ201210278859
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者林浩然, 王乐, 蒙子宁 申请人:中山大学