专利名称：一种具有重要药物代谢活性的猪醛氧化酶(SsAOX1)的编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种猪醛氧化酶基因及其制备方法和应用。
背景技术：
猪是国内养殖量与消费量最大的畜类动物代表，在蓄养和繁殖过程中，给猪口服各种饲料添加剂已成为养殖业中提高肉质产量的一个重要手段，但各种饲料添加剂可能会由于代谢不完全，而在猪体内残留不完全代谢物并进一步在体内富集累积。肝脏作为最大的代谢器官，存在着丰富的药物代谢酶系。从肝脏中分离纯化或通过基因工程手段重组表达关键代谢酶并研究其药物代谢能力，是研究猪体内药物的代谢途径和相关代谢酶的重要方法。醒氧化酶(aldehyde oxidase, A0)是一类具有催化醒类氧化成相应的羧酸并释放出活性氧功能的催化酶，它属于钥_黄素酶(molybdo-flavoenzyme, MFE)家族，分类号为 EC I. 2. 3. I。醛氧化酶广泛存在于各动物物种，在动物体内又以肝脏为最丰富的分布场所。 醛氧化酶是新陈代谢不可缺少的酶类，它参与多种生理调节，可以将体内形成的有毒醛氧化为无毒酸，从而缓解醛类对机体的毒害作用；也参与细胞内电子传递，在与代谢和繁殖相关的生理活动中起着非常重要的作用。在动物体内，醛氧化酶参与代谢产物和外源化合物的氧化降解、视黄酸合成、药物代谢及肝脏中有毒化合物代谢，还与一些人类疾病的病理相关，其活性水平已成为医学上临床用药及治疗效果评估的一个重要参数。
随着分子生物学的快速发展，一些新的技术与方法也被用在醛氧化酶的研究上， 例如在小鼠中已成功借助基因敲出、定点突变和原核表达等分子生物学手段来研究醛氧化酶的生理作用和酶学功能。利用蛋白表达和纯化技术获得有活性的动物醛氧化酶，进而分析其酶学及生物学特性也是值得深入探索的研究途径。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供猪醛氧化酶I基因及其制备方法。
本发明的上述目的通过如下方案予以实现本发明提供一种猪醛氧化酶I基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: I。
本发明还提供一种所述醛氧化酶I基因所编码的具有生物活性的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
一种重组表达载体，包含所述猪醛氧化酶I基因。
—种包含所述重组表达载体的宿主系统。
一种催化组合剂，包含所述醛氧化酶I基因所编码的具有生物活性的蛋白。
所述催化组合剂在催化醛类氧化成相应羧酸中的应用。
一种所述猪醛氧化酶I基因的制备方法，以猪肝组织CDNA为模板进行PCR扩增， 设计的3对上、下游引物及相应序列分别为F1 SEQ ID NO 3 ； Rl SEQ ID NO 4 ；F2 SEQID NO 5 ； R2 SEQ ID NO 6 ；F3 SEQ ID NO 7 ；R3 SEQ ID NO :8。
所述PCR扩增反应的条件为98°C预变性2 min，然后98°C变性30 s，55°C退火15 s，68°C延伸30 S，共35个循环，最后68°C复延伸10 min，得如SEQ ID N0:1所示猪醛氧化酶I基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于通过PCR扩增得到一个猪醛氧化酶基因，并通过体外重组表达及纯化体系，获得该基因编码的具有生物活性的蛋白，能更加有效的了解醛氧化酶的生理作用和酶学功能，从而将其更好的应用于醛类和杂环类化合物的催化合成；另一方面可针对猪体内该蛋白质的特性，设计针对性的定向药物治疗相关疾病，具有极大的市场价值。
图I猪醛氧化酶I基因(SsAOXl)所编码的蛋白与同家族种其他物种的醛氧化酶和黄嘌呤氧化酶的功能性结构域的相似性比较。
图2猪醛氧化酶I基因(SsAOXI)序列已报道的脊椎动物醛氧化酶基因的系统进化树图3猪醛氧化酶I基因(SsAOXI)的全长PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳图。
图4猪醒氧化酶的重组表达与纯化SDS-PAGE电泳图。M: broad range protein marker, I:诱导前菌体样品总蛋白，2:诱导后菌体样品总蛋白，3:诱导后菌体样品上清组分蛋白，4:诱导后菌体样品沉淀组分蛋白，5: Ni2+亲和层析纯化后蛋白样品图5重组猪醛氧化酶代谢视黄醛的酶动力活性实验具体实施方式
本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例I克隆猪醛氧化酶I基因(SsAOXl)(I)猪肝脏总CDNA的分离提取I.取4飞月龄杜长白大三元杂交猪，颈部放血致死。
2.剪去肝脏，用滤纸吸干肝脏的水分，剪成小块分装在2 ml冻存管中，于液氮中保存。
3.从液氮罐中小心取出鸡和猪肝脏各三份，分别用玻璃匀浆器(O. 1% DEPC处理 24h后灭菌并烘干),加Iml预冷的TRIzol试剂(Sigma-Aldrich公司)冰上研磨充分。
4.转移液体至1.5ml去RNA酶的EP离心管中，加200 μ I三氯甲烷，振荡10秒， 室温放置2 3min。
5.以12000g离心力于4°C离心15min。将约500 μ I上清液转移至新的I. 5 mlEP管。
6.加500 μ I异丙醇,摇勻后于室温放置IOmin, 12000g, 4°C离心lOmin。
7.小心倒掉上清，加Iml 75%乙醇，漂洗沉淀I次，7500g, 4°C离心5min。
8.倒掉上清，室温风干后，加30 μ I DEPC处理的去离子水溶解沉淀，即得肝脏总 RNA原液，琼脂糖凝胶电泳鉴定，测定0D260值并计算浓度。
9.按下表配制模板RNA/弓I物混合液，全量6 μ I。
权利要求
1.猪醛氧化酶I基因，其特征在于所述猪醛氧化酶I基因的核苷酸序列为SEQID NOIo
2.一种如权利要求I所述醛氧化酶I基因所编码的具有生物活性的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氣基酸序列为SEQ ID NO :2。
3.—种重组表达载体，包含权利要求I所述的猪醛氧化酶I基因。
4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的宿主系统。
5.一种催化组合剂，包含如权利要求2所述具有生物活性的蛋白。
6.根据权利要求5所述催化组合剂，其特征在于所述催化组合剂在催化醛类氧化成相应羧酸中的应用。
7.—种如权利要求I所述猪醛氧化酶I基因的制备方法，其特征在于以猪肝组织cDNA为模板进行PCR扩增，设计的3对上、下游引物及相应序列分别为F1 SEQ ID NO :3 ；Rl SEQ ID NO 4 ；F2 SEQ ID NO :5 ； R2 SEQ ID NO :6 ；F3 SEQ ID NO :7 ；R3 SEQ ID NO :8。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于所述PCR扩增的反应的条件为98°C预变性2 min，然后98°C变性30 s，55°C退火15 s，68°C延伸30 S，共35个循环，最后68°C复延伸10 min，得如SEQ ID NO : I所示猪醛氧化酶I基因。
全文摘要
本发明提供了猪醛氧化酶1基因的核苷酸序列，以及利用猪醛氧化酶1基因构建的载体和由这些载体转染的宿主系统的应用。本发明还提供了一种制备猪醛氧化酶1基因的方法，并通过体外表达获得该基因编码的具有生物活性的蛋白，有利于研究醛氧化酶的生理作用和酶学功能，设计针对性的定向药物治疗相关疾病，具有极大的市场价值。
文档编号C12N15/53GK102925465SQ20121038594
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者邓诣群, 郑鸣, 唐先青, 母培强 申请人:华南农业大学