同时检测乙醛脱氢酶2和乙醇脱氢酶2基因突变的方法

专利名称：同时检测乙醛脱氢酶2和乙醇脱氢酶2基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)和乙醇脱氢酶2 (ADH2)基因突变的方法，以及用于该检测方法的核酸探针和试剂盒。
背景技术：
关于乙醇代谢的具有代表性的酶有ADH(Alcohol ehydrogenase,乙醇脱氢酶)和ALDH(Aldehyde dehydrogenase,乙醛脱氢酶)。其中，ADH将乙醇代谢为乙醛，ALDH将乙醛代谢为乙酸。ADH存在ADH1、ADH2、ADH3三种，与ADH2基因表现型相关的基因多态性中存在ADH2*1(WT)、ADH2*2、ADH2*3(非专利文献 I)。日本人中的频率为 *1/*1 8. 4%, *1/*2 34. 9%，*2/*2 56. 7%，几乎不存在*3 (非专利文献2)。 与ALDH2基因表现型相关的基因多态性中的*1(WT)、*2(非专利文献I)在日本人中的频率为 *1/*1 52. 8%，*1/*2 40. 9%, *2/*2 6. 3% (非专利文献 2)。已经报告了这些基因多态性中，ADH2*2和ALDH2与酒精依赖症、肝病、胰腺癌等相关(非专利文献I，3)。而且，关于CYP2E1，也有报告了其具有和ADH2以及ALDH2相同的功能(非专利文献I)。专利文献I记载了用于通过杂交法检测与乙醇代谢能力以及耐受性相关的基因(ALDH2、ADH2和CYP2E1基因)突变的引物组和探针组。但是，存在以下问题(I)对于与乙醇代谢等相关的突变的每I突变都需要一个反应体系(I试管)，需要人力、费用和时间；
(2)必须使用从唾液、全血精制的DNA，需要人力、费用和时间，不能简易地进行测定；(3)由于进行微阵列(microarray)时需要处理扩增产物，因此存在扩增产物混入其他样品的危险;等等。另一方面，已知如下方法对含有突变的区域进行PCR扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，根据熔解曲线分析的结果来分析突变的方法(专利文献2、3)。但是，这些文献中，关于探针的设计，仅给出了这样的启示将探针设计为当末端部用荧光染料标记了的淬灭探针与目标核酸发生了杂交时，末端部分中探针-核酸杂交体的多个碱基对形成至少一个为G和C对。另外，这些方法存在实施时无法对于全部的任意序列实施的问题。现有技术文献专利文献专利文献I :日本专利特开2008-79604号公报专利文献2 :日本专利特开2001-286300号公报专利文献3 :日本专利特开2002-119291号公报非专利文献非专利文献I :Hepatrogy Volume 23, Issue 2, pages 234-239, February 1996,F Tanaka 等.非专利文献2 :第15届血压管理研究会演讲题目3工夕7 — >代謝酵素^飲酒七血压i ^関連&修飾+ 3力、？(乙醇代谢酶是否修饰饮酒和血压的关系？)斋藤京子等(http://www. healthcare, omron. co. jp/medical/study/pdf/pastl5_03. pdf)非专利文献3 :上原纪念生命科学财团研究报告书，23 (2009)，脾臟力5 k摧患V ^ 関+ 3遺伝的背景i飲酒習慣Q影響f評価+石分子疫学研究(评价与罹患胰腺癌
风险有关的遗传背景和饮酒习惯的影响的分子免疫学研究)，松尾惠太郎等(http://ueharazaidan.yoshidap.net/houkokushu/Vol. 23/pdf/046_report.pdf)

发明内容
发明要解决的问题本发明的技术问题在于，确定一种对于检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因多态性rs671和乙醇脱氢酶2 (ADH2)的基因多态性rs 1229984有效的探针，提供一种同时检测这些基因多态性的方法、以及用于此目的的试剂盒。解决问题的手段本发明人发现基于含有乙醛脱氢酶2 (ALDH2)的基因多态性rs671和乙醇脱氢酶2(ADH2)的基因多态性rsl229984的特定区域而设计探针，并通过使用该探针进行熔解曲线分析，能够检测出对应突变，从而完成了本发明。S卩，本发明如下所述。(I) 一种多态性检测用探针，其为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的至少一种基因多态性的探针，其特征在于，所述探针由选自下述(Pl)至(P3’ )中至少一种荧光标记的寡核苷酸构成(Pl)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与第241位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的序列，并且与第241位对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸具有序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列或与其同源的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2’)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P3)寡核苷酸具有序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50喊基长的喊基序列或者与其同源的序列，并且与第212位的喊基对应的喊基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P3’ )寡核苷酸具有与序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第212位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。(2)如⑴所述的多态性检测用探针，其中，(Pl)和(P1’)寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第241位的碱基对应的碱基；(P2)和(P2’)寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第261位的碱基对应的碱基；(P3)和(P3’)寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第212位的碱基对应的碱基。(3)如⑴所述的多态性检测用探针，其中，(Pl)和(P1’)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第241位的碱基对应 的喊基；(P2)和(P2’)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第261位的碱基对应的喊基；(P3)和(P3’)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第212位的碱基对应的喊基。(4)如(I) (3)中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述寡核苷酸在未与目标序列杂交时发出荧光，且在与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。(5)如(4)所述的多态性检测用探针，其中，所述寡核苷酸在与目标序列杂交时荧光强度减少。(6)如⑴ (5)中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的碱基长度为12 30。(7)如⑴ (5)中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的碱基长度为15 30。(8)如⑴ (5)中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(Pl)至(P3’ )寡核苷酸的碱基长度为18 30。(9)如⑴ ⑶中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述探针为用于熔解曲线分析的探针。(10)用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的至少一种多态性的方法，其特征在于，使用(I) (9)中任意一项所述的多态性检测用探针中的至少一种。(11)如(10)所述的多态性检测方法，其特征在于，包括(I)使(I) (9)任意一项所述的多态性检测用探针与试样中的单链核酸接触，使所述荧光标记寡核苷酸与所述单链核酸杂交，来获得杂交体形成体；(II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，将所述杂交体形成体解离，测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动；(III)基于所述信号的变动来确定杂交体形成体的解离温度、即Tm值；以及(IV)基于所述Tm值，确定选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的一种以上的多态性的存在或具有多态性的核酸的丰度比。
(12)如(11)所述的多态性检测方法，还包括在所述步骤⑴之前或与步骤⑴同时扩增核酸。(13) —种方法，包括通过(10) (12)中任意一项所述的多态性检测方法，来检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的一种以上的多态性的步骤；以及基于多态性的有无，来评价对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的步骤。(14) 一种多态性检测用试剂盒，其用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性，所述试剂盒包含权利要求I 9中任意一项所述的多态性检测用探针。 (15)如(14)所述的多态性检测用试剂盒，还包含能够以序列编号I或2所示的碱基序列中含有与所述(Pl)、(PI’)、(P2)或(P2’)寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物，以及能够以序列编号13所示的碱基序列中含有与所述(P3)或(P3’)寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。(16) 一种方法，其特征在于，使用多态性检测用引物和⑴ (9)中任意一项所述的探针，其中，所述多态性检测用引物为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性的引物，所述引物的特征在于包括(P4)、(P5)和/或(P6)、(P7)寡核苷酸，(P4)寡核苷酸具有序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第89 109位的喊基的喊基长度为21 60喊基长的喊基序列；(P5)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第388 407位的碱基的碱基长度为20 60碱基长的碱基序列互补的序列；(P6)寡核苷酸具有序列编号13所示的碱基序列中的、含有第93 138位的碱基的喊基长度为46 60喊基长的喊基序列；(P7)寡核苷酸具有与序列编号13所示的碱基序列中的、含有第214 238位的碱基的碱基长度为25 60碱基长的碱基序列互补的序列。(17)评价针对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的方法，包括通过(16)所述的方法，检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性的步骤，以及基于多态性的有无，评价针对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的步骤。(18) 一种试剂盒，其用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性，其特征在于，所述试剂盒包含(I) (9)中任意一项所述的探针、以及含有(16)所述的(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸的引物。发明效果通过本发明的探针能够同时并且明确地检测出乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因多态性rs671和乙醇脱氢酶2(ADH2)的基因多态性rsl229984。由于临床上也需要确认ALDH2和ADH2的基因突变，因此能够同时检测两种突变大有意义。通过添加本发明的探针来进行熔解曲线分析(Tm分析)，就能够同时检测ALDH2和ADH2的基因多态性。通过使用本发明的方法，即使在进行PCR扩增的情况下，也由于无需提取扩增产物，因此几乎没有污染的危险性。此外，本发明的方法，操作简单，容易自动化操作。在本发明的检测方法中，可以将未精制的唾液、全血中原本含有的核酸作为模板使用。


图I :示出实施例I中的Tm分析中每单位时间的TAMRA荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度CC )关系。其中，探针使用3T-ALDH2*2-wt-Rl-21，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突变型)，荧光染料使用了 TAMRA。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(°C)。下面各图中，示出以不同的模板和荧光染料的组合进行相同试验的结果。图2 :实施例I中的探针使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，模板使用了 ALDH2*1R50 (野生型)和ALDH2*2R50 (突变型)，荧光染料使用了 TAMRA。图3 :实施例I中的探针使用了 3T-ALDH2*2_wt-R3-20，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突变型)，荧光染料使用了 TAMRA。图4 :比较例I中的探针使用了 5T-ALDH2*2-wt-R2_19，模板使用了ALDH2*1F50 (野生型)和ALDH2*2F50 (突变型)，荧光染料使用了 TAMRA。图5A :实施例2中的探针使用了 3FL-ADH2-WT-F3，模板使用了 ADH2*1_R50 (野生型)和ALDH2*2-R50 (突变型)，荧光染料使用了 BODIPY FL0图5B :为放大了图5A的荧光强度的变化量的比例的图。图6A 比较例2中的探针使用了 3FL-ADH2-mt-Fl，模板使用了 ADH2*1_R50 (野生型)和ADH2*2-R50 (突变型)，荧光染料使用BODIPY FL0图6B :为放大了图6A的荧光强度的变化量的比例的图。图7A 比较例2中的探针使用了 3FL-ADH2-mt-F2，模板使用了 ADH2*1_R51 (野生型)和ADH2*2-R51 (突变型)，荧光染料使用了 BODIPY FL0图7B :为放大了图7A的荧光强度的变化量的比例的图。图8A :实施例3中的探针使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，模板使用了口腔拭子，荧光染料使用了 TAMRA图8B 实施例3中的探针使用了 3FL-ADH2-WT-F3，模板使用了口腔拭子，荧光染料使用了 BODIPY FL0图9A :实施例3中的探针使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，试样使用了全血，荧光染料使用TAMRA。图9B :实施例3中的探针使用了 3T-ADH2-WT-F3，试样使用了全血，荧光染料使用了 BODIPY FL0图IOA :实施例3中的探针使用了 3T-ALDH2*2-mt-Fl-21，试样使用了精制DNA，荧光染料使用了 TAMRA。图IOB :实施例3中的探针使用3T-ADH2-WT-F3，试样使用了精制DNA，荧光染料使用了 BODIPY FL0
具体实施例方式〈1>本发明探针和本发明检测方法本发明探针为多态性检测用探针，其为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的至少一种基因多态性的探针，其特征在于，所述探针包括选自下述(Pl)至(P3’ )的至少一种荧光标记的寡核苷酸(Pl)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与第241位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的序列，并且与第241位对应的 碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸具有序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列或与其同源的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P2’)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P3)寡核苷酸具有序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50喊基长的喊基序列或者与其同源的序列，并且与第212位的喊基对应的喊基为胞嘧啶并用荧光染料标记；(P3’ )寡核苷酸具有与序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第212位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。其中，ALDH2的基因多态性rs671为序列编号1、2的第251位的碱基。此外，ADH2的基因多态性rsl229984为序列编号13、14的第201位的碱基，它们的rs号是国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的 dbSNP 数据库(//www. ncbi. nlm. nih. gov/pro jects/SNP/)的登录号石马。本发明的探针除了具有序列编号I所示的碱基序列(含有ALDH2基因野生型碱基的序列)或序列编号2所示的碱基序列(含有ALDH2基因突变型(多态性)碱基的序列)中由上述确定的序列、具有序列编号13所不的喊基序列(含有ADH2基因野生型喊基的序列)中由上述所确定的序列以外，可以采取与专利文献2、3记载的同样的方法制作。本发明中的“同源的序列”是指在特定的碱基序列中，具有与碱基序列的互补链具有例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性的序列的碱基序列。在本申请中，也可以具有100%的同一性。本申请中的杂交可以根据公知的方法或者以其为标准的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等进行。该文献经此引用并入本申请说明书。本申请所谓“严谨条件”意指形成特异的杂交体，而不形成非特异的杂交体的条件。典型的“严谨条件”例如可以举出，钾离子浓度为约25mM 约50mM以及镁离子的浓度为约I. OmM 约5. OmM中进行杂交的条件。本发明的条件的一个示例可以举出Tris-HCl (pH8. 6)、25mM KCl以及I. 5mM MgCl2中进行杂交的条件。但是，本发明不限于此。此外，严谨条件记载在Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring HarborLab. Press, 2001)中。此文献经此引用并入本申请的说明书。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，容易对于这些条件做出选择。作为上述荧光标记寡核苷酸中的荧光标记寡核苷酸，除了寡核苷酸之外，也包含经修饰的寡核苷酸。所述寡核苷酸的构成单位例如可以举出核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、人工核酸等。所述人工核酸例如可以举出DNA、RNA、作为RNA类似物的LNA(锁核酸)；作为肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid);作为交联核酸的BNA(桥联核酸)等。所述寡核苷酸可以由所述构成单位中的一种构成，也可以由多种构成。
本发明的(Pl)和(P1’)探针表示如下序列与含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列互补的序列，与序列编号I或2互补的序列具有同源性的序列。即，本发明的(Pl)和(Pr )探针与含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列互补，但是，可以不完全互补。另外，与第241位对应的碱基为胞嘧啶并被荧光标记。本发明的(P2)和(P2’)探针表示如下序列含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列，相对于序列编号I或2具有同源性的序列。S卩，本发明的(P2)和(P2’)探针与第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列同源，但是，可以不完全相同。另外，与第261位对应的碱基为胞嘧啶并被荧光标记。本发明的(P3)和(P3’)探针表示如下序列含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列，相对于序列编号13具有同源性的序列。S卩，本发明的(P3)和(P3’)探针与含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列同源，但是，可以不完全相同。另外，与第212位对应的碱基为胞嘧啶并被荧光标记。本发明的探针长度，(Pl)至(P3’)都可以为11 50碱基长、12 30碱基长、15 30喊基长、18 30喊基长。本发明中所用的用于检测ALDH2的基因多态性rs671的探针的碱基序列可以为5，-gttttcacttCagtgtatgcc-3’ (序列编号 3)，5，-ggcatacactAaagtgaaaac-3，(序列编号
4),5’ -ttttcacttTagtgtatgcc-3’(序列编号5)。其中，大写字母所示碱基为突变位点。作为本发明所用的用于检测ADH2的基因多态性rsl229984的探针的碱基序列的示例，可以举出5’ -TCTGTCNCACGGATGACC-3’ (序列编号15)。序列中，“N”代表a、t、g或Co 更优选为 5’ -TCTGTCGCACGGATGACC-3’(序列编号 16)。作为荧光染料，可以使用专利文献2、3记载的荧光染料。具体示例可以为PacificBlue (商标)、FAM(商标)、TAMRA(商标)、B0DIPY FL(商标)等。可以按照常用的方法(例如专利文献2、3记载的方法)将荧光染料结合至寡核苷酸。本发明的探针例如为未与目标序列杂交时荧光染料发出荧光，与目标序列杂交时荧光染料的荧光减少或增加的探针。例如为未杂交时荧光染料发出荧光，杂交时，荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。此外，本发明的探针例如为从3 ’末端起数第I 3位的碱基用荧光染料进行标记，或者3’末端用荧光染料进行标记。而且，本发明的探针中用荧光染料标记的碱基，为序列编号I或2中的第241位的碱基或第261位的碱基。此外，在序列编号13或14中被标记的碱基为第212位的碱基。本发明的检测方法的特征在于，使用本发明的探针，并包括以下步骤(I)使本发明的多态性检测用探针与试样中的单链核酸接触，使所述荧光标记寡核苷酸与所述单链核酸发生杂交，获得杂交体形成体；(II)通过改变含有上述杂交体试样的温度，使上述杂交体解离，测定基于上述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动；(III)根据上述信号的变化，确定杂交体形成体的解离温度、即Tm值；以及(IV)根据上述Tm值，确定选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多 态性rsl229984的组中至少一种以上的多态性的存在或具有多态性的核酸的丰度比。本发明的检测方法，除使用本发明的探针外，可以采用常用的核酸扩增以及熔解曲线分析(Tm分析)的方法进行。而且，本发明的检测方法也可以包括在进行上述步骤(I)之前或进行步骤(I)的同时，扩增核酸。作为核酸的扩增方法，优选为使用聚合酶的方法，例如PCR、ICAN、LAMP等。通过使用聚合酶的方法进行扩增时，优选在本发明探针存在下进行扩增。根据所用探针，对扩增的反应条件进行调整，对本领域技术人员来说是容易的。由此，由于通过在核酸扩增后对探针的Tm值进行分析，因此反应结束后无须精制扩增产物。这样就不必担心扩增产物带来的污染。而且，在与扩增所需的仪器相同的容器内进行检测，无须移动容器。这样，容易实现自动化。本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。上述DNA为双链时，例如优选包括在进行杂交步骤之前，通过加热使上述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离为单链DNA，在接下来的杂交步骤中，能够与检测用探针发生杂交。本发明中，本发明所用探针相对于上述试样DNA的添加比例(摩尔比)无特别限制，但是从充分确保检测信号的观点来说，例如相对于试样中DNA的I倍以下或者为0. I倍以下。此时，试样中的DNA，可以为产生了检测目标多态性的检测对象DNA和未产生上述多态性的非检测对象DNA的合计，也可以为含有产生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未产生上述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样DNA中上述检测对象DNA的比例，一般是未知的。但是，在结果上，上述探针相对于检测对象DNA(含有检测对象序列的扩增产物)的添加比例(摩尔比)，例如为10倍以下，或者为5倍以下，或者为3倍以下。另外，对于其下限无特别限制，可以为0. 001倍以上、0. 01倍以上或者0. I倍以上。本发明的探针相对于上述DNA的添加比例，可以为相对于双链DNA的摩尔比，也可以为相对于单链DNA的摩尔比。对Tm值进行说明。当对含有双链核酸的溶液进行加热时，260nm处的吸光度会升高。这是由于，加热使双链DNA的两链之间的氢键发生断裂，解离为单链DNA(DNA的熔解)的缘故。并且当全部的双链DNA解离为单链DNA时，其吸光度值显示加热开始时的吸光度值(仅有双链DNA的吸光度)的大约I. 5倍，基于此判断熔解完全。根据这一现象，通常将熔解温度Tm值一般定义为吸光度达到吸光度上升总量的50%时的温度。在本发明中，可以基于前面所述的原理测定260nm的吸光度来进行伴随温度变化信号的变化的测定，以确定Tm值。优选测定如下信号所述信号是基于添加于本发明的探针的标记的信号的信号、并且根据DNA与探针的杂交体形成的状态而变动。因此，作为本发明的探针优选使用前述的标记探针。上述标记探针例如可以为未与目标序列发生杂交时发出荧光，且与目标序列杂交时荧光强度减弱(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针；或未与目标序列杂交时发出荧光，而与目标序列杂交时，荧光强度增加的荧光标记的寡核苷酸探针；前者那样的探针与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时，不显示信号或信号弱，通过加热探针游离时即出现检测信号或信号增加。另外，后者所述的探针与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时显示信号，而通过加热探针游离时信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测基于这种标记的信号变化，能够与前述进行260nm的吸光度测定一样，进行熔解和测定Tm值。用于标记探针的标记物质，可以为如前所述，优选荧光染料标记探针。核酸扩增时的模板核酸，含有核酸即可，无特别限制，其可以为血液、口腔粘膜混悬液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液，石蜡包埋组织、胃液、胃洗液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意来源或可来源于生物的试样。可以将来自上述来源的模板核酸直接，或为了改变该试样特性而在预处理后进行使用。 下面以应用PCR的情况为例，进一步进行说明。PCR所用的引物对，能够扩增与本发明探针发生杂交的区域，而且可以与常用PCR引物对的设计方法对引物对同样地进行设定。引物的长度以及Tm值，一般为，12mer 40mer、40 70°C,或者为16mer 30mer、55 60°C。引物对中各引物的长度可以不相同，但是优选为，两个引物的Tm值基本相同(一般相差在2°C内)。而且,Tm值可以是通过最邻近碱基对法(Nearest Neighbor)计算得出的值。作为引物对的一个示例，可以举出由含有序列编号7、8、19、20所示碱基序列的引物组成的引物。PCR可以在本发明所用的探针的存在下进行。这样，在扩增反应结束后，无须精制扩增产物，即可进行Tm值分析。根据所用的探针，本领域技术人员容易对引物的Tm值、PCR的反应条件(试剂组成、循环数)做出调整。除测定本发明探针的荧光染料的荧光以外，可以按照常用的方法进行Tm分析。能够应用与荧光染料对应波长的激发光来测定发光波长的光。Tm分析中的升温速度，一般为0. I 1°C /秒。进行Tm分析时的反应液的组成只要能够使探针和含有与探针碱基序列互补的序列的核酸发生杂交即可，无特别限制，一般为，一价阳离子浓度为I. 5 5mM、pH为7 9。由于使用PCR等的DNA聚合酶的扩增方法的反应液一般情况下都满足这一条件，所以，扩增后的反应液可以直接用于Tm分析。根据上述Tm分析的结果，对ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的检测，可以按照常规方法进行，本发明的检测包括有无突变的检测和确定含有多态性的核酸的丰度比。而且，通过本发明的探针和多态性检测方法，能够检测出ALDH2基因和ADH2基因的多态性，根据检测多态性的有无，能够预测对乙醛和乙醇的分解能力。具体地，存在如下启示，若ALDH2的基因多态性rs671的碱基为G/G即为野生型，判定为对乙醛的分解能力高，但是，若是杂合型G/A、突变型的碱基的纯合型A/A，则对于乙醛的分解能力低；此外，若ADH2的基因多态性rsl229984的碱基为G/G即为野生型，判定为对乙醇的分解能力低，但是，若是杂合型G/A、纯合型的A/A，则对于乙醇的分解能力高。根据对乙醛和乙醇的分解能力的预测结果，能够预测对乙醇的耐受性、酒精依赖症、肝病、胰腺癌等与乙醇代谢的相关疾病。此外，根据本发明的方法，能够同时检测出乙醛脱氢酶2 (ALDH2)的基因多态性rs671和乙醇脱氢酶2 (ADH2)的基因多态性rsl229984，例如，当ALDH2基因和ADH2基因都存在突变时，给出了对乙醇的耐受性更低的启示。〈1>本发明的引物本发明的引物是在本发 明的检测方法中与本发明的探针一起使用的引物。具体地，本发明的引物为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中至少一种基因多态性的引物，其特征在于含有下述(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸。(P4)寡核苷酸，其为序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第89 109位的喊基的喊基长度为21 60喊基长的喊基序列。(P5)寡核苷酸，其为与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第388 407位的碱基的碱基长度为20 60碱基长的碱基序列互补的序列。(P6)寡核苷酸，其为序列编号13或14所示的碱基序列中的、含有第93 138位的喊基的喊基长度为46 60喊基长的喊基序列。(P7)寡核苷酸，其为与序列编号13或14所示的碱基序列中的、含有第214 238位的碱基的碱基长度为25 60碱基长的碱基序列互补的序列。本发明的(P4) (P7)引物可以与上述序列不完全相同，也可以是仅有5个碱基、4个碱基、3个碱基、2个碱基或I个碱基不同。本发明中所用的引物为例如为序列编号7、8、19、20所示的引物。<3>本发明的试剂盒本发明的试剂盒为用于本发明检测方法的试剂盒。该试剂盒的特征在于其包含本发明的多态性检测用探针。而且，本发明的试剂盒可以用于判断针对乙醇的代谢能力和耐受性。本发明检测试剂盒，除包含探针外，还可以包含本发明检测方法中进行核酸扩增所必需的试剂，特别是还可以含有用于使用DNA聚合酶进行扩增的上述引物。在本发明的检测试剂盒中，探针、引物以及其他试剂，可以分别容纳，也可将它们的一部分制成混合物。下面，通过实施例来对本发明进行具体说明。但是，这些实施例为本发明的示例，本发明不限于此。在本发明中，作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或引物的各个序列，以它们相互互补的关系为基础而描述的事项，只要不特别指出，可以适用于每一序列以及与各个序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的对应序列时，在本领域技术人员的技术常识的范围内，由该互补的序列识别的序列视为将说明书整体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。实施例实施例I (以ALDH2的模板寡核苷酸为检测对象，使用单一探针的情况)以含有ALDH2的基因多态性rs671位点的碱基序列(序列编号I (野生型))为基础，设计出如表I所示的3’末端部含有C的探针(与野生型(序列编号3、5)以及突变型(序列编号4)对应)以及5’末端部含有C的探针(与野生型(序列编号6)对应)。表I中，探针的位置对于野生型而言，表示序列编号I所示的碱基序列中的碱基编号，对于突变型而言，表示序列编号2的所示的碱基序列中的碱基编号。3’末端的P表示磷酸化。按照常用方法通过TAMRA进行标记。此外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(野生型正义链(序列编号9)、野生型反义链(序列编号11)、突变型正义链(序列编号10)、野生型反义链(序列编号12))的序列不于表I。表I中，寡核苷酸的位置表不序列编号2所不的碱基序列中的碱基序号。表I
权利要求
1.一种多态性检测用探针，其为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的至少一种基因多态性的探针，其特征在于，所述探针由选自下述(Pl)至(P3’ )的至少一种荧光标记的寡核苷酸构成 (PD寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与第241位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (ΡΓ)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第241 251位的碱基的11 50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的序列，并且与第241位对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P2)寡核苷酸具有序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列或与其同源的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P2’)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第251 261位的碱基的11 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第261位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P3)寡核苷酸具有序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列或者与其同源的序列，并且与第212位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记； (P3’ )寡核苷酸具有与序列编号13所示的碱基序列中的、含有第201 212位的碱基的12 50碱基长的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的序列，并且与第212位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。
2.如权利要求I所述的多态性检测用探针，其中， (PD和(ΡΓ )寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第241位的碱基对应的碱基； (P2)和(P2’)寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第261位的碱基对应的碱基； (P3)和(P3’)寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的与第212位的碱基对应的碱基。
3.如权利要求I所述的多态性检测用探针，其中， (PD和(ΡΓ)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第241位的碱基对应的碱基; (P2)和(P2’)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第261位的碱基对应的碱基; (P3)和(P3’)寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的与第212位的碱基对应的碱基。
4.如权利要求I 3中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述寡核苷酸在未与目标序列杂交时发出荧光，且在与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。
5.如权利要求4所述的多态性检测用探针，其中，所述寡核苷酸在与目标序列杂交时荧光强度减少。
6.如权利要求I 5中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的碱基长度为12 30。
7.如权利要求I 5中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的碱基长度为15 30。
8.如权利要求I 5中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，(PD至(P3’)寡核苷酸的碱基长度为18 30。
9.如权利要求I 8中任意一项所述的多态性检测用探针，其中，所述探针为用于熔解曲线分析的探针。
10.用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的至少一种多态性的方法，其特征在于，使用权利要求I 9中任意一项所述的多态性检测用探针中的至少一种。
11.如权利要求10所述的多态性检测方法，其特征在于，包括 (I)使权利要求I 9中任意一项所述的多态性检测用探针与试样中的单链核酸接触，使所述荧光标记寡核苷酸与所述单链核酸杂交，来获得杂交体形成体； (II)通过改变含有所述杂交体形成体的试样的温度，将所述杂交体形成体解离，测定基于所述杂交体形成体的解离的荧光信号的变动； (III)基于所述信号的变动来确定杂交体形成体的解离温度、即Tm值；以及 (IV)基于所述Tm值，确定选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的一种以上的多态性的存在或具有多态性的核酸的丰度比。
12.如权利要求11所述的多态性检测方法，还包括在所述步骤(I)之前或与步骤(I)同时扩增核酸。
13.—种方法,包括 通过权利要求10 12中任意一项所述的多态性检测方法，来检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组的一种以上的多态性的步骤；以及 基于多态性的有无，来评价对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的步骤。
14.一种多态性检测用试剂盒，其用于检测选自包括ALDH2基因多态性和ADH2的基因多态性的组中的一种以上的多态性,所述试剂盒包含权利要求I 9中任意一项所述的多态性检测用探针。
15.如权利要求14所述的多态性检测用试剂盒，还包含 能够以序列编号I或2所示的碱基序列中含有与所述(Pl)、(ΡΓ )、(P2)或(P2’ )寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物，以及 能够以序列编号13所示的碱基序列中含有与所述(P3)或(P3’)寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
16.一种方法，其特征在于，使用多态性检测用引物和权利要求I 9中任意一项所述的探针，其中，所述多态性检测用引物为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性的引物，所述引物的特征在于包括(P4)、(P5)和/或(P6)、(P7)寡核苷酸， (P4)寡核苷酸具有序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第89 109位的碱基的喊基长度为21 60喊基长的喊基序列；(P5)寡核苷酸具有与序列编号I或2所示的碱基序列中的、含有第388 407位的碱基的碱基长度为20 60碱基长的碱基序列互补的序列； (P6)寡核苷酸具有序列编号13所示的碱基序列中的、含有第93 138位的碱基的碱基长度为46 60碱基长的碱基序列； (P7)寡核苷酸具有与序列编号13所示的碱基序列中的、含有第214 238位的碱基的碱基长度为25 60碱基长的碱基序列互补的序列。
17.评价针对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的方法，包括 通过权利要求16所述的方法，检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性的步骤，以及 基于多态性的有无，评价针对乙醇的代谢能力和/或判定耐受性的步骤。
18.一种试剂盒，其用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rsl229984的组中的一种以上的多态性，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求I 9中任意一项所述的探针、以及含有权利要求16所述的(P4)和(P5)以及/或者(P6)和(P7)寡核苷酸的引物。
全文摘要
本发明涉及同时检测乙醛脱氢酶2和乙醇脱氢酶2基因突变的方法。具体地，本发明的课题在于，确定一种对于检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因多态性rs671和乙醇脱氢酶2(ADH2)的基因多态性rs1229984有效的探针，提供一种同时检测这些基因多态性的方法、以及用于此目的的试剂盒。为此，本发明提供了一种多态性检测用探针，其为用于检测选自包括ALDH2的基因多态性rs671和ADH2的基因多态性rs1229984的组中的至少一种基因多态性的探针，其特征在于，其由选自说明书中定义的(P1)至(P3’)中至少一种荧光标记的寡核苷酸构成。
文档编号C12Q1/68GK102758008SQ20121013686
公开日2012年10月31日 申请日期2012年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者井口亚希, 平井光春 申请人:爱科来株式会社