专利名称：一种白酒酿造微生物的高质量dna提取方法
技术领域：
本发明涉及白酒微生物群落生态技术领域，具体是一种用于白酒酿造微生物群落结构分析的高质量DNA提取方法。
背景技术：
中国白酒有着悠久的酿造历史，而且中国白酒的酿造工艺不尽相同，中国白酒的酿造生产以大曲作为微生物及酶的主要来源，在实际生产中，大曲质量的优劣关系到白酒的出酒率及酒的品质。在大曲的生产过程中伴随着一系列微生物此消彼长的驯化过程，大曲当中微生物的群落结构直接关系到大曲的生产质量。中国白酒主要以窖池及酒醅等作为生产基础，环境、大曲及窖泥当中的微生物进行着复杂的能量代谢和物质代谢，微生物复杂的代谢过程也是白酒风味前体物质的形成过程，研究不同工艺生产的大曲、同一大曲制曲过程及窖泥中微生物的群落差异及变迁，对于大曲及白酒的生产具有一定的指导意义。与本发明相关的技术有DNA提取方法和DNA提取试剂盒等，有如专利申请号为201210107413. O记载了一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，包括以下步骤
(I)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水，充分振荡，离心，弃去上清液;同法重复洗涤样品I次；(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡，离心，弃去上清液；同法重复洗涤样品I次；(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡洗涤样品，离心，弃去上清液；(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，_70°C冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于_20°C冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA。有如专利申请号为201010266385. 8记载了涉及一种研究大曲细菌群落结构多样性的方法，主要步骤如下1):直接提取大曲基因组DNA ;2):选择细菌通用引物，扩增细菌核糖体DNA中的特异性DNA片段；3) :DGGE电泳分离PCR产物；4):切胶回收DGGE指纹图谱中微生物对应的条带；5):重新PCR，将产物连接至T载体，蓝白斑筛选并进行阳性克隆验证；6):测序获得DGGE条带对应微生物的种属信息。有如专利申请号为201210107413. O记载了一种白酒大曲中微生物总DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前对白酒大曲进行前处理，前处理包括如下步骤取大曲，加入前处理液含O. 05-0. 2ff/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V%土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，其中大曲和前处理液的重量体积比为3-8 25，振摇；超声处理；静置后低速离心；取上清液，高速离心；去除上清液沉淀加入O. 05-0. 2ff/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液；打散后高速离心，去除上清液，得到样品。但是，现有的技术方法中存在以下缺陷(1)基因组DNA提取方法应用的范围较窄(仅仅是大曲或窖泥)，而普遍适用的方法鲜见；(2)前处理方法中加入了一定的絮凝物，但絮凝物对微生物群落中丰度较低的微生物的影响不可估量；同时，由于大曲及窖泥的微生态环境很复杂，有很多的干扰成分存在，获得的基因组总DNA的质量并不理想。因此，一种适用范围广泛、简单易行的能够从大曲、糟醅和窖泥中提取高质量DNA的有效且稳定的方法是迫切需要的
发明内容
本发明的目的是提供一种适用范围广泛、简单易行的能够从大曲、糟醅和窖泥中提取高质量DNA的有效且稳定的方法。其具体步骤如下
⑴样品预处理
称取一定量的大曲，加入 30mL PBS 缓冲液(O. 0557mol/L Na2HPO4,0. 0423mol/LNaH2PO4,pH8. O),润旋均勻，800r/min 离心 IOmin,取上清液,并 10000r/min 离心 IOmin 得固
态菌团。⑵DNA提取与检测
将上述固态菌团重悬于 500 μ L DNA 提取液(0. IM Tris-HCl, 0. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, ρΗ8· 0)中，加入 10 μ L 纤维素酶(75mg/mL)、蜗牛酶(50mg/mL)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保温 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴摇床lh,4500r/min离心IOmin,收集上清液;用等体积酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min离心lOmin，收集上清液；用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min离心lOmin，取上清液移至干净管中；加入0. 6倍体积预冷的异丙醇，_20°C下放置2h以上,4°C 13000r/min离心20min,去上清液；用预冷的无水乙醇洗漆沉淀2_3次,真空冷冻干燥。将 DNA 溶解于 IOOyL TE (IOmM Tris-HCl, I mM EDTA, pH8. 0)溶液中，保存于 _20°C冰箱，PCR-DGGE检测提取高质量DNA的有效性。本发明具有的优点是所用试剂均为常规试剂，成本低廉，适用范围广、操作简单、条件温和、提取的DNA纯度较高，无需对基因组DNA进行纯化即可进行后续PCR扩增及DGGE分析等优点。
图I为大曲、糟醅及窖泥微生物基因组DNA电泳图谱。泳道M为MarkeK λ DNA/HindIII);泳道1、2为大曲样品；泳道3、4分别为糟醅和窖泥样品。图2为大曲、糟醅和窖泥微生物细菌基因组DNA 16S rDNA V3区扩增电泳图谱。泳道M为Marker (D2000);泳道1、2为大曲样品；泳道3、4分别为糟醅和窖泥样品。图3为大曲、糟醅和窖泥真菌基因组DNA 18S rDNA扩增电泳图谱。泳道1、2为大曲样品；泳道3、4分别为糟醅和窖泥样品。图4为大曲、糟醅和窖泥细菌基因组DNA 16S rDNA V3区扩增产物DGGE图谱。泳道1、2为大曲样品；泳道3、4分别为糟醅和窖泥样品。图5为大曲、糟醅和窖泥真菌基因组DNA 18S rDNA扩增产物DGGE图谱。泳道I、2为大曲样品；泳道3、4分别为糟醅和窖泥样品。
具体实施例方式实施例四川某酒厂大曲、糟醅及窖泥微生物基因组总DNA的提取、PCR扩增及DGGE
⑴样品预处理
称取 5g 大曲，加入 30mL PBS 缓冲液(O. 0557moI/LNa2HPO4,0. 0423mol/LNaH2P04,pH8. O),润旋均勻，800r/min离心lOmin,取上清液,并10000r/min离心IOmin得固态菌团。⑵DNA提取与检测将上述固态菌团重悬于 500 μ L DNA 提取液(O. IM Tris-HCl, O. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, ρΗ8· O)中，加入 10 μ L 纤维素酶(75mg/ml)、蜗牛酶(50mg/ml)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保温 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴摇床lh,4500r/min离心IOmin,收集上清液;用等体积酌·:氯仿异戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min离心lOmin，收集上清液；用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min离心lOmin，取上清液移至干净管中；加入O. 6倍体积预冷的异丙醇，-20 °C下放置2h以上，4°C 13000r/min离心20min，去上清液；用预冷的无水乙醇洗涤沉淀2_3次，冷冻真空干燥。将 DNA 溶解于 IOOyL TE (IOmM Tris-HCl, I mM EDTA，ρΗ8· O)溶液中，保存于 _20°C冰箱，PCR-DGGE检测提取高质量DNA的有效性。
权利要求
1.一种用于白酒酿造微生物群落结构分析的高质量DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤⑴样品预处理称取一定量的大曲，加入 30mL PBS 缓冲液(O. 0557mol/L Na2HPO4,0. 0423mol/LNaH2PO4,pH8. O),润旋均勻，800r/min 离心 IOmin,取上清液,并 10000r/min 离心 IOmin 得固态菌团。⑵DNA提取与检测将上述固态菌团重悬于 500 μ L DNA 提取液(0. IM Tris-HCl, 0. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, pH8. 0)中，加入 10μ L 纤维素酶(75mg/mL)、蜗牛酶(50mg/mL)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保温 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴摇床lh,4500r/min离心IOmin,收集上清液;用等体积酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min离心lOmin，收集上清液；用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min离心lOmin，取上清液移至干净管中；加入0. 6倍体积预冷的异丙醇，-20 °C下放置2h以上，4°C 13000r/min离心20min，去上清液；用预冷的无水乙醇洗涤沉淀2_3次，真空冷冻干燥。将DNA溶解于100 μ L TE溶液中，保存于_20°C冰箱，PCR-DGGE检测提取高质量DNA的有效性。
2.根据权利要求I所述一种大曲及窖泥微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于所述步骤 2) TE 溶液为 IOmM Tris-HCl，I mM EDTA, pH8. O。
全文摘要
本发明涉及一种白酒酿造微生物高质量DNA提取方法。其特征在于⑴通过对样品进行简单前处理后获得菌体混合物；⑵向混合物中加入DNA提取液、各种酶液、SDS及蛋白酶K等使菌体中的DNA充分释放；⑶加入酚氯仿异戊醇及氯仿异戊醇抽提除去杂蛋白以纯化DNA；⑷异丙醇在低温下沉淀DNA，无水乙醇洗涤，获得高质量的微生物基因组总DNA。本发明具有的优点是所用试剂均为常规试剂，成本低廉，适用范围广、操作简单、条件温和、提取的DNA纯度较高，无需对基因组DNA进行纯化即可进行后续PCR扩增及DGGE分析等优点。
文档编号C12N15/10GK102911933SQ20121043521
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者周荣清, 张立强, 郑佳 申请人:四川大学