专利名称：一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌剂的制备方法，尤其涉及一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法。
背景技术：
随着工农业的发展，城市污泥、垃圾、畜禽粪便的产生量与日俱增，一些固体废物严重的危害生态环境及人类健康。但从资源利用的角度分析，这些固体废物以有机质为主，并含有一定量的氮、磷、钾、钙、镁、硫及各种微量元素等营养成分，经过处理可以成为很好的农业肥料。由于堆肥是一种生物学工艺过程，在堆肥过程的不同阶段对有机物的降解起关键作用的微生物种群不同，在工艺过程中所要控制的各种参数就是那些对微生物有影响的因素，因为它们决定微生物活动的程度，进而影响堆肥的速度与质量。然而，传统的自然 发酵由于所含土著微生物的种类和数量有限，以及发酵工艺条件的限制，存在着发酵周期长，发酵产品的肥效低，对环境造成二次污染等问题，限制了其大规模应用。目前堆肥接种的微生物大都属中温性的微生物菌剂，它们虽然能缩短堆肥启动发酵时间，但由于所接种的微生物将在高温期内迅速死亡，因此短暂高温期后便是降温期，堆肥腐熟时间依然较长，而且腐熟不彻底，难以达到人们预期的堆肥腐熟效果，如何在堆肥早期接入一种较佳的外源微生物促进快速升温，并迅速降低堆肥的PH值，缩短前期发酵的时间和进程，以促进底物中土著微生物的生长，从而提高纤维降解的效率，是目前堆肥发酵领域的新课题。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的堆肥发酵菌剂易导致所接种的微生物将在高温期内迅速死亡、堆肥腐熟时间较长、腐熟不彻底、难以达到人们预期的堆肥腐熟效果的缺点，提供了一种便利、有效的促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，该方法分别使用土著菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),经过如下培养步骤第一步骤通过土著菌的采集、扩大培养制得固体土著菌菌剂；第二步骤通过嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养、扩大培养、发酵罐中通气培养制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂；第三步骤将上述制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比
2-3 I的比例混合制成促腐堆肥复合发酵菌剂。所述土著菌的采集是取若干千克夹生大米饭装入干净木箱、盖上宣纸、密闭木箱端口、木箱部分埋入菜地，让周边的土著菌潜入到米饭中，最终在米饭上形成土著菌菌落；所述土著菌的扩大培养是将带土著菌菌落的米饭和红糖按照重量比2-3 I的比例混合均匀装入坛子封口放置直至成浓稠液体状态，再按照重量比I : I的比例掺入混合经过高温消毒的麸皮，发酵后风干处理；所述嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养所需的斜面培养基液的配方为8-12g蛋白胨、2-5g牛肉提取物、4-6g氯化钠、14-16g琼脂、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为8-12g蛋白胨、2-5g牛肉提取物、4-6g氯化钠、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌在发酵罐中通气培养即将扩大培养后嗜热脂肪芽孢杆菌以4% -6%(V/V)的接种量接种至装有培养基的发酵罐中，将培养好的嗜热脂肪芽孢杆菌液按照重量比I : I的比例将之接种到灭菌麸皮中，然后放回发酵罐中继续通气培养发酵36-48h后风干处理。根据上述步骤最终制成的促腐堆肥复合发酵菌剂在堆肥底物早期接入，可以快速提升堆体温度和降低堆体PH值，缩短堆体发酵的前期时间，增强底物微生物的活动，以最短的时间使堆肥进入高温阶段，通过嗜热菌的活动和堆垛内通氧，以实现速腐熟，从而提升堆肥品质。
作为优选，所述斜面培养基液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、15g琼脂、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、IL蒸馏水；作为优选，所述带土著菌菌落的米饭和红糖混合均匀装入坛子封口放置的温度为180C _22°C，放置时间为7-10天。作为优选，所述嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养的培养温度为40_50°C，培养时间16-24小时。作为优选，所述将嗜热脂肪芽孢杆菌从保藏的固体斜面培养基上接种至种子培养液中扩大培养的操作步骤为在IOOOml的三角瓶装入种子培养液200ml，在55°C下以旋转摇床设定转速160-240rpm，培养24-36小时，培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，菌数含量达到I X IO9个/ml以上。作为优选，所述旋转摇床设定转速200rpm，培养30小时。作为优选，所述发酵罐中通气培养的培养温度为55-65°C，搅拌转速为30-60rpm，通气量为O. 6-1. 2m3/h，培养时间为22-28小时。作为优选，所述培养温度为60°C，搅拌转速为45rpm，通气量为O. 9m3/h，培养时间为24小时。根据本发明的技术方案，采用土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌菌剂结合制备成复合菌剂，在堆肥中早期接入，能快速提升堆体温度和降低堆体PH值，缩短堆体发酵的前期时间，增强底物微生物的生长，从而提高纤维降解的效率，以最短的时间使堆肥进入高温阶段，通过嗜热菌的活动，以实现速腐熟，从而提升堆肥品质，提高堆肥生产效率。
图I为本发明的工艺流程示意图。
具体实施例方式下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述实施例I
如图I所示，一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，该方法分别使用土著菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),其中嗜热脂肪芽孢杆菌该菌种购自中普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1. 1866，经过如下培养步骤第一步骤通过土著菌的采集、扩大培养制得固体土著菌菌剂；第二步骤通过嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养、扩大培养、发酵罐中通气培养制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂；第三步骤将上述制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比2I的比例混合制成促腐堆肥复合发酵菌剂。所述土著菌的采集，即取I. 5kg的夹生大米饭装入干净的小木箱，夹生大米饭占据小木箱内部体积的三分之一，干净小木箱的长为30cm宽为20cm、高为IOcm,在夹生大米饭上盖上宣纸，密闭小木箱端口后，将小木箱体积的1/3部分埋入刚收获完蔬菜的菜地中， 让周边的土著菌潜入到米饭中，经过5天，在米饭上形成白色土著菌菌落及粉色土著菌菌落；所述土著菌的扩大培养，即取出上述带土著菌菌落的米饭，按照重量比2 I的比例掺入红糖，混合均匀后装入坛子、盖上宣纸，然后封口放置在温度18°C的地方，大约放置 天左右，待土著菌菌落的米饭与红糖的混合物成浓稠液体状态，再按照重量比I : I的比例掺入混合经过高温消毒的麸皮，在坛子中发酵48小时后风干处理，制得固体土著菌菌剂；所述嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养所需的斜面培养基液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、15g琼脂、IL蒸馏水，取嗜热脂肪芽孢杆菌菌种接入上述固体斜面培养基，培养温度为40°C，培养时间16小时；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、IL蒸馏水，将嗜热脂肪芽孢杆菌从保藏的固体斜面培养基上接种至上述种子培养液中扩大培养，具体操作步骤是在每IOOOml的三角瓶装入细菌培养液200ml，在55°C的温度的条件下，以旋转摇床设定转速160rpm、培养24小时，培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，菌数含量达到I X IO9个/ml以上；所述发酵罐中通气培养，即待嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养后，将液体菌种以4%(V/V)的接种量接种至装有培养基的容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度55°C，搅拌转速30rpm，通气量O. 6m3/h，培养时间22小时，将培养好的嗜热脂肪芽孢杆菌液按照重量比I : I的比例将之接种到灭菌麸皮中，然后放回发酵罐中继续通气培养发酵48h，最后进行风干处理，制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂。实施例2如图I所示，一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，该方法分别使用土著菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),经过如下培养步骤第一步骤通过土著菌的采集、扩大培养制得固体土著菌菌剂；第二步骤通过嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养、扩大培养、发酵罐中通气培养制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂；第三步骤将上述制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比3I的比例混合制成促腐堆肥复合发酵菌剂。
所述土著菌的采集，即取2. 5kg的夹生大米饭装入干净的小木箱，夹生大米饭占据小木箱内部体积的三分之一， 干净小木箱的长为30cm宽为20cm、高为IOcm,在夹生大米饭上盖上宣纸，密闭小木箱端口后，将小木箱体积的1/2部分埋入刚收获完蔬菜的菜地中，让周边的土著菌潜入到米饭中，经过8天，在米饭上形成白色土著菌菌落及粉色土著菌菌落；所述土著菌的扩大培养，即取出上述带土著菌菌落的米饭，按照重量比3 I的比例掺入红糖，混合均匀后装入坛子、盖上宣纸，然后封口放置在温度22°C的地方，大约放置10天左右，带土著菌菌落的米饭与红糖的混合物成浓稠液体状态，再按照重量比I : I的比例掺入混合经过高温消毒的麸皮，在坛子中发酵48小时后风干处理，制得固体土著菌菌剂；所述嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养所需的斜面培养基液的配方为12g蛋白胨、5g牛肉提取物、6g氯化钠、16g琼脂、IL蒸馏水，取嗜热脂肪芽孢杆菌菌种接入上述固体斜面培养基，培养温度为50°C，培养时间24小时；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、IL蒸馏水，将嗜热脂肪芽孢杆菌从保藏的固体斜面培养基上接种至上述种子培养液中扩大培养，具体操作步骤是在IOOOml的三角瓶装入细菌培养液200ml，于55°C的温度的条件下，以旋转摇床设定转速240rpm、培养36小时，培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，菌数含量达到I X IO9个/ml以上；所述发酵罐中通气培养，即待嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养后，将液体菌种以6%(V/V)的接种量接种至装有培养基的容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度65°C，搅拌转速60rpm，通气量I. 2m3/h,培养时间28小时，将培养好的嗜热脂肪芽孢杆菌液按照I : I的比例将之接种到灭菌麸皮中，然后放回发酵罐中继续通气培养发酵48h，最后进行风干处理，制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂。实施例3如图I所示，一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，该方法分别使用土著菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),经过如下培养步骤第一步骤通过土著菌的采集、扩大培养制得固体土著菌菌剂；第二步骤通过嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养、扩大培养、发酵罐中通气培养制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂；第三步骤将上述制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比2.5 I的比例混合制成促腐堆肥复合发酵菌剂。所述土著菌的采集，即取2kg的夹生大米饭装入干净的小木箱，夹生大米饭占据小木箱内部体积的三分之一，干净小木箱的长为35cm宽为25cm、高为12cm,在夹生大米饭上盖上宣纸，密闭小木箱端口后，将小木箱体积的1/2部分埋入刚收获完蔬菜的菜地中，让周边的土著菌潜入到米饭中，经过8天，在米饭上形成白色土著菌菌落及粉色土著菌菌落；所述土著菌的扩大培养，即取出上述带土著菌菌落的米饭，按照重量比2. 5 I的比例掺入红糖，混合均匀后装入坛子、盖上宣纸，然后封口放置在温度20°C的地方，大约放置8天左右，带土著菌菌落的米饭与红糖的混合物成浓稠液体状态，再按照重量比I : I的比例掺入混合灭菌麸皮，在坛子中发酵48小时后风干处理，制得固体土著菌菌剂，待用；
所述嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养所需的斜面培养基液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、15g琼脂、IL蒸馏水，取嗜热脂肪芽孢杆菌菌种接入上述固体斜面培养基，培养温度为45°C，培养时间20小时；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、IL蒸馏水，将嗜热脂肪芽孢杆菌从保藏的固体斜面培养基上接种至上述种子培养液中扩大培养，具体操作步骤是在IOOOml的三角瓶装入细菌培养液200ml，于55°C的温度的条件下，以旋转摇床设定转速200rpm、培养30小时，培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，菌数含量达到I X IO9个/ml以上；所述发酵罐中通气培养，即待嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养后，将液体菌种以5%(V/V)的接种量接种至装有培养基的容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度60°C，搅拌转速45rpm，通气量O. 9m3/h，培养时间24小时，将培养好的嗜热脂肪芽孢杆菌液按照I : I的比例将之接种到灭菌麸皮中，然后放回发酵罐中继续通气培养发酵48h，最后进行风干处理，制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂。·
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
权利要求
1.一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于该方法分别使用土著菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),该菌种购自中普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1. 1866，经过如下培养步骤 第一步骤通过土著菌的采集、扩大培养制得固体土著菌菌剂； 第二步骤通过嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养、扩大培养、发酵罐中通气培养制成嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂； 第三步骤将上述制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比2-3 I的比例混合制成促腐堆肥复合发酵菌剂。
所述土著菌的采集是取若干千克夹生大米饭装入干净木箱、盖上宣纸、密闭木箱端口、木箱部分埋入菜地，让周边的土著菌潜入到米饭中，最终在米饭上形成土著菌菌落；所述土著菌的扩大培养是将带土著菌菌落的米饭和红糖按照重量比2-3 I的比例混合均匀装入坛子封口放置直至成浓稠液体状态，再按照重量比I : I的比例掺入混合经过高温消毒的麸皮，发酵后风干处理； 所述嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养所需的斜面培养基液的配方为8-12g蛋白胨、2_5g牛肉提取物、4-6g氯化钠、14-16g琼脂、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为8-12g蛋白胨、2-5g牛肉提取物、4-6g氯化钠、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌在发酵罐中通气培养即将扩大培养后嗜热脂肪芽孢杆菌以4% -6% (V/V)的接种量接种至装有培养基的发酵罐中，将培养好的嗜热脂肪芽孢杆菌液按照重量比I I的比例将之接种到灭菌麸皮中，然后放回发酵罐中继续通气培养发酵36-48h后风干处理。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述斜面培养基液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、15g琼脂、IL蒸馏水；所述嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养所需的种子培养液的配方为IOg蛋白胨、3g牛肉提取物、5g氯化钠、IL蒸懼水。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述带土著菌菌落的米饭和红糖混合均匀装入坛子封口放置的温度为18°C _22°C，放置时间为7-10天。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述嗜热脂肪芽孢杆菌的固体斜面培养的培养温度为40-50°C，培养时间16-24小时。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述将嗜热脂肪芽孢杆菌从保藏的固体斜面培养基上接种至种子培养液中扩大培养的操作步骤为在IOOOml的三角瓶装入种子培养液200ml，在55°C下以旋转摇床设定转速160_240rpm，培养24-36小时，培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，菌数含量达到I X IO9个/ml以上。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述旋转摇床设定转速200rpm，培养30小时。
7.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述发酵罐中通气培养的培养温度为55-65°C，搅拌转速为30-60rpm，通气量为O. 6-1. 2m3/h，培养时间为22-28小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述培养温度为60°C，搅拌转速为45rpm，通气量为O. 9m3/h，培养时间为24小时。
全文摘要
本发明涉及一种微生物菌剂的制备方法，公开了一种促腐堆肥复合发酵菌剂的制备方法，包括土著菌采集、土著菌扩大培养、嗜热脂肪芽孢杆菌固体斜面培养、嗜热脂肪芽孢杆菌扩大培养、发酵罐中通气培养、将制得的固体土著菌菌剂和嗜热脂肪芽孢杆菌固体菌剂按重量比2-3∶1的比例混合配成复合促腐堆肥发酵菌剂。根据上述步骤最终制成的促腐堆肥复合发酵菌剂在堆肥底物早期接入，可以快速提升堆体温度和降低堆体PH值，缩短堆体发酵的前期时间，增强底物微生物的活动，以最短的时间使堆肥进入高温阶段，通过嗜热菌的活动和堆垛内通氧，以实现速腐熟，从而提升堆肥品质。
文档编号C12N1/20GK102943059SQ201210475310
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者刘金荣, 谢晓蓉, 杨铁顺, 杨有俊, 张旭, 李春杰, 刘照辉, 刘译谐, 孙煜 申请人:兰州大学