专利名称：家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的应用，还涉及含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的重组载体和制备方法。
背景技术：
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一，为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害的时候，通常会对蚕丝业造成巨大的损 失。据统计，我国养蚕的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占蚕病总损失的70-80%ο其中家蚕核型多角体病毒病是三大病毒病中最常见、危害最为严重的一种，该病传染性强，难以控制。引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒iBombyx mori NuclearPolyhedrosis Virus, BmNPV)。BmNPV属于杆状病毒科,真杆状病毒亚科,核型多角体病毒属，病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp。病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus, ODV)两种形态存在,而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境、消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液。BmNPV主要通过经口食下感染家蚕，当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(PH9. 2^9. 4)作用下，多角体被溶解，释放的病毒粒子ODV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection),在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害严重，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之主要通过传统的方法进行遗传筛选，周期长而且定向性差，所以收效甚微。转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。2007年，印度学者报道通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在病毒入侵后抑制病毒的复制增殖，不能在病毒侵染的其他阶段发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在BmNPV病毒侵染的多个阶段发挥抑制作用的转基因品系是一个制备高抗病毒品种的有效方法。在前期研究中，我们制备了增量表达家蚕内源抗性基因Bmlipase-I的转基因品系，检测结果显示该品系能显著提高家蚕对BmNPV的抵抗力。Bmlipase-I在家蚕中肠特异表达，然后分泌到家蚕肠液中发挥作用，该蛋白在肠液中能够抑制灭活BmNPV病毒，减少侵入家蚕中肠细胞的ODV病毒数量，从而提高家蚕对BmNPV的抗性，但是抗性提高有限
发明内容
本发明的目的之一在于提供家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的应用；本发明的目的之二在于提供含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供重组载体的制备方法。I.家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因在制备重组载体中的应用，所述多基因反向重复序列的正向序列如SEQ ID NO. I所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示，所述家蚕脂肪酶I基因如SEQ ID NO. 11第1081-1965位所示核苷酸。更优选的，所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的正向序列和反向序列之间连入家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron,所述家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。2.含所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的重组载体。优选的，所述家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列的5’端为IEl启动子，所述家蚕脂肪酶I基因的5’端连接家蚕中肠特异表达启动子P2。更优选的，所述重组载体的IEl启动子的5’端连接Hr3增强子。最优选的，所述重组载体是由SEQ ID NO. 12所述的载体序列经Asc /酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的片段，连接经Asc /酶切的 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]载体而得。3.所述重组载体的制备方法，包括如下步骤
(1)合成SEQID NO. I所示的核苷酸序列，经及^7 I取BernH I酶切后连接经同样双酶切的含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子的pMD-19载体，得pMD-19-FS-A3intron载体；克隆如SEQ ID NO. 4所示的序列，连入所得pMD-19-FS-A3intron载体的家蚕肌动蛋白基因Actin 3 内含子的 3’ 端,得 pMD-19-FS-A3intron-FA 载体；
(2)将步骤(I)所得pMD-19-FS-A3intron-FA载体用EcoRI和Xba /进行双酶切，将含SEQ ID NO. I、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子和SEQ ID NO. 4的片段FS-A3intron-FA连入L4440载体的IEl启动子IElP和SV40终止信号序列之间，得L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 载体；(3)克隆家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶I基因，将家蚕中肠特异表达启动子P2用治μ /和Afoi /酶切后连接经同样酶切的含SV40终止信号序列的pSLfall80fa载体，得1180-P2-SV40载体，然后同时用Afoi /和通ο /酶切所得1180-P2-SV40载体和克隆的家蚕脂肪酶I基因，连接后得1180-P2-Bmlipase-l-SV40载体，载体序列如SEQ ID NO. 11所示；
(4)克隆Hr3增强子，连接进pSLfall80fa载体得1180_Hr3载体；将步骤(2)所得L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 载体中的含 IEl 启动子 ffilP 和 FS-A3intron_FA 的片段连接入所得1180-Hr3载体，得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA_SV40载体，然后将所得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 载体用 Kpn I 和历TZT进行双酶切，同时用 Kpn I和Viz7i////双酶切所得1180-P2-Bmlipase-l-SV40载体，将含家蚕中肠特异表达启动子P2和家蚕脂肪酶I基因的序列连接酶切后的1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40载体，得 1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-l-SV40 载体，载体序列如 SEQ IDNO. 12所示；
(5)将步骤(4)所得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-l-SV40 重组载体经Asc /酶切后回收含家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶I基因的片段，连接经Asc /酶切的piggyBac[3Xp3 EGFP afm]载体,得重组载体。本发明的有益效果在于为了获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系，将家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列与家蚕脂肪酶I基因进行联合应用，在同一载体中实现同时表达抗性基因家蚕脂肪酶I和表达干扰家蚕核型多角体病毒复制的反向重复序列，反向重复序列中含有家蚕核型多角体病毒的iel、gp64、lefl Jef2和DNA聚合酶基因的双链RNA，经家蚕体内加工后，形成小分子双链RNA，因此能在病毒侵染的多个阶段抑制病毒，控制家蚕核型多角体病毒在家蚕体内繁殖，降低家蚕核型多角体病毒在体内的含量，从而达到抗家蚕核型多角体病毒的效果。利用该载体转化家蚕后，抗病毒效果明显，与未转化的相比，存活率提高51. 11%，并且转化该载体后不影响家蚕的经济形状，因此用于育种，获得高抗家蚕核型多角体病毒的家蚕品系。
图I为Pb-HFPL重组载体结构图。图2为转基因家蚕和非转基因家蚕抗性检测结果图(SW-H1、SW-H2和SW-H3分别为不同转基因品系；sw为非转基因品种)。图3为转基因系统SW-Hl和非转基因品种SW感染病毒后沿基因的荧光定量PCR结果。图4为转基因家蚕和非转基因品种的全茧量和茧层率(A :全茧量；B :茧层率)。
具体实施例方式 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。·实施例中使用的家蚕品种为“芙蓉”品种，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。
实施例I、构建转基因载体
一、构建 L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 载体
(I)根据已经报道的BmNPV基因组序列及家蚕核型多角体病毒的(GenBank:NO. X58442. I),gp64 (GenBank: NO. AB253773. I),IefI (GenBank: NO. L09723. I),Ief2(GenBank: AF036245. I)和β财聚合酶基因(GenBank: NO. D16231. 1)5 个基因的序列，人工合成包括以上所述5个基因部分序列的串联DNA双链序列，命名为FS，如SEQ ID NO. I所示。在FS的5’端设置有/酶切位点，FS的3’端设置有及 # I酶切位点。根据人工合成的FS序列设计扩增FS的反向互补序列FA,上游引物为FA sense :5’ -cccaagcttcgctgtctgaactatcacaa-3’ (SEQ ID NO. 2),下划线为III酶切位点；下游引物为 FA anti : 5'-gctctagaatatcatgacaatattgcgag-3' (SEQ ID NO. 3),下划线为 ZAa / 酶切位点，以人工合成的FS为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸45秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与PMD19-T simple载体连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下，16°C过夜连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明本实施例成功克隆了 FS的反向互补序列FAjB SEQ ID NO. 4所示核·酸序列。(2)将人工合成的FS序列用及^7 I热BamH I进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得FS酶切片段，同时用EcoR I和BamH I双酶切已经包含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子(简称A3intron)的pMD-19载体，A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pMD-19载体酶切片段。将FS酶切片段和pMD-19载体酶切片段连接，然后进行转化，筛选阳性克隆，得到含FS和A3intron的载体，命名为pMD-19-FS_A3intron ;将反向互补片段 FA 和 pMD-19-FS_A3intron 载体分别用/ ￠/TZ/和Xba I进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到含FS、A3intron和FA的载体，命名为 pMD-19-FS-A3intron_FA 载体。pMD-19-FS-A3intron_FA 载体中，A3intron 位于FS序列和FA序列之间，因此表达含FS、A3intron和FA的片段(命名为FS-A3intron_FA)后能形成回文结构。(3)将已经包含IEl启动子(简称IE1P)和SV40终止信号序列的L4440载体用和/进行双酶切，收集L4440载体骨架，同时用/和/酶切pMD-19-FS-A3intron-FA载体，回收含有FS、A3intron和FA的片段，然后与L4440载体骨架连接，转化，筛选阳性克隆，得到L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40载体，序列如SEQ IDNO. 6 所示。L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 载体即在 L4440 载体的 IEl 启动子和 SV40终止信号序列之间插入了 FS-A3intron-FA序列。(二)构建 1180-P2-Bmlipase-l_SV40 载体
(I)根据
发明者蒋亮, 夏庆友, 程廷才, 赵萍, 王根洪 申请人:西南大学