专利名称：一种定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于体外核酸诊断领域，涉及一种定量检测K-删除重组切除环(K -deleting recombination excision circles, KRECs)基因的实时突光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)试剂盒及其用途。
背景技术：
原发性免疫缺陷病(PrimaryImmunodeficiency Disease, PID)是因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，其总发病率为:美国1/10000，澳大利亚2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我国香港地区1/8000人。国内缺乏全面的统计资料，如果按照1/10000的发病率，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新发的PID病例，整个儿童期累计患者达到3万-6万例。原发性免疫缺陷病，与遗传相关，常发生在婴幼儿，可出现反复感染，严重时可威胁生命。因其中有些可能获得有效的治疗，因此及时诊断仍很重要。2001年11月，美国疾病控制和预防中心(Centers for Disease Controland Prevention,⑶C)在乔治亚洲首府亚特兰大召开专题研讨会，建立针对新生儿筛查(Newborn Screening，NBS)实验和早期识别PID的方案，以便能早期诊断和治疗PID患者。2009年美国⑶C在美国维斯康星州进行重症联合免疫缺陷(Severe CombinedImmunodefieieney Disease, SCID)新生儿筛查。按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为体液免疫缺陷为主(即抗体缺乏为主的免疫缺陷)、细胞免疫缺陷为主以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。此夕卜，补体缺陷、吞噬 细胞缺陷等非特异性免疫缺陷也属于本组。抗体缺乏为主的免疫缺陷病是由于B细胞早期发育障碍引起的一组原发性免疫缺陷症，由于体液免疫缺陷，容易反复发生细菌感染，表现为B细胞和免疫球蛋白不同程度的减少，是发病率最高的原发性免疫缺陷病。目前分为以下几类:1)严重低丙种球蛋白血症，致病原因有Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s Tyrosine Kinase, BTK)基因缺陷、μ链缺乏、λ5链缺乏、Iga缺乏、Ig^缺乏、B细胞连接蛋白(BLNK)缺乏、骨髓发育不良等，其中X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)是最常见的体液免疫缺陷症，其病因是BTK缺陷，表现为B细胞和免疫球蛋白显著低下；2)血清IgG和IgA的重度减少伴B细胞正常、减少或显著减少，致病原因有普通变异型免疫缺陷病(Common Variable Immunodeficiency Disease, CVID)、可诱导共刺激分子(Inducible Co-Stimulator, I COS)缺陷、CD19缺陷、X连锁淋巴组织增殖综合症(X-linked Lymph Proliferative Disease, XLP) ;3)血清 IgG 和 IgA 的重度减少,IgM正常或增高(即高IgM综合症)，致病原因有⑶40配体缺陷、⑶40缺陷、活化诱导胞啶脱氨基酶(Activation-1nduced Cytidine Deaminase, AICDA)缺陷、尿卩密唳 N-糖基化酶(Uracil-N-Glycosylase，UNG)缺陷；4)同种型或轻链缺乏，致病原因有Ig重链缺乏、κ链缺乏、选择性IgG亚类缺陷、选择性IgA缺陷等。抗体缺乏为主的免疫缺陷病病因繁多，诊断非常困难，但共同特征是B淋巴细胞缺乏或不同程度的减少。目前X连锁无丙种球蛋白血症的检测一般通过流式细胞术检测⑶19+B细胞〈2%或者免疫球蛋白低于相应年龄正常值2S以上的诊断指标，但这两种方法容易产生假阴性，特异性差。在研究中，也采用检测BTK蛋白表达或者BTK基因突变的方法检测原发性免疫缺陷病，但这两种方法容易产生假阳性，并且对技术要求高，仅在专科实验室研究，难以普及。在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白的λ链发生的基因重排时形成的κ -删除重组切除环(κ -deleting recombination excision circles, KRECs), KRECs 也不随着细胞的增殖而增加，而是不断被稀释。因为抗体缺乏为主的免疫缺陷病中的B细胞成熟缺陷发生在κ -删除重组前，病人B细胞中KRECs缺乏或不同程度的减少，利用定量PCR法检测KRECs可以作为抗体缺乏为主的免疫缺陷病的新生儿筛查方法，因此通过对KRECs的定量测定可以筛查出患有B细胞成熟缺陷的新生儿。但是，目前还缺乏可以检测定量KRECs的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种通过定量检测KRECs基因的拷贝数，用来筛查新生儿B细胞免疫缺陷的实时荧光PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪。本发明能够检测新生儿B细胞的水平，判断新生儿免疫系统功能正常与否，在临床检验领域有良好的应用前景。本发明的另一个目的是在于提供了筛查新生儿B细胞免疫缺陷中的应用，上述试剂盒所需的样本获取、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果可靠。为了实现上述的目的，本发明提供:一种定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含KRECs基因插`入序列的标准品1、包含β-actin基因插入序列的标准品I1、、阴性对照品、空白对照品、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。在本发明的一个优选方案中，巢式PCR反应液是由KRECs和β -Actin的PCR正向弓丨物、反向弓丨物，2Xtaq PCR MasterMix, ImM MgCl2和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，KRECs基因的巢式PCR正向引物(SEQ NO:1)为 5’ -GCTCAGCGCCCATTACGTTTCTG-3’，反向引物(SEQ NO: 2)为 5’ -CTGTGAGGGACACGCAGCCTG-3’。β-actin 基因的巢式 PCR 正向引物(SEQ NO:3)为 5’ -CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:4)为5’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3’。在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液I是由KRECs荧光PCR引物和探针、2.5Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和无菌水组成。在本发明的一个具体方案中，KREC 基因的荧光 PCR 正向引物(SEQ NO: 5)为 5’ -GTGGCATTATTTGTATCACTGTGC-3’，反向引物(SEQ NO:6)为 5’ -CAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTGC-3’ 和探针(SEQ NO:7)为 FAM-CACGGGAGCAGGTTGGCAGCGC-TRAMA。在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液II是由β-Actin荧光PCR引物和探针、2.5Xreal time Mix、牛血清白蛋白(BSA)、20xPCREnhancer和无菌的超纯水组成。在本发明的一个具体方案中，β-actin基因的荧光PCR正向引物(SEQ N0:8)为5，-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3，，反向引物(SEQ NO: 9 )为 5 ’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3，和探针(SEQ NO: 10)为 VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TRAMA。在本发明的一个优选方案中，荧光PCR反应液I和荧光PCR反应液II中所述的KREC和β -actin基因的特异性探针均为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，为FAM、VIC、TET、J0E、R0X、CY3、CY5、HEX中的一种；3’端为荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。在本发明的一个具体方案中，KRECs标记探针5’端为FAM探针，3’端为TAMRA探针；β -actin标记探针5’端为VIC探针，3’端为TAMRA探针。在本发明的一个优选方案中，标准品I是含有插入KRECs基因89个核苷酸片段连接入PUC57载体质粒。该KRECs基因的插入序列(SEQ NO: 11)为5’_TCCCTTAGTGGCA TTATTTGTATCACTGTGCACAGTGTGCGCTGCCAACCTGCTCCCGTGCAGAAACTCTAGGGTMGAGCTGGCTCCT-3，。标准品I用分光光度计测A26tl定量，存放浓度为1.0X IO8拷贝/ul、1.0X107拷贝/ul、1.0X106拷贝/ul、1.0X105拷贝/ul、1.0X104拷贝/ul、1.0X103拷贝/ul 6个浓度梯度。在本发明的一个优选方案中，标准品II是含有插入β-actin基因70个核苷酸片段连接入PUC57载体质粒。该β-actin基因的插入序列(SEQN0:12)为:5，-ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTG GCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。标准品II用分光光度计测A26tl定量，存放浓度为1.0X IO8拷贝/ul、l.0X IO7拷贝/ul、1.0X106 拷贝 /ul、1.0X105 拷贝 /ul、1.0X104 拷贝 /ul、l.0XlO3 拷贝 /ul 6 个浓度梯度。在本发明的一个优选方案中，阴性对照品为KRECs和β-actin重组质粒，其浓度为 5.0X IO5 拷贝 /ul。在本发明的一个优选方案中，空白对照品为无菌的超纯水。在本发明的另一个方面，还提供了一种通过定量检测KRECs基因的拷贝数，在筛查新生儿B细胞免疫缺陷中的应用，实时荧光PCR试剂盒对新生儿B细胞免疫缺陷的检测方法，该方法包括下列步骤:I)用DNA提取液对干血滤纸片DNA进行提取:2)将标准品和待测样品加入巢式PCR反应液，用PCR检测仪对KRECs和β -actin基因进行扩增；3)将扩增后的PCR产物加入实时荧光定量PCR反应体系，用荧光定量检测仪检测进行PCR检测；4)通过比较待测样品和标准品的循环域值，根据标准曲线计算待测样品的起始KRECs和β-actin基因拷贝数。在提取的DNA量足够时，也可不经过巢式PCR反应体系，直接加入实时定量PCR反应体系中去。本发明的有益效果:
I)样本获取、储存方便。本发明对新生儿干血滤纸片仅取3mm直径的纸片提取DNA即可完成该项目的检测，干血滤纸片为新生儿常规获得，并且用血量很少，减少新生儿抽取的血量，同时干血滤纸片有利于长期保存，大大降低了样本的获得、储存及运输等问题的出现。2)灵敏度和特异性高。采取特异性引物、探针及巢式PCR，并对样本提取的DNA进行普通PCR扩增18个循环，有效的提高了检测基因的拷贝数，提高了对样本检测的灵敏性，而阳性样本中的KRECs几乎没有，使得样本检测结果的阴性与阳性很容易进行判定。3)检测方法简单，检测速度快，结果以拷贝数表示，定量结果准确可靠。有利于在医院及实验室推广应用。4)通过选择样本自身的管家基因β-actin作为内参，若扩增的内参的拷贝数在正常范围内，KRECs的拷贝数非常低，则阳性结果可靠，否则需重新测定，因此能更有效地减少假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性。总之本发明灵敏度高，特异性好，检测方法简单快速，实验结果可靠。本发明填补了原发性免疫缺陷病的普查及新生儿筛查的空白，不仅可以筛查抗体缺陷为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与B细胞发育相关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及治疗。
图1.KRECs标准品的扩增曲线及标准曲线。图2.β -actin标准品的扩增曲线及标准曲线。图3.正常儿童DNA样本KRECs基因的扩增曲线。图4.XLA阳性儿童DNA样本KRECs基因的扩增曲线。图5.空白对照品的 扩增曲线。图6.正常儿童DNA样本β-actin基因的扩增曲线。图7.XLA阳性儿童DNA样本β -actin基因的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如:精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。实施例1:试剂盒的制备1.引物与探针的设计与合成根据UCSC 网站上 UCSC Human Gene Sorter 查询 KRECs 和 β-actin 基因序列(http://genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgNear),利用 Primer3.0 在 KRECs 的基因上设计巢式PCR的上下游引物，其中KRECs和β -actin的巢式PCR上游引物与该基因的结合位置在其实时荧光定量PCR上游引物与该基因结合位置的上游，KRECs和β -actin的巢式PCR下游引物与该基因的结合位置在其实时荧光定量PCR下游引物与该基因结合位置的下游。所选引物对于基因的结合有很好的特异性，有较高的PCR扩增效率。引物与探针均委托LifeTechnologies公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。KRECs的探针5’端标记为FAM荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团；β -actin的探针5’端标记为VIC荧光基团，3’端标记为TAMRA荧光基团。引物序列如表I。表1插入基因、特异性引物以及探针序列
权利要求
1.一种定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括DNA提取液、巢式PCR反应液、包含KRECs基因插入序列的标准品1、包含β-actin基因插入序列的标准品I1、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β -actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的巢式PCR反应液包括: 1)巢式PCR扩增KRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:1所示； 2)巢式PCR扩增KRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:2所示； 3)巢式PCR扩增β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO: 3所示; 4)巢式PCR扩增β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO: 4所示。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的荧光PCR反应液I包括: O实时荧光PCR检测KRECs基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO: 5所示； 2)实时荧光PCR检测KRECs基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:6所示； 3)用于检测KRECs基因的探针，其碱基序列如SEQNO:7所示； 其中所述的荧光PCR反应液II包括: 1)实时荧光PCR检测β-actin基因的正向引物，其碱基序列如SEQNO:8所示； 2)实时荧光PCR检测β-actin基因的反向引物，其碱基序列如SEQNO:9所示； 3)用于检测β-actin基因的探针，其碱基序列如SEQNO: 10所示。
4.权利要求1所述的试剂盒，其中所述的标准品I，其碱基序列如SEQNO: 11所示；其中所述的标准品II,其碱基序列如SEQ NO: 12所示。
5.权利要求1至4所述的试剂盒，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，是FAM、VIC、TET、J0E、R0X、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端的为一种荧光淬灭基团，是TAMRA、DABCYL, NFQ中的一种。
6.权利要求1至4所述的试剂盒,所述的Taqman探针5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。
7.权利要求1至6所述的试剂盒在新生儿B细胞免疫缺陷检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于定量检测KRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明包括一个以巢式PCR技术为基础的PCR反应体系和以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量(Real time)PCR反应体系。其中巢式PCR反应体系包括针对KRECs和β-actin基因的正、反向引物；实时荧光定量PCR反应体系包括针对KRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地筛查新生儿免疫系统B细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性。此方法适用于KRECs定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。
文档编号C12Q1/68GK103173535SQ20121047371
公开日2013年6月26日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者王晓川, 刘丹如, 王牧, 房聪 申请人:上海领检科技有限公司