专利名称：一种提高胆固醇氧化酶稳定性方法
技术领域：
本发明涉及一种提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，属于酶工程领域。
背景技术：
胆固醇氧化酶(COD)是胆固醇代谢过程中关键酶，能专一性催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，它作为一种胆固醇检测酶应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、抗虫基因工程、生物农药等方面也具有广泛应用价值。由于胆固醇氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中，但考虑到操作复杂且试剂具有毒性，本实验中使用碳二亚胺法固定胆固醇氧化酶，I-乙基-(3- 二甲 基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，载体或蛋白羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与蛋白氨基反应形成结合物。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，本发明设计巧妙、条件温和、易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。为了实现上述目的，本发明的提高胆固醇氧化酶稳定性方法，其特点是，包括以下步骤(I)合成四种不同类型的羧基琼脂糖颗粒载体；(2)固定时间为16-20小时，所述固定温度为4-1 (TC。为了实现上述目的，在步骤(I)之前需要研究胆固醇氧化酶分子表面碱性氨基酸数目，所述单个胆固醇氧化酶分子表面碱性氨基酸数目为60个。较佳地，在步骤(I)中，合成四种不同类型的四种不同类型的，以琼脂糖(如Sepharose4B)为基质，分别连接天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)四种氨基酸,制备带有不同氨基酸的羧基载体，其中优选Asp。较佳地，所述连接Asp、Glu两种氨基酸的载体羧基密度基本为40-50μπιΟ1/^，连接Ser、Pro两种氨基酸的载体羧基为20-30 μ mol/g。较佳地，在步骤(2)中，所述羧基载体为连接Asp的琼脂糖颗粒，所述酶分子游离氨基与载体羧基摩尔比I : 10，总羧基与EDC摩尔比为I : 2，所述固定pH为6. O。较佳地,所述固定时间为16-20小时,所述固定温度为4_10°C。较佳地，所述固定化后使用O. 6mol/L NaCl溶液洗去非特异性吸附。所述固定化酶的热、pH和存储稳定性均优于游离酶。本发明的有益效果具体如下I、本发明在固定前，分析了胆固醇氧化酶分子表面碱性氨基酸分布情况，便于其后进行固定化；
2、本发明以琼脂糖为基质，通过化学合成法连接四种不同氨基酸，形成了四种不同类型的羧基载体；3、本发明优化了胆固醇氧化酶固定化条件，增强了操作的精确性。
图I是胆固醇氧化酶分子表面碱性氨基酸分布图。图2是不同pH对固定化COD活力的影响图3是总羧基与EDC摩尔比对固定化COD活力的影响
图4是游离酶和固定酶的热稳定性图5是游离酶和固定酶的pH稳定性图6是游离酶和固定酶的存储稳定性
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。实施例I不同氨基酸载体对固定化COD活力的影响称取四种不同氨基酸的羧基载体Ig于15mL的离心管中，按照总羧基与EDC摩尔比I : 10、载体羧基与胆固醇氧化酶氨基摩尔比25 I的比例加入EDC和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至溶液总体积为10mL，调节溶液pH至7. 0，4-10°C、50r/min振荡固定16-20小时。混合物6000rpm离心5min,取出沉淀后,用8mL0. 6mol/L NaCl于4°C洗漆lh,混合物SOOOrpm离心5min，测定上清液未偶联的酶活力，过滤除去上清液得固定化酶，测定
固定化酶活力，计算相对酶活力(％ ) O
相对酶活Jj (%)=-初始固定酶话力-*ιοο
加入酶总活力-上清未偶联酶活力将不同固定化酶置于37°C水浴锅内，24小时后测定酶活力，计算酶活力保留率
(% )o
酶活力保留率(%)=24小T口,固I酶活力*100 初始固定酶活力不同载体表现出不同的稳定效果，为了增强酶稳定性，选择载体-Asp作为最佳的固定载体，结果见表I。表I不同氨基酸载体对固定化COD活力的影响
羧基种类酶活(U/g)相对酶活力(%) 酶活力保留率(%)
-Asp7.0825.4850.58
-Glu9. 3732. 5744.25
-Ser10. 1367. 5422.23
-Pro7.9552.9828.68实施例2胆固醇氧化酶氨基与载体羧基摩尔比对固定化COD活力的影响
称取连接Asp的羧基载体Ig于15mL的离心管中，按照总羧基与EDC摩尔比I 10、不同胆固醇氧化酶氨基与载体羧基摩尔比(I 5、1 IOU 20,1 40,1 80、I 120)加入EDC和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至溶液总体积为10mL，调节溶液pH至7. 0,4_10°C、50r/min振荡固定16-20小时。混合物6000rpm离心5min,取出沉淀后，用8mL0. 6mol/LNaCl于4 V洗洚Ih,混合物8000rpm离心5min,测定上清液未偶联的酶活
力，过滤除去上清液得固定化酶，测定固定化酶活力，计算相对酶活力(％ )。
权利要求
1.一种提高胆固醇氧化酶稳定性方法，其特征在于，包括以下步骤 调整胆固醇氧化酶分子游离氨基与羧基琼脂糖颗粒载体羧基摩尔比为I : 10，总羧基与交联剂I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺摩尔比为I : 2，固定16-20小时，控制固定温度为4-10°C。
2.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述羧基琼脂糖颗粒载体以琼脂糖基质，添加Asp、Glu、Ser和Pro四种氨基酸,制备带有不同氨基酸的羧基琼脂糖载体。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述羧基琼脂糖颗粒载体为使用Asp的羧基琼脂糖载体。
4.根据权利要求I或2所述方法，其特征在于，连接Asp、Glu两种氨基酸的载体羧基密度为40-50 μ mol/g,连接Ser、Pro两种氨基酸的载体羧基为20-30 μ mol/g。
5.根据权利要求I或2所述方法，其特征在于，所述固定pH为6.O。
6.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述琼脂糖为Sephar0Se4B。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述固定化后使用O.6mol/L NaCl溶液洗去非特异性吸附。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述固定温度为4°C。
全文摘要
本发明公开了一种提高胆固醇氧化酶稳定性方法，属于酶工程领域。通过交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)对胆固醇氧化酶进行固定，优化固定时间及温度后，固定化酶在热、pH和存储稳定性均优于游离酶，本发明易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。
文档编号C12N11/10GK102943071SQ20121047255
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者杨海麟, 辛瑜, 王武, 张玲, 陈亦 申请人:江南大学