专利名称：发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特别是涉及一种发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
背景技术：
2-酮基-D-葡萄糖酸是一种葡萄糖氧化产物，是一种目前大规模生产的有机酸，其可以用作食品添加剂、水泥增塑剂、洗涤剂等。目前2-酮基-D-葡萄糖酸主要用于合成D-异抗坏血酸。D-异抗坏血酸与L-抗坏血酸(维生素C)性质接近，具有抗氧化作用和抗坏血酸作用，广泛用于食品添加剂，替代L-抗坏血酸。2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有3类，包括酶法合成、化学合成和发酵法生产。发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸主要利用假单胞菌属的细菌、粘质沙雷氏菌、产酮产碱菌等细菌为生产菌株，利用葡萄糖为原料发酵生产。其中，工业上主要选用荧光假单胞菌为生产菌株(魏转，余泗莲，孙文敬，周强，李中兵.2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研究进展，食品科学，2008，08 :636-639)。肠杆菌科的很多种细菌可以氧化葡萄糖生产葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸，其中包括克雷伯氏菌属的一些菌株，有报道克雷伯氏肺炎杆菌NCTC418在部分营养成分限制条件下培养可以合成葡萄糖和2-酮基-D-葡萄糖酸(Ed T. Buurman, Josc L. Boiardi, M.Joost Teixeira de Mattosj Oense M. Neijssel, The role of magnesium and calciumions in the glucose dehydrogenase activity of Klebsiella pneumoniae NCTC418，Arch Microbiol(1990) 153 :502_505)。利用假单胞菌属的细菌、粘质沙雷氏菌和产酮产碱菌等细菌发酵培养温度一般在28°C，使得生产中用于降温的能耗较高；同时，假单胞菌属的细菌容易感染噬菌体，影响生产。因此，需要开发更为经济性的生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种发酵法生产2-酮基D-葡萄糖酸的方法。通过该方法，能够经济高效地生产2-酮基-D-葡萄糖酸。为解决上述技术问题，本发明的发酵法生产2-酮基D-葡萄糖酸的方法，是利用2，3 丁二醇合成途径缺失的雷伯氏肺炎杆菌作为生产菌株，在好氧发酵条件下，控制发酵液处于酸性条件，以葡萄糖为原料生产2-酮基-D-葡萄糖酸。所述2，3- 丁二醇合成途径缺失的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，是通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3- 丁二醇合成途径中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3-丁二醇能力的消除。其中，乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，是通过基因突变进行失活，优选为通过基因同源重组进行失活。所述控制发酵液处于酸性条件中，可通过加入碱液或碳酸盐进行调节，使其保持一定的酸性；其中，碱液包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，碳酸盐包括碳酸钙、碳酸钠和碳酸氢钠。 所述酸性条件中，其pH值为6. 5 3，优选pH值为5. 5 4. 5。所述好氧发酵条件中，发酵温度为20 45摄氏度，优选35 40摄氏度。本发明的发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸，具有较高的转化率，发酵过程控制容易，发酵过程降温能耗较低。
具体实施例方式以下实施例中涉及的构建的2，3-丁二醇合成途径消除的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCCI. 6366-budA 其具体的构建方法如下I、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因(budA)。根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578 (Genbank: CP000647)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s :GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO. I 所示)，下游引物 budA-a :CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ ID NO. 2 所示)。通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366 (CGMCCI. 6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，具有氨苄青霉素抗性)基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因片段，通过TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD_18Tsimple质粒上,命名为pMD18T_budA质粒,序列测定结果如下budA基因相邻上游部分序列为GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA (SEQ IDNO. 3所示)。budA基因阅读框为AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGCCGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCCGGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATTGACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATAATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT (SEQ ID NO. 4 所示)。budA基因相邻下游部分序列为ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATCCCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCC
4ACGAAGCTAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTTCCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCCGATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG (SEQ ID NO. 5 所示)。2、利用步骤I克隆到的基因序列，制备两侧连有同源臂中间连接抗性核的DNA片段。 本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有同源臂连接抗性核的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T_budA质粒上失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因上下游序列同源的序列，中间连接抗性核。本步骤操作原理可参见(Weiet. al. Red recombinase assisted genereplacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology2012),具体步骤如下a. pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5 a -pIJ790中，命名为 DH5 a -pMD18T-budA。制备DH5 a -pMD18_budA感受态细胞，在菌体培养I个小时后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，诱导PIJ790质粒中Red重组酶的表达。b.设计引物budA_s2和budA_a2，序列分别为GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ IDNO. 6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ IDNO. 7所示)。弓丨物budA-s2 的 “GCCCTGCTGAGCGGGGITTACGAAGGCAGCACCACCATC” 序列与 budA 基因序列同源，引物 budA-a2 的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列与 budA基因相应序列同源。利用引物budA_s2和budA_a2，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1491bp的DNA片段A。该片段两段分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。c.利用DNA片段A转化感受态DH5a-pMD18T-budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T_budA上的budA同源部分发生重组，获得了 pMD18T-A 质粒。d.利用引物 budA-s (SEQ ID NO. I 所示)和 budA-a (SEQ ID NO. 2 所示)，以PMD18T-A质粒为模板进行PCR扩增，获得3114bp的DNA片段B。DNA片段B两端分别具有1131bp和571bp的budA基因和相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1. 6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。3、利用转化或结合方法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌中，利用同源重组与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因进行重组，筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株，具体步骤如下
a.将 pDK6-red 质粒转化到 CGMCC1. 6366 中，获得 CGMCC1. 6366-pDK6_red 菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC1. 6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。b.重组菌的验证，设计验证引物 Yanzheng778z AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG(SEQ ID NO. 8所示)，其序列对应链霉素抗性基因aadA中间的一段序列。利用引物budA-s (SEQ ID NO. I所示)和Yanzheng778z,以长出的菌株总DNA为模板进行PCR扩增，产物DNA片段为1889bp，而以出发菌株CGMCC1. 6366总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重组菌正确，命名为CGMCC1. 6366-budA_。该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。实施例I利用上述构建的2，3- 丁二醇合成途径消除的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCCI. 6366budA_发酵葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，其步骤如下I)配制培养基葡萄糖50g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化钠7g/L,经自来水混合配制后，分装到250mL锥形瓶中，装液量50mL，每瓶添加碳酸钙O. 5g，并灭菌。所用试剂均为国产商业产品。2)接种微生物并进行好氧培养每瓶培养基中接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366_budA_ —接种环，37°C摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养发酵48小时，利用添加的碳酸钙控制发酵过程pH，发酵过程PH逐渐降低到4. 5。将培养好的发酵液用高效液相色谱仪，利用HPX-87H色谱柱，视差检测器对发酵液组分进行检测，检测结果为2_酮基-D-葡萄糖酸41. 2g/L，2，3- 丁二醇O. 51g/L，乳酸
O.5g/L，琥珀酸O. 3g/L，乙酸I. 5g/L。其中，底物葡萄糖向产物2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为82. 4%ο实施例2利用上述构建的2，3- 丁二醇合成途径消除的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCCI. 6366-budA_发酵葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，其步骤如下I)配制种子培养基葡萄糖30g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化钠7g/L,经自来水混合配制后，分装到250mL锥形瓶中，装液量50mL，并灭菌。2)配制发酵培养基葡萄糖50g/L,玉米衆8g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化钠7g/L,经自来水混合配制后，将4L发酵培养基装入容量为5L的发酵罐内，灭菌。3)种子培养每瓶种子培养基中接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366_budA_ —接种环，37°C摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。4)发酵培养将IOOml种子培养物接入发酵罐中，37°C培养，搅拌桨转速为400转每分钟，通风量为4升每分钟，用20% (质量浓度)的氢氧化钠溶液控制发酵过程pH为4. 8 5. 2，培养发酵24小时。
将培养好的发酵液用高效液相色谱仪，利用HPX-87H色谱柱视差检测器对发酵液组分进行检测，检测结果为2_酮基-D-葡萄糖酸52. 5g/L。其中，底物葡萄糖向产物2-酮基D-葡萄糖酸的转化率为105%。
权利要求
1.一种发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于所述方法是利用2，3-丁二醇合成途径缺失的雷伯氏肺炎杆菌作为生产菌株，在好氧发酵条件下，控制发酵液处于酸性条件，以葡萄糖为原料生产2-酮基-D-葡萄糖酸。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述2，3-丁二醇合成途径缺失的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，是通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3- 丁二醇合成途径中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3-丁二醇能力的消除。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，是通过基因突变进行失活。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，是通过基因同源重组进行失活。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述控制发酵液处于酸性条件中，是通过加入碱液或碳酸盐进行调节，使其保持酸性；其中，碱液包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水；碳酸盐包括碳酸钙、碳酸钠和碳酸氢钠。
6.如权利要求
7.如权利要求
8.如权利要求摄氏度。
9.如权利要求
全文摘要
本发明公开了一种发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，是利用2,3-丁二醇合成途径缺失的雷伯氏肺炎杆菌作为生产菌株，在好氧发酵条件下，控制发酵液处于酸性条件，以葡萄糖为原料生产2-酮基-D-葡萄糖酸。本发明具有较高的转化率，发酵过程控制容易，发酵过程降温能耗较低。
文档编号C12P7/58GK102925499SQ20121047692
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者郝健, 魏东, 柳鹏福, 史吉平, 姜标 申请人:上海中科高等研究院