大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：将冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37℃培养过夜后挑取单菌落于加入了MgCl2溶液的SOB培养基中，37℃振荡培养；取培养液接种于加入了MgCl2溶液的SOB培养基中，37℃培养；得到的菌液转移至无菌离心管，冰浴后4℃离心；离心液去上清，将沉淀重悬于预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置后4℃离心；离心液去上清，将沉淀重悬于预冷的TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀；将悬液在冰上放置后分装到预冷的无菌EP管中，得到大肠杆菌感受态细胞。这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37℃摇床中培养即可，与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。
【专利说明】大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，特别是涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法。【背景技术】
[0002]在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但人工构建的质粒载体，缺乏此种转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外援DNA。
[0003]转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术，这是现代分子生物学最基本的操作技术。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。转化效率直接影响前后实验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。
[0004]通常实验室自己制备感受态细胞，常用的制备方法包括CaCl2法和Inoue法。CaCl2法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，不能满足常规载体构建的需要；Inoue法虽然感受态细胞的转化效率较高，但细菌的培养条件是18°C，需要低温摇床，振荡19h~50h，摇菌的时间较长，并且过程相对繁琐。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种转化效率高、操作简单实用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法
[0006]一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤:
[0007]步骤一、将-80°C冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37°C培养过夜后挑取单菌落于5mL的加入了 MgCl2溶液的SOB培养基中，37°C振荡培养12h~16h ；
[0008]步骤二、取500 μ L步骤一中得到的培养液接种于50mL的加入了 MgCl2溶液的所述SOB培养基中，37°C培养约3h，使培养液的吸光值OD (A600)为0.4~0.6 ;
[0009]步骤三、将步骤二中得到的菌液转移至50mL无菌离心管,冰浴1Omin,接着4°C下4000rpm 离心 10min ；
[0010]步骤四、将步骤三得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置lOmin，接着4°C下4000rpm离心10min ；
[0011]步骤五、将步骤四得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7% ；
[0012]步骤六、将步骤五得到的悬液在冰上放置IOmin后分装到预冷的无菌EP管中，得到所述大肠杆菌感受态细胞。
[0013]在一个实施例中，所述SOB培养基的配制过程如下:
[0014]将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186g KCl溶解在双蒸水中至IOOmL,调节pH为7.0后灭菌，得到所述SOB培养基。
[0015]在一个实施例中，每20mL的所述TB转化缓冲液由如下成分组成:
[0016]12.5mL 的双蒸水、4mL 的 lmol/L 的 KCl,2.4mL 的 0.45mol/L 的 MnCl2、0.5mol/L 的CaCl20.6mL 和 0.5mL 的 0.5mol/L 的 K-MES 缓冲液。
[0017]在一个实施例中，所述0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下:
[0018]称取9.76g MES完全溶解于80mL的双蒸水中，用lmol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到IOOmL,过滤灭菌后保存于_20°C，得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。
[0019]在一个实施例中，步骤一中和步骤二中，每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2 溶液 10μL。
[0020]在一个实施例中，所述冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的体积浓度为70%。
[0021]在一个实施例中，步骤一中，所述37 °C振荡的操作中，转速为220rpm。
[0022]在一个实施例中，步骤四和步骤五中，所述TB转化缓冲液为新鲜配制的。
[0023]这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37°C摇床中培养即可，没有设备要求的限制，既适用于一般实验室的制备，也可用于商业化生产。与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为一实施方式的大肠杆菌感受态细胞的制备方法的流程图。
【具体实施方式】
[0025]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0026]一实施方式的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，如图1所示，步骤如下。
[0027]SlOjf _80°C冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37°C培养过夜后挑取单菌落于5mL的加入了 MgCl2溶液的SOB培养基中，37°C振荡培养12h~16h。
[0028]-80°C冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的浓度为70%。
[0029]SOB培养基的配制过程如下:将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186gKCl溶解在双蒸水中至1OOmL,调节pH为7.0后灭菌，得到SOB培养基。
[0030]每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液10 μ L。
[0031]本实施方式中，5mL的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液50 μ L。
[0032]37°C振荡的操作中，转速为220rpm。
[0033]S20、取500 μ L SlO中得到的培养液接种于50mL的加入了 MgCl2溶液的SOB培养基中，37°C培养约3h，使培养液的吸光值OD(A6tltl)为0.4~0.6。
[0034]本实施方式中，50mL的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液500 μ L。
[0035]采用添加了 Mg2+的SOB培养基代替传统的LB培养基培养细菌，由实验可知，用SOB培养基比LB培养基能提高感受态细胞的转化效率。[0036]将500 μ L培养液接种于含有50mL的SOB培养基中，I: 10体积充分保证了培养基的溶氧量，保证细菌良好的生长状态，有利于提高制得的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。
[0037]S30、将S20中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴lOmin，接着4°C下4000rpm 离心 lOmin。
[0038]S40、将S30得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置lOmin，接着4°C下4000rpm离心10min。
[0039]每20mL的TB转化缓冲液由如下成分组成:
[0040]12.5mL 的双蒸水、4mL 的 lmol/L 的 KC1、2.4mL 的 0.45mol/L 的 MnCl2、0.5mol/L 的CaCl20.6mL 和 0.5mL 的 0.5mol/L 的 K-MES 缓冲液。
[0041]0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下:
[0042]称取9.76g MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸)完全溶解于80mL的双蒸水中，用Imol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到IOOmL,过滤灭菌后保存于_20°C，得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。
[0043]TB转化缓冲液 最好采用新鲜配制的，从而使得制得的大肠杆菌感受态细胞转化效
率较高。
[0044]S50、将S40得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7%。
[0045]加入了 7%的DMS0，有利于提高制得的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。
[0046]S60、将S50得到的悬液在冰上放置IOmin后分装到预冷的无菌EP管中，得到大肠杆菌感受态细胞。
[0047]得到的大肠杆菌感受态细胞可以在液体氮中至少放置Ih后保存于_80°C中。
[0048]这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37°C摇床中培养即可，没有设备要求的限制，既适用于一般实验室的制备，也可用于商业化生产。与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。
[0049]具体实施例。
[0050]实施例1
[0051]将_80°C冷藏的细胞(保存于LB+70% DMSO)融化后划线接种于LB平皿中，37°C培养过夜；挑单菌落于5mL SOB培养基中，SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液50 μ L，37°C，220rpm 振荡培养 12h ~16h。
[0052]取500 μ L培养液接种于50mL SOB培养基中(500mL锥形瓶瓶)，SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液500 μ L (20mM),于37°C培养约3h，使培养液的吸光值OD(A600)为0.4 ~0.6。
[0053]菌液转移至50mL无菌离心管，在冰上放置冰浴lOmin，于AUOOOrpm离心IOmin0
[0054]去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置10min，4°C，4000rpm 离心 lOmin。
[0055]将沉淀重悬于4mL预冷的新配的TB转化缓冲液中，再加入280 μ L DMSO,然后轻摇使混匀，使其体积浓度为7%。[0056]冰上放置IOmin后分到约40个提前预冷的500 μ L无菌EP管中(100 μ L/个)，得到大肠杆菌感受态细胞。
[0057]得到的大肠杆菌感受态细胞可以在液体氮中至少放置Ih后保存于_80°C中。本实施例制备的大肠杆菌感受态细胞保存半年后，转化效率为90%。
[0058]对比例I
[0059]CaClJi制备大肠杆菌感受态细胞。
[0060]将_80°C冷藏的细胞(保存于LB+70% DMS0)融化后划线接种于LB平皿中，37°C培养过夜；挑取单克隆于含3mL LB液体培养基的试管中，于37°C、220rpm振荡培养过夜。
[0061]取ImL菌液接种至含有IOOmL LB液体培养基的试管中，于37°C，220rpm振荡培养至 0D600 为 0.4 ~0.6。
[0062]取50mL菌液转入50mL离心管中，冰上放置lOmin。
[0063]于4°C,4000rmp离心10min收集菌体，弃培养基，用移液器吸尽培养基。
[0064]加入IOmL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，于4°C，4000rmp离心10min，收集菌体。
[0065]移液器吸尽CaCl2溶液，每管加入4mL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬菌体，得到大肠杆菌感受态细胞。
[0066]对比例2
[0067]RbCl/KCl法制备大肠杆菌感受态细胞.[0068]首先配置两种缓冲液TFB I和TFB II。TFB I缓冲液含:30mmol/L KAcUOOmmol/L RbClUOmmol/L CaCl2、50mmol/L MnCl2、15% 甘油。TFB II 缓冲液含:10mmol/L MOPS、75mmol/L CaCl2、lOmmol/L RbCl、15% 甘油。
[0069]其具体制备方法如下:
[0070]将_80°C冷藏的细胞(保存于LB+70% DMS0)融化后划线接种于LB平皿中，37°C培养过夜；挑取细菌单克隆于5mL LB培养基中，37°C，220rpm振荡过夜培养。
[0071]按I: 100比例接种细菌培养液至IOOmL LB培养基中(含20mmol/L MgSO4),剧烈振荡2~3h，OD值约为0.4， 于4°C，2800r/min离心15min收集细菌。
[0072]用40mL冰预冷的TFB I重悬细菌,冰上孵育25min, 4°C、2800r/min离心15min收集细菌。
[0073]用4mL冰预冷的TFB II重悬细菌，冰浴15~60min后，100 μ L/管分装，_80°C贮存备用，得到大肠杆菌感受态细胞。
[0074]对比例3
[0075]Inoue法制备大肠杆菌感受态细胞。
[0076]配制Inoue转化缓冲液，其配制方法为:100mL双蒸水中溶解PIPES 1.51g,MnCl.4H20 1.088g, CaCl2 0.166g, KCl 1.865g,调节 pH 到 6.7 即可，过滤灭菌。
[0077]将_80°C冷藏的细胞(保存于LB+70% DMS0)融化后划线接种于LB平皿中，37°C培养过夜；从LB固体培养基上挑取单菌落，接种于5mL液体LB中，于37°C、220rpm振荡培养24h左右；按1:100比例接种至Ij 300mL SOB培养液中，于18°C、220rpm过夜培养，次日测细菌培养液0D600达到0.5-0.55即可。
[0078]菌液分装到50mL离心管，冰浴IOmin,于4°C、2500g离心10min收集菌体。[0079]弃上清,加5mL预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体,将重悬液合并至一支50mL离心管中，添加Inoue转化缓冲液至50mL,冰浴5min,于4°C、2500g离心10min。
[0080]弃去上清，加入24mL Inoue转化缓冲液和1.8mL DMSO重悬细菌，冰浴lOmin，得到感受态细胞。
[0081]实施例2
[0082]转化效率对比试验。
[0083]分别取I μ L的PUC19质粒DNA (本实验室保存)并分别加入100 μ L实施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混合后冰浴35min。
[0084]42 °C热休克45s，然后迅速置冰浴冷却5min，加入900 μ L的LB培养基，37 °C，150rpm振荡培养45min,使大肠杆菌复苏并表达抗性蛋白。
[0085]取100 μ L菌液稀释1000倍后取100 μ I涂布于相应的LB琼脂培养基。37°C倒置培养12h~16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。
[0086]本实施例重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率，结果如下表所示:
【权利要求】
1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、将-80°C冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37°C培养过夜后挑取单菌落于5mL的加入了 MgCl2溶液的SOB培养基中，37°C振荡培养12h~16h ； 步骤二、取500 μ L步骤一中得到的培养液接种于50mL的加入了 MgCl2溶液的所述SOB培养基中，37°C培养约3h，使培养液的吸光值OD (A600)为0.4~0.6 ; 步骤三、将步骤二中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴lOmin，接着4°C下4000rpm 离心 10min ； 步骤四、将步骤三得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置lOmin，接着4°C下4000rpm离心10min ； 步骤五、将步骤四得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7% ； 步骤六、将步骤五得到的悬液在冰上放置IOmin后分装到预冷的无菌EP管中，得到所述大肠杆菌感受态细胞。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述SOB培养基的配制过程如下: 将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186g KCl溶解在双蒸水中至lOOmL，调节pH为7.0后灭菌，得到所述SOB培养基。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，每20mL的所述TB转化缓冲液由如下成分组成:
12.5mL 的双蒸水、4mL 的 lmol/L 的 KC1、2.4mL 的 0.45mol/L 的 MnCl2、0.5mol/L 的 CaCl20.6mL 和 0.5mL 的 0.5mol/L 的 K-MES 缓冲液。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下: 称取9.76g MES完全溶解于80mL的双蒸水中，用lmol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到IOOmL,过滤灭菌后保存于_20°C，得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中和步骤二中，每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液10 μ L。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的体积浓度为70%。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述37 °C振荡的操作中，转速为220rpm。
8.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤四和步骤五中，所述TB转化缓冲液为新鲜配制的。
【文档编号】C12N1/20GK103897994SQ201210567056
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】万晓春, 陈凤莲, 赵琦, 李华顺 申请人:深圳先进技术研究院