高浓度颗粒淀粉的液化和糖化的制作方法

高浓度颗粒淀粉的液化和糖化的制作方法
【专利摘要】本发明的教导内容提供加工包含高干固体含量的浆料中的颗粒淀粉的方法。使用酶在等于或低于糊化温度下将所述浆料初始温育。以特定剂量使用支链淀粉酶和葡糖淀粉酶，这允许在低能耗下提高葡萄糖产率。
【专利说明】高浓度颗粒淀粉的液化和糖化
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求提交于2011年9月29日的美国临时申请N0.61/541，031的权益，该申请全文以引用方式并入。
【背景技术】
[0003]将不溶性颗粒淀粉转化为葡萄糖或其他可溶性糊精是获得最终产物和生物燃料行业的重要大规模工艺，所述最终产物例如糖甜味剂、专用糖浆、酶、蛋白质、醇(如，乙醇、丁醇)、有机酸(乳酸、琥珀酸、柠檬酸)和专用生物化学品例如氨基酸(赖氨酸、谷氨酸单钠)和1，3-丙二醇。淀粉颗粒的部分晶体性质赋予其在冷水中的不溶性。淀粉颗粒在水中的增溶需要大量热能来破坏晶体结构。用于溶解颗粒的水越多，则加热水所需的能量越多。在后续的糖化之后，蒸发水也需要更多的能量。
[0004]可通过直接或间接加热系统进行溶解，例如通过蒸汽喷射直接加热。(参见例如Starch Chemistry and Technology, eds R.L.Whistler et al., 2nd Ed., 1984AcademicPress Inc., Orlando, FL (《淀粉化学和技术》，R.L.Whistler等人编辑，第2版，1984年，学术出版社公司，佛罗里达州奥兰多)和Starch Conversion Technology, Eds.G.M.A.VanBeynum et al., Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc., NY (《淀粉转化技术》，G.M.A.Van Beynum等人编辑，“食品科学与技术系列”，马塞尔.德克尔公司，纽约州))。典型的常规淀粉液化系统在高压下将水性淀粉浆料递送到直接蒸汽喷射蒸煮器，该蒸煮器使浆料温度从约35 - 40°C升至107 - 110°C。浆料通常包含热稳定α淀粉酶，在该情况下，调整PH以促 进α淀粉酶。湿磨得到的颗粒淀粉通常具有40至42%的干固体含量。在加热至高于液化温度之前，通常将浓度稀释到32%至35%的干固体。如果没有该稀释和随后粘度降低，高温喷射蒸煮单元操作系统的进料泵就不能处理浆料。
[0005]上述常规工艺的替代形式已有所描述，其中粘度过大的问题通过使颗粒淀粉浆料加热至不高于液化温度而避免(参见，例如US7，618，795和US20050136525)。相反，颗粒淀粉通过低于液化温度的酶水解而增溶。此类“低温”系统能够加工比常规系统更高浓度(如，最多至45%)的干固体已有所报道。然而，非蒸煮系统的缺点是在适当高温下，相对长的温育(约24小时或更长)对于基本上完全增溶是必需的。长时间温育本身与高能耗相关。
[0006]由于颗粒淀粉加工是大规模进行，即使看似很小的效率提高也可具有很大的经济优势。然而，已对转化工艺进行充分分析来识别和进行此类提高(参见，例如Martin&Brummat pp.45_77in “Starch Hydrolysis Products:Worldwide Technology, production andapplications New York, VCH Publishers, Inc.1992(Martin 和 Brumm,第 45 - 77 页，《淀粉水解产物:世界技术、生产和应用》，纽约，VCH出版公司，1992年)和Luenser，Dev.1n Ind.Microbiol.24.79-96(1993) (Luenser,《工业微生物学发展》，第 24 卷，第 79 - 96 页，1993年))。

【发明内容】
[0007]本发明提供加工颗粒淀粉的方法，所述方法包括:(a)使颗粒淀粉、水和一种或多种颗粒淀粉水解酶，包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，接触以生成浆料，所述颗粒淀粉水解酶包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，其中干固体的浓度大于38重量％，(b)在高于40°C并且在等于或低于颗粒淀粉的糊化温度的温度下温育浆料至少五分钟，生成其中颗粒淀粉已通过一种或多种酶部分地水解为寡糖和/或单糖的组合物；以及(C)将部分地水解的组合物的温度提升并保持高于颗粒淀粉的糊化温度，生成液化组合物。
[0008]一些方法还包括(d)使液化组合物与支链淀粉酶和葡糖淀粉酶接触并且温育以生成葡萄糖。在一些方法中，在步骤(b)中温育足够长的时间，使得步骤(b)结束时不溶性干固体的浓度不超过38重量％。在一些方法中，2 - 30%的干固体在步骤(b)结束时是可溶的。在一些方法中，干固体的百分比在步骤(a) - (d)期间为至少39%。在一些方法中，干固体的浓度在步骤(a)_ (d)期间为39 - 45重量％。在一些方法中，干固体的百分比在步骤(a)和(d)之间保持相同或增加。在一些方法中，在步骤(b)、(c)和(d)期间向浆料加入不超过10重量％的水。在一些方法中，在步骤(b)、(c)和(d)期间不再向浆料加入水。在一些方法中，一种或多种酶包括α淀粉酶。在一些方法中，α淀粉酶是芽孢杆菌α淀粉酶。在
一些方法中，α 淀粉酶是 SPEZYMEk' ΑΑ、SPEZYME" XTRAu、SPEZYME? FRED,
GYZME? G997、TERMAMYL?、120-L、LC、SC、SUPRA 或Fuelzyme?。在一些方法中,
一种或多种酶包括至少两种类型的α淀粉酶。在一些方法中，α淀粉酶是热稳定的，并且在步骤(C)中保持活性。
[0009]在一些方法中，步骤(b)中的温度为55 - 67°C。在一些方法中，在步骤(b)中的温育达5分钟至四小时。在一些方法中，步骤(c)的温度为90-110°C。在一些方法中，组合物保持在90 - 110°C达5分钟至4小时。在一些方法中，组合物保持在100- 110°C达5-20分钟，并且保持在90 - 100°C达1- 2小时。在一些方法中，步骤(d)中支链淀粉酶与葡糖淀粉酶的比率按单位计为至少9:1。在一些方法中，步骤(d)在40 - 80°C的温度下进行。在一些方法中，步骤(d)进行20 - 150小时。在一些方法中，葡萄糖的产率为至少95重量％的颗粒淀粉。在一些方法中，葡萄糖的产率为95 - 96重量％的颗粒淀粉。在一些方法中，一种或多种酶包括α-淀粉酶，并且方法还包括在步骤(c)之后使α淀粉酶失活。
[0010]在一些方法中，α淀粉酶的失活通过加热或酸处理进行。在一些方法中，在步骤Ca)之后不添加酸或碱来改变pH。在一些方法中，在步骤(b)、(c)和(d)期间pH在4.9和
5.5之间。在一些方法中，在步骤(d)期间或之后进行不超过一次蒸发步骤，以浓缩葡萄糖。[0011 ] 在一些方法中，步骤(d)中的支链淀粉酶来自芽孢杆菌，并且葡糖淀粉酶来自黑曲霉或灰腐质霉。在一些方法中，支链淀粉酶和葡糖淀粉酶作为共混物被提供。
[0012]在一些方法中，颗粒淀粉通过湿磨制得。在一些方法中，颗粒淀粉是小麦、大麦、玉米、裸麦、稻米、高粱、豆类、木薯、粟、马铃薯、甘薯或木薯的颗粒淀粉。
[0013]在一些方法中，一种或多种酶是一种或多种α淀粉酶，并且方法还包括允许液化组合物冷却，从而步骤(a)的一种或多种α淀粉酶或一种或多种新鲜α淀粉酶将液化组合物中的淀粉水解为寡糖，生成麦芽糖糊精组合物。在一些方法中，允许液化组合物冷却包括在高于大气温度和低于步骤(c )温度的温度下温育液化组合物。
[0014]在一些方法中，颗粒淀粉在一个温度范围糊化，并且步骤(b)中的温度低于所述范围的低限。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1:本发明的淀粉液化工艺的流程图比较
[0016]图2:在60°C下干物质对不含添加α淀粉酶的浆料的影响。
[0017]图3:使用45%干固体玉米淀粉底物时，颗粒淀粉的部分增溶和水解对糊化温度下峰值粘度的影响。
[0018]定义
[0019]除非另外指明，否则所用的所有技术和科学术语在相关科学领域有其普遍含义。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., JohnWiley and Sons, New York(1994) (Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》,第2版，约翰威立父子出版公司，纽约，1994年)和Hale&Markham, Harper Collins Dictionaryof Biology, Harper Perennial, NY (1991) (Hale 和 Markham,《哈拍柯林斯生物学词典》，哈珀永久出版社，纽约州，1991年)提供了描述本发明的多个术语的普遍含义。
[0020]“淀粉”是指包括植物的复合多糖碳水化合物的任何材料，所述复合多糖碳水化合物包括具有式(C6HltlO5) x的直链淀粉和/或支链淀粉，其中X为任何数字。具体地讲，该术语指任何基于植物的材料，例如谷物、草、块茎和根，更具体地讲，指小麦、大麦、玉米、裸麦、稻米、高粱、豆类、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯。
[0021]“颗粒淀粉” 是指未蒸煮的(生的)淀粉，其未进行糊化。
[0022]“淀粉糊化”是指淀粉分子增溶而形成粘性悬浮液。
[0023]“糊化温度”是包含底物的淀粉糊化开始的最低温度。糊化的确切温度取决于具体的淀粉，并且可根据多个因素变化，例如植物物种以及环境和生长条件。多种颗粒淀粉的初始淀粉糊化温度范围可根据本文的工艺使用，其包括大麦(52 - 59 °C )、小麦(58 - 64°C)、裸麦(57 - 70°C)、玉米(62 - 72°C)、高直链淀粉玉米(67 - 80°C)、稻米(68 -77°0、高粱(68 - 77°0、马铃薯(58 - 68°0、木薯淀粉(59 - 69°0 和甘薯(58 - 72 °C)(Swinkels, pg.32-38in STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds Van Beynum et al., (1985)Marcel Dekker Inc.New York (Swinkels,第 32 - 38 页，《淀粉转化技术》，Van Beynum 等人编辑，1985年，马塞尔?德克尔公司，纽约)和The Alcohol Textbook3.sup.rd ED.AReference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacqueset al., (1999)Nottingham University Press, UK (《醇教科书:饮料、燃料和工业酒精行业参考》，第3版增补，Jacques等人编辑，1999年，诺丁汉大学出版社，英国))。糊化涉及结晶区的熔化、分子的水合以及颗粒的不可逆溶胀。对于给定的颗粒，糊化温度发生在一定范围内，因为结晶区的大小和/或分子有序性或晶格完整程度不同。STARCH HYDROLYSISPRODUCTS Worldwide Technology,Production, and Applications(eds/Shenck andHebeda, VCH Publishers, Inc, New York, 1992) at p.26(《淀粉水解产物:世界技术、生产和应用》，Shenck和Hebeda编辑，VCH出版公司，纽约，1992年，第26页)。
[0024]“DE”或“右旋糖当量”是总还原糖的浓度的行业标准，并且以按干重计的D-葡萄糖％表示。非水解的颗粒淀粉的DE几乎为0，而D-葡萄糖的DE为100。
[0025]“葡萄糖浆”是指包含葡萄糖固体的水性组合物。葡萄糖浆具有大于20的DE。一些葡萄糖浆包含不超过21%的水和以右旋糖计算不少于25%的还原糖。一些葡萄糖浆包括至少90%的D-葡萄糖或至少95%的D-葡萄糖。有时术语葡萄糖和葡萄糖浆可互换使用。
[0026]“淀粉的水解”是加入水分子切割糖苷键。
[0027]“浆料”是水中包含不溶性淀粉颗粒的水性混合物。
[0028]术语“总糖含量”是指包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中存在的总糖含量。
[0029]术语“干固体”(ds)是指溶解于水的干固体、分散于水中的干固体或二者的组合。因此干固体包括颗粒淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。
[0030]“干固体”含量是指相对于其中分散和/或溶解干固体的水的以重量百分比计溶解的和分散的干固体的百分比。初始干固体含量为根据含水量折算的颗粒淀粉的重量除以颗粒淀粉的重量加上水的重量。后续的干固体含量可由针对任何加入或损失的水和化学增益而调整的初始含量确定。后续的溶解干固体含量可由如下所示的折射率测量。
[0031 ] 术语“高DS”是指包含的干固体大于干固体加上水的38重量％的水性淀粉浆料。
[0032]“干物质淀粉”是指颗粒淀粉的干淀粉含量，并且可通过颗粒淀粉的质量减去水的任何贡献而确定。例如，如果颗粒淀粉具有20%的水含量，则IOOkg颗粒淀粉具有80kg的干淀粉含量。干物质淀粉可用于确定要使用的酶单位数。
[0033]“折射率干物质”(RIDS)是在已知DE、在控制温度下测定淀粉溶液的折射率，然后使用适当的关系，例如玉米提炼协会关键数据表(Critical Data Tables of the CornRefiners Association),将 RI 转换为干物质。
[0034]“聚合度(DP)”是指给定糖中脱水吡喃葡糖单位的数目(n)。DPI的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+ODP3)表示聚合度大于3的聚合物。
[0035]“接触”是指一种或多种酶和/或其他反应组分足够接近底物放置，使酶能够将底物转化为最终产物。可通过酶溶液与各自的底物组合或混合而实现接触。
[0036]“酶活性”是指酶对其底物的作用。
[0037]“淀粉的水解”是指加入水分子切割糖苷键。
[0038]“ α -淀粉酶(E.C.分类3.2.1.1) ”是催化α -1, 4_糖苷键水解的酶。这些酶也被描述成在含有1，4- α -连接的D-葡萄糖单位的多糖中实现1，4- a -D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4_葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α -1, 4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
[0039]“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(EC.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、α -1, 4_D_葡聚糖葡糖水解酶)，该酶从淀粉的非还原末端连续移除葡萄糖单元。该酶可同时水解淀粉的直链和支链糖苷键，即可同时水解直链淀粉和支链淀粉。该酶还水解α -1，6和α -1, 3_键，但速率比水解α-1，4_键慢得多。
[0040]“支链淀粉酶”也称为脱支酶(E.C.3.2.1.41、支链淀粉6_葡聚糖水解酶)，能够水解支链淀粉分子中的α-1,6-糖苷键。
[0041]“淀粉酶活性单位”(LU)是使碘溶液产生颜色变化所需的消化时间的量度，其指示实例I的淀粉底物在特定条件下糊精化的确切阶段(参见，例如US5，756，714)。
[0042]“最终产物”是任何碳源来源分子产物，其从颗粒淀粉底物酶促转化。优选地，最终产物是葡萄糖或葡萄糖浆。葡萄糖可用作其他所需最终产物的前体。[0043]“产率”是指所需一种或多种最终产物(如，葡萄糖)的量与起始颗粒淀粉的干重的百分比。
[0044]可通过使用算法，例如威斯康星遗传学软件包7.0版(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release7.0)(威斯康星州麦迪逊市575科学大道的遗传学计算机小组(Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI))中的 BESTFIT、FASTA 和TFASTA，使用默认空位参数，或通过检测和最佳比对(即，生成序列相似性与比较窗口的最高百分比)来比对序列而确定序列同一性。序列同一性的百分比通过如下方法计算:比较两个最佳比对序列除以较短序列(如果长度不相等)的长度，确定相同残基在两个序列中出现的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以匹配和不匹配位置的总数，不计算空位，将结果乘以100得到序列同一性的百分比。
[0045]术语“包含”及其同源词以其包括性的含义使用；也就是说，与术语“包括”及其相应的同源词等同。
[0046]数值范围包括限定该范围的数值。还列出了一些优选的子范围，但在任何情况下，提及范围包括该范围内包括的整数限定的所有子范围。
【具体实施方式】
[0047]1.概沭
[0048]本发明提供加工颗粒淀粉的方法。本发明部分地基于如下结果:使用一种或多种颗粒淀粉水解酶在相对低的温度下预处理颗粒淀粉，所述预处理基本上减少了后续的粘度和膨胀性(剪切增稠) ，当温度随后升高至高于糊化温度时，颗粒淀粉增溶而变得液化。与常规工艺相比，预处理产生显著更多的溶解颗粒淀粉，其中在加入酶后，颗粒淀粉的温度立即升高至高于糊化温度。然而，与在低温下进行的工艺完全不同的是，预处理留下很多不溶解的颗粒淀粉。虽然溶解的固体的最终量保持未变，但可获得非常显著的降低的粘度。即使少量预处理也允许在高于38%干固体的初始浓度下使用通用行业设备来加工颗粒淀粉。因此，通过本发明的方法，在40 - 42%干固体的典型浓度下，可在常规设备上加工从湿磨机接收的颗粒淀粉，而不必首先稀释。在增加浓度下进行加工，这减少了水量、热能以及加工给定量颗粒淀粉所需的试剂。对于颗粒淀粉的大规模加工，这些节省具有很大的现实意义。本发明的方法可加工的高浓度淀粉对于下游糖化也具有优势，因为可通过较少的加工(如，蒸发步骤)获得相同或更高的葡萄糖产率。使用支链淀粉酶和葡糖淀粉酶的适当共混物，可由高于38%的干固体的初始浓度实现95%或更高的葡萄糖产率。
[0049]I1.原料
[0050]加工所用的原料是颗粒淀粉。包含颗粒淀粉的植物材料可以得自以下来源:例如小麦、玉米、裸麦、高粱(蜀黍)、稻米、粟、大麦、黑小麦、木薯(木薯淀粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类例如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻米、蜀黍以及它们的组合。植物材料可包括杂交品种和基因修饰品种(如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物的任何部分均可用作植物材料，包括例如叶、茎、壳、皮、块茎、穗轴、谷粒等的植物部分。全谷物也可用作颗粒淀粉的来源。优选的全谷物包括玉米、小麦、裸麦、大麦、高粱以及它们的组合。优选地通过技术例如研磨(如锤磨或辊磨)、乳化技术、旋转脉动、分馏等减小全谷物的粒度。[0051]优选地通过湿磨玉米产生颗粒淀粉。典型的湿磨工艺始于干玉米粒，其经检查和清洁，移除了穗轴、谷壳和其他残渣。然后将玉米浸泡于含少量二氧化硫和乳酸的大槽中。这两种化学品在温水中经过24 - 48小时的浸泡时间帮助软化玉米粒。在此期间，玉米溶胀并且软化，弱酸条件解开了谷蛋白键以释放出淀粉。在浸泡之后，对玉米进行粗磨，使粗磨玉米和一些浸溃水通过分离器，其基本上允许微生物或轻质含油部分悬浮于混合物的顶部，并且被移除。纤维材料被筛出，然后使用大型离心机按密度分离颗粒淀粉和蛋白质。通常以按干重计约40 - 42%颗粒淀粉的浓度提供颗粒淀粉。可按照如下工艺原样使用浓度，或可通过稀释或过滤离心调整浓度，得到按干重计超过38%的任何所需浓度。
[0052]颗粒淀粉还包括来自干磨机的谷物粉,包括研磨全谷物或通过移除非淀粉级分例如果皮和微生物和蛋白质而纯化的各种级分。
[0053]HL转化工艺[0054]通过使颗粒淀粉、水和一种或多种颗粒淀粉水解酶接触而形成浆料。浆料的组分可以任何顺序组合。优选地，水和颗粒淀粉首先组合，然后加入酶。水通常为普通自来水，但可以是任何类型的水(如，直接来自天然来源的水、循环水例如蒸发冷凝水或蒸馏水)。水可加热到等于或接近预期温育温度，或在等于任何其他温度(如，大气温度)下来供应水，在该情况下，可供应热量，以使浆料达到预期温育温度。如按重量计与水的重量相比小于1:100的少量添加剂，例如酸、碱、盐或其他赋形剂，可组合到浆料中，以调整pH或者提高酶活性。此类组分可以作为水的组分添加或者组合到浆料中。pH优选地在4-6.5，更优选地在4.9-5.5的范围内。
[0055]当颗粒淀粉首先组合到浆料中时，以干固体重量:水加上浆料中的干固体的重量测得的颗粒淀粉的浓度大于38%。在此处，如本专利申请别处所用，根据其含水量(通常为约11%)来折算引入浆料的颗粒淀粉的实际重量。例如，如果45g具有含水量的颗粒淀粉与55g水混合，则干固体的浓度为45X0.89/100=40.05%。对除水之外的颗粒淀粉的任何非碳水化合物组分的干固体百分比的计算没有进行修正。虽然可存在一些蛋白质和脂质，但其重量与碳水化合物的重量相比可忽略不计。
[0056]任选地，按干固体百分比计的颗粒淀粉的初始浓度为至少38.5、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50%，任选地还小于65%、60%、55%或50%，包括上限和下限的所有排列。例如，初始浓度有时为 39 - 50%,39 - 45%,40 - 50% 或 40 - 45% 或 41 - 50% 或 41 - 45%或 42 - 50% 或 42 - 45%ο 优选地，初始浓度为 38.5 - 42,38.5 - 43,39 - 42,39 - 43。酶或浆料的任何其他微量组分的重量通常可忽略不计，并且在确定按水的重量计的颗粒淀粉的百分比时不需要予以考虑。最初，基本上无颗粒淀粉溶解于水中。但随着颗粒淀粉加工酶作用于颗粒淀粉，淀粉部分地水解为单糖和寡糖。单糖和寡糖是水溶性的并且溶解。
[0057]酶的量取决于酶的类型及其活性。通常，将含量为约0.01至5.0kg的热稳定α淀粉酶添加到公吨(MT)原料干固体，优选地约0.5至2.0kg干固体或约0.1至1.0kg干固体。如果使用的话，则可以与α淀粉酶所述相同的重量范围提供葡糖淀粉酶。例如，通常将含量在约0.01至1.0kg之间的SPEZYME? XTRA和SPEZYME? FRED (丹尼斯克.杰
能科(Danisco-Genencor))或其变体添加到公吨淀粉干固体。例如，可以按每公吨淀粉干固体约0.05至1.0kg之间的干固体、约0.1至0.6kg之间的干燥固体、约0.2至0.6kg之间和约0.4至0.6kg之间的SPEZYME? XTRA和SPEZYME? FRED的量来添加所述酶。
[0058]可对浆料进行搅拌，以增加水中颗粒淀粉的分散度，并且促进颗粒淀粉加工酶的作用。
[0059]选择浆料温育的温度，以促进颗粒淀粉加工酶在部分水解颗粒淀粉时的活性，但如果存在除水解产物溶解之外的颗粒淀粉的液化，则结果不显著。这可通过使用高于室温的温度，通常高于40°C，并且基本上不高于颗粒淀粉的液化温度来实现。优选地，温度高于40°C并且等于或低于颗粒淀粉的糊化温度。颗粒淀粉的糊化温度可根据制备和来源而变化，但通常在52 - 80°C的范围内。对于多个给定原料，糊化温度可以表示为52 - 80°C内的子范围(参见定义中提供的示例性范围)。在这种情况下，温育温度优选地等于或低于子范围的下限，或可等于或低于子范围的中点或上限。优选地，温育温度低于温度范围的下限，其中针对给定来源的颗粒淀粉发生糊化。
[0060]具有颗粒淀粉水解活性的一种或多种酶包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。包括α-淀粉酶是优选的。如果转化为麦芽糖糊精是所需的，则优选地不使用除α淀粉酶之外的酶。α淀粉酶优选地是热稳定的，使得其在浆料的温度升高至高于糊化温度时保持活性。一种或多种酶可包括相同类型的两种酶(如，两种不同来源的α-淀粉酶)，在这种情况下，按质量或单位计添加的酶量适用于酶的共混。如果存在不止一种具有颗粒淀粉加工活性的酶，则酶可以共混物形式提供或单独提供。
[0061]如此温育浆料的周期可取决于颗粒淀粉的浓度和酶的活性以及其他因素。其他情况相等时，颗粒淀粉越浓，则时间越长，而酶活性越大，则时间越短。酶活性继而依赖于组合到浆料中的酶的量和类型以及温育温度。温育的目的是获得颗粒淀粉的足够的部分水解和溶解，使得在无需无用的粘度增加的情况下即可液化浆料。然而，该阶段的过度温育和部分水解则是不必要的，因为 当温度升高超过糊化温度时，在后续步骤中会发生进一步水解和溶解。温育优选地在所用条件下进行足够长的时间，使得在以水的重量加上初始提供的颗粒淀粉的重量的百分比表示的温育条件下，剩余的不溶于水的淀粉浓度不超过38重量％。或者，温育可进行足够长的时间，使得至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%，以及任选地最多至25%、30%、40%或50%的颗粒淀粉干固体在温育条件下具有水溶性，包括上限和下限的所有排列。优选地，在温育条件下，温育提供2 - 30或5 - 30重量％的可溶性颗粒淀粉。
[0062]周期通常为至少五分钟，典型地5分钟至4小时。例如，浆料可温育至少10、20、30,60,120或180分钟，并且不超过4小时。浆料有时温育10分钟至2小时或20分钟至I或2小时或30分钟至I或2小时。温育也可进行更长时间，如最多至24小时或最多至48小时。
[0063]在颗粒淀粉进行足够的部分水解和溶解之后，所得的部分水解组合物的温度升高并且保持高于颗粒淀粉的糊化温度。对于其中糊化温度以范围(参见上文)表示的给定来源，温度优选地保持高于范围的上限，但也可保持高于范围的中点。可通过直接或间接加热来提升温度，例如使组合物流过加热线圈或通过蒸汽喷射。该步骤中所用的温度反映了多个考虑因素的平衡。温度越高，颗粒淀粉液化越迅速。然而，优选的是，温度不高至使颗粒淀粉水解活性完全失活。高于糊化温度的淀粉水解有时称为糊精化。
[0064]热稳定α淀粉酶可在该步骤中通过适当温度选择来保持活性。因此，例如通常将温度升高并且保持在至少80°C，更优选地至少90°C，但通常不超过120或110°C的温度下，持续至少5、10、30或60分钟，并且通常不超过3或4小时的时段。例如，可将温度升高并且保持在90- 110°C的范围内，持续5分钟至4小时、5- 120分钟、5-60分钟、10- 180分钟、10 - 120分钟、10 - 60分钟、20 - 180分钟、20 - 120分钟或20 - 60分钟的时段。有时，将温度升高并且保持在100 - 110°C，持续5-20分钟，然后降至90 - 100°C，持续60 - 120分钟。在该步骤中，颗粒淀粉继续由一种或多种酶部分地水解，假设酶仍然保持活性，并且还通过溶于水而被直接液化。无需预先水解的直接液化可一定程度地增加组合物的粘度。然而，由于液化之前通过酶进行了预先温育，所以粘度增加不超出可控水平。[0065]温育优选地继续直到颗粒淀粉基本上或完全被液化(如，至少95、96、97、98、98.5或优选地99%液化)。
[0066]后续加工取决于所需产物。如果要生产麦芽糖糊精组合物，则允许液化组合物冷却，并且任选地保持在用于液化的温度和大气温度之间的温度下。在该温度下的温育允许α -淀粉酶介导的进一步水解。α -淀粉酶可以是初始供应的酶(如果仍然有活性)，和/或可以是新鲜供应的酶。生成的麦芽糖糊精具有约3 - 19个葡萄糖单元的单体含量和3 - 20的DE值。可通过蒸发为干粉末来分离麦芽糖糊精。麦芽糖糊精在多种加工的食品中用作添加剂。
[0067]或者，如果要生产葡萄糖，则可使液化的组合物中任何剩余α -淀粉酶失活，因为由α淀粉酶作用而产生的寡糖与较长的淀粉分子相比，受葡糖淀粉酶作用的影响较少。可通过将温度升至超过1101:或通过在低温下酸处理(如，在951:下将pH降至4.2持续30分钟)来进行去活。
[0068]允许所得组合物在剩余α淀粉酶活性失活或不失活的情况下冷却，并且与新鲜酶混合，使现在液化的淀粉完全水解为葡萄糖。任选地，可将pH调整为适用于这些酶。5.5至6的pH对于一些酶是优选的。与组合物混合的酶包括至少支链淀粉酶和葡糖淀粉酶。两种酶优选地以支链淀粉酶与葡糖淀粉酶按单位计至少9:1的比率存在。比率可以为例如在以葡糖淀粉酶与支链淀粉酶按单位计1:9和1:50之间，例如在1:9和1:20或1:9和1:15之间。优选地以至少0.08GAU/g干物质淀粉(gdss)固体，例如在0.08 - 0.14GAU/gdss的范围内添加葡糖淀粉酶。由GAU单位乘以反映所需比率的因子(如1:9比率的因子为9)来计算支链淀粉酶单位。在从高于液化温度冷却后，组合物在适于酶活性的温度下温育，通常为40 - 800C >50 - 70°C或优选地55 - 60°C。继续温育，直到按起始颗粒淀粉的重量百分比计，葡萄糖产率为至少90%，并且优选地至少93%或至少95%或超过95%。产率优选地为93 - 96% (或更高)，有时为95 - 96%。实现此类产率的温育时间可变化，如至少5、20或20小时和最多100或150小时。
[0069]在获得令人满意的葡萄糖产率之后，可通过蒸发水来增加葡萄糖浆的浓度。由于初始使用的是较高浓度的颗粒淀粉，葡萄糖浆的干固体的浓度通常也高于前述方法中的浓度。结果，可通过不超过一个蒸发步骤来获得足够浓度的葡萄糖浆。
[0070]上述生成葡萄糖的工艺可概念化为四个步骤，其涉及形成浆料，使用一种或多种酶在相对低的温度下部分地水解浆料的颗粒淀粉，升高温度使颗粒淀粉液化，然后提供新鲜酶并且完成淀粉至葡萄糖的转化。如上所述，颗粒淀粉的初始浓度可高于38%干重。然后，颗粒淀粉及其寡糖和单糖水解产物(总称为干固体)的浓度在上述步骤期间可保持高于38%，而不存在无法控制的粘度增加。事实上，干固体的百分比可增加，因为一些水通过水解过程化学结合到固体(称为化学增益)和/或由于水通过蒸发损失。在一些方法中，干固体的百分比在上述步骤期间大于38、38.5、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50%。在一些此类方法中，干固体的百分比在上述步骤期间不超过65、60、55或50%。在一些方法中，干固体的百分比为至少38.5、39、40、41、42、43或44并且不超过45、50或55%，包括上限和下限的所有排列。优选地，干固体的百分比在上述步骤期间为38.5 - 45%或39 - 45%。可能的例外是加入少量酸或碱来调整PH，通常在上述步骤期间不必加入大量的水(如，聚集增加大于10重量％已经存在的水)。在一些方法中，在形成浆料之后不加入水。
[0071]因此，总体效率可超过那些常规工艺的效率，通过使浓度不超过38重量％的颗粒淀粉或通过不使颗粒淀粉加热到高于其糊化温度来避免无法控制的粘度，在该情况下，需要使用颗粒加工酶进行时间较长效率较低的温育。
[0072]图1是本发明方法的示例性实施例与前述报道的非蒸煮方法水解颗粒淀粉的比较。在每种情况下，使用具有颗粒淀粉水解活性的酶在低于液化温度的中等温度(即，55 -65°C)下温育溶于水的颗粒淀粉的初始浆料。然而，根据本发明方法的温育时间短得多(如，与20 - 120小时相比，缩 短为5分钟至4小时)。在本发明的方法中，温育可使2 - 30%的颗粒淀粉在5分钟至4小时内液化。低温方法根据温育的时间长度产生2 - 100%的液化，对于接近100%的溶解度，则需要约120小时的温育。
[0073]在非蒸煮方法中，通过离心和过滤来移除残余的未溶解淀粉。可通过工艺对未溶解的颗粒淀粉进行再次循环处理。对液化淀粉进行糖化。在本发明的方法中，随后将中等温度温育产生的组合物的温度升至高于液化温度，初始为103 - 110°C，然后为95°C。加热液化了颗粒淀粉。如果存在热稳定α-淀粉酶，则它继续水解颗粒淀粉。然后对溶解的颗粒淀粉进行糖化。
[0074]IV.具有颗粒淀粉水解活性的酶
[0075]具有颗粒淀粉水解活性的酶(GSHE)能够水解颗粒淀粉。此类酶可从真菌、细菌和植物细胞，例如芽孢杆菌(Bacillus sp)、青霉(Penicillium sp.)、腐质霉(Humicolasp.)、木霉(Trichoderma sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)和根霉(Rhizopus sp.)获得。这些酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或α _淀粉酶活性的酶(参见，Tosi et al, (1993) Can.J.Microbiol.39:846-855 (Tosi 等人，1993 年，《加拿大微生物学杂志》，第39卷，第846 - 855页))。
[0076]优选地，用于本发明方法的GSHE包括至少一种α淀粉酶。α淀粉酶是E.C.编号为E.C.3.2.1.1-3尤其是E.C.3.2.1.1的微生物酶。优选地，α淀粉酶是热稳定α淀粉酶。合适的α淀粉酶可以是天然存在的以及重组的和突变的α淀粉酶。任选地，α淀粉酶来源于芽孢杆菌属菌种。优选的芽孢杆菌属菌种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽抱杆菌(B.stearothermophilus)、迟缓芽抱杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)>凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens) (USP5, 763，385、USP5, 824，532、USP5, 958，739、USP6, 008，026和USP6，361，809)。特别优选的α淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢杆菌菌株。一些优选的菌株包括ATCC39709、ATCCl 1945、ATCC6598、ATCC6634、ATCC8480、ATCC9945A 和 NCIB8059。
[0077]具有α-淀粉酶活性的GSHE的另一个例子来源于曲霉菌株，例如泡盛曲霉(A.awamori)、黑曲霉、米曲霉(A.0ryzae)或白曲霉(A.kawachi)菌株，尤其是白曲霉菌株。任选地，来源于白曲霉的具有GSHE活性的酶与W005/118800和W005/003311的SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。
[0078]适用于本发明方法的市售α淀粉酶包括SPEZYMEx ΑΑ、SPEZYME" XTRA,
SPEZYME" FRED(酸稳定、低Ca、热稳定，来源于地衣芽孢杆菌)、GZYME?G997(热稳定、非基因修饰)(丹尼斯克的杰能科部门(Genencor A Danisco Division)^PTERMAMYLTM120-L、LC、SC和SUPRA地衣芽孢杆菌耐热α淀粉酶(诺维信(Novozymes))和FUELZYME"' LF(热稳定)(范恩尼姆(Verenium))。
[0079]作为另外一种选择或除此之外，可使用具有葡糖淀粉酶活性的GSHE。一种此类酶来源于灰腐质霉菌株，尤其是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermo idea)菌株(参见，USP4, 618，579)。任选地，来源于腐质霉的具有GSH活性的酶与W005/052148的SEQID NO: 3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。具有葡糖淀粉酶活性的GSHE的另一个例子来源于泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河内变种(A.awamori var.kawachi)菌株。任选地,来源于泡盛曲霉河内变种的具有GSH活性的酶与 W005/052148 的 SEQ ID NO: 6 的氨基酸序列具有至少 85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。具有葡糖淀粉酶活性的GSHE的另一个例子来源于根霉菌株，例如雪白根霉(R.niveus)或米根霉(R.0ryzae)。来源于清酒曲菌株雪白根霉的酶以商品名“CUC0NC”销售，或来源于根霉的酶以商品名GLUZYME销售。另一个可用的具有葡糖淀粉酶活性的 GSHE 是 SPIRIZYME?Plus (诺维信(Novozymes Α/S))。
[0080]具有葡糖淀粉酶活性的米根霉GSHE在Ashikari et al., (1986)Agric.Biol.Chem.50:957-964 (Ashikari等人，1986年，《农业生物学和化学》，第50卷，第957 - 964页)和USP4，863，864中有所描述。包括葡糖淀粉酶和增强活性的灰腐质霉GSHE混合物在Allison et al., (1992) Curr.Genet.21:225_229(Allison 等人，1992 年，《当代遗传学》，第21卷，第225 - 229页);W005/052148和欧洲专利N0.171218中有所描述。泡盛曲霉河内变种 GSHE 在 Hayashida et al., (1989) Agric.Biol.Chem53:923-929 (Hayashida 等人，1989年，《农业生物学和化学》，第53卷,第923 - 929页)中有所描述。Aspergillus shirousami葡糖淀粉酶 GSHE 在 Shibuya et al., (1990) Agric.Biol.Chem.54:1905-1914 (Shibuya 等人，1990年，《农业生物学和化学》，第54卷，第1905 - 1914页)中有所描述。
[0081]具有GSHE活性的酶还包括杂交酶，例如包含α -淀粉酶的催化结构域例如黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶或白曲霉α-淀粉酶的催化结构域和不同真菌α -淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉结合域例如白曲霉或灰腐质霉淀粉结合域的杂交酶。或者，具有GSHE活性的杂交酶可包括葡糖淀粉酶的催化结构域例如曲霉、篮状菌(Talaromyces sp.)、蜀葵(Althea sp.)、木霉或根霉的催化结构域和不同葡糖淀粉酶或α -淀粉酶的淀粉结合域。具有 GSH 活性的其他杂交酶在 W005/003311、W005/045018 ;Shibuya et al., (1992) Biosc1.Biotech.Biochem56:1674-1675(Shibuya等人，1992年，《生物科学、生物技术和生物化学》，第 56 卷，第 1674 - 1675 页)和 Cornett et al., (2003) Protein Engineeringl6:521-520(Cornett等人，2003年，《蛋白质工程》，第16卷，第521 - 520页)中有所公开。
[0082]V.糖化酶[0083]A.葡糖淀粉酶
[0084]一种或多种葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)可用作糖化酶(以及或代替用作液化酶)。相同的或不同的葡糖淀粉酶可用于作为液化的糖化。然而，对于液化，葡糖淀粉酶应对颗粒淀粉有活性，对于糖化，葡糖淀粉酶应对溶解的淀粉有活性。用于糖化的葡糖淀粉酶不需要对颗粒淀粉有活性。合适的葡糖淀粉酶包括由细菌、植物和/或真菌内源性表达的那些以及与宿主细胞(如，细菌、植物和/或真菌)异源的重组表达的葡糖淀粉酶。重组表达的葡糖淀粉酶可以是天然序列、突变序列或杂交序列。丝状真菌和酵母的多个菌株产生合适的葡糖淀粉酶。例如，可使用曲霉和木霉菌株产生的市售葡糖淀粉酶。杂交葡糖淀粉酶包括例如具有来自一个生物体的GA (如，篮状菌GA)的催化结构域和来自不同生物体(如，木霉GA)的淀粉结合域(SBD)的葡糖淀粉酶。接头可包括在淀粉结合域(SBD)或催化结构域中。
[0085]可使用的葡糖淀粉酶的例子包括黑曲霉Gl和G2葡糖淀粉酶(参见如Boel etal., (1984)EMBO J.3:1097 - 1102 (Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第 3 卷，第 1097 - 1102 页)；W092/00381、W000/04136 和 USP6, 352，851);泡盛曲霉葡糖淀粉酶(参见如W084/02921);米曲霉葡糖淀粉酶(参见如Hata et.al.，(1991)Agric.Biol.Chem.55:941-949 (Hata等人，1991年，《农业生物学和化学》，第55卷，第941 - 949页))和 Aspergillus shirousami (参见如 Chen et.al., (1996)Prot.Eng.9:499-505(Chen 等人，1996 年，《蛋白质工程》，第 9 卷，第 499 - 505 页)；Chen et al.(1995)Prot.Eng.8:575-582 (Chen等人，1995年，《蛋白质工程》，第8卷，第575 - 582页)；和Chen etal., (1994)Biochem J.302:275-281 (Chen 等人，1994 年，《生物化学杂志》，第 302 卷，第275 - 281页))。[083]。可使用的其他葡糖淀粉酶包括来自篮状菌菌株(如，埃默森篮状菌(T.emersonii)> T.leycettanus、T.duponti 和嗜热篮状菌(T.thermophilus)葡糖淀粉酶(参见如 W099/28488 ；USP N0.RE:32, 153 ；USP N0.4，587，215));木霉菌株(如，里氏木酶(T.reesei))，以及与 美国专利公开N0.2006-0094080中公开的SEQ ID N0:4具有至少约80%、约85%、约90%和约95%序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉菌株(如，雪白根霉和米根霉)；毛霉菌株和腐质霉菌株(如，灰腐质霉(参见如Boel et al., (1984)EMBO J.3:1097-1102(Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1097 - 1102页);W092/00381 ；W000/04136 ；Chen et al., (1996)Prot.Eng.9:499_505(Chen等人，1996年，《蛋白质工程》，第 9 卷，第 499 - 505 页);Taylor.et al., (1978) Carbohydrate Res.61:301-308(Taylor 等人，1978 年，《碳水化合物研究》，第 61 卷，第 301 - 308 页);USP.4，514，496 ；USP4, 092，434 ；USP4, 618, 579 Jensen et al., (1988)Can.J.Microbiol.34:218 - 223 (Jensen 等人，1988年，《加拿大微生物学杂志》，第34卷，第218 - 223页)和W02005/052148的SEQID NO: 3))。任选地，葡糖淀粉酶与W005/052148的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少约85%、约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%和约99%的序列同一性。可使用的其他葡糖淀粉酶包括得自罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)及其变体(参见如W004/111218)和青霉(参见如产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的那些以及根霉产生的三种形式的葡糖淀粉酶，即 “Glucl” (MW74, 000)、“Gluc2” (MW58, 600)和 “Gluc3” (MW61, 400)。用于本发明方
法的市售葡糖淀粉酶包括例如DISTILLASE? L-400、OPTIDEX? L-400和G ZYME?G9904X、GC480、G-ZYME480 (丹尼斯克美国公司，杰能科部门(Danisco US, Inc, GenencorDivision))、CU.CONC?(日本新日化公司(Shin Nihon Chemicals, Japan))、GLUCZYME (来自雪白根霉的清酒曲培养小麦麸皮的提取物)(日本天野制药公司(AmanoPharmaceuticals, Japan))(参见如 Takahashi et al., (1985) J.Biochem.98:663-671(Takahashi等人，1985年，《生物化学杂志》，第98卷，第663 - 671页))。
[0086]B.支链淀粉酶
[0087]这些酶通常由芽孢杆菌菌种分泌。例如Bacillus deramificans (美国专利N0.5, 817, 498 ;1998 年)、嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利N0.0063909)和长野芽抱杆菌(Bacillus naganoensis)(美国专利 N0.5，055，403)。商用
的具有支链淀粉酶活性的酶产生自例如芽孢杆菌菌种(商品名GP了IlVIA^x L-1000,来自
丹尼斯克?杰能科(Danisco-Genencor)的酸稳定支链淀粉酶和来自诺维信(Novozymes)的嗜酸普鲁兰芽胞杆菌Promozyme?支链淀粉酶)。巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)淀粉酶/转移酶(BMA):巨大芽胞杆菌淀粉酶能够将支链糖类转化为易被葡糖淀粉酶水解的形式(Hebeda et al., Starch/Starke, 40, 33-36 (1988) (Hebeda 等人,《淀粉与淀粉糖》,第40卷，第33 - 36页，1988年))。该酶在ρΗ5.5和75°C的温度下表现出最大活性(David etal., Starch/Starke, 39436-440 (1987) (David 等人,《淀粉与淀粉糖》，第 39 卷,第 436 - 440页，1987年))。该酶被克隆到基因工程的枯草芽孢杆菌中，并且在其中表达，以商业规模制备(Brumm et al., Starch/Starke, 43315-329 (1991) (Brumm 等人，《淀粉与淀粉糖》,第 43卷，第315 - 329页，1991年))。该酶以商品名MEGADEX?销售。
[0088]C.葡糖淀粉酶-支链淀粉酶共混物
[0089]葡糖淀粉酶和支链淀粉酶可单独或预包装为共混物供应。此类共混物以OPTIMax^ HDS 或 4060VHP 商购获得。OPTIMAX? HDS 为 20:80GAU:ASPU，并且
0PTIMAX4060VHP 为 40 单位 GAU 和 60 单位 ASPU。
[0090]SM
[0091]方法:
[0092]1.碳水化合物组合物的高压液相色谱(HPLC)测定
[0093]通过高压液相色谱法((美国加利福尼亚州富勒顿(Fullerton, California, USA)的Beckman System Gold32Karat)来测定寡糖反应产物的组合物,该方法配备有HPLC柱(Rezex RCM 钙型单糖柱(8%) (Rezex RCM-Mono sac char i de Ca+(8%)),保持在 80°C,配有折射率(RI)检测器(ERC-7515A,得自 Anspec 公司(The Anspec Company, Inc.)的 RI 检测器)。逆渗透(RO)水用作流动相，流速为0.6ml/分钟。将20μΙΑ0%溶液注入柱中。柱根据糖类的分子量进行分离。例如，标识DPl为单糖，例如葡萄糖；标识DP2为二糖，例如麦芽糖；标识DP3为三糖，例如麦芽三糖，以及标识“DP4+”为聚合度(DP)为4或更高的寡糖。
[0094]2.葡糖淀粉酶活性单位(GAU)
[0095]一个葡糖淀粉酶单位为在60°C和用20mM乙酸钠缓冲的pH4.3下，每小时从2.5%干物质可溶性里氏淀粉底物释放一克以葡萄糖计算的还原糖的酶量。
[0096]3.支链淀粉酶活性单位(ASPU)
[0097]一个酸稳定支链淀粉酶单位(ASPU)为在pH4.5和60°C的温度下，每分钟从支链淀粉释放一当量以葡萄糖计的还原力的酶量。
[0098]4.α淀粉酶活件(AAU)[0099]一个AAU的细菌α -淀粉酶活性为在60°C和用30mM乙酸钠缓冲的pH6.0下，每分钟从包含31.2mM氯化钙的5%干物质可溶性里氏淀粉溶液水解IOmg淀粉所需的酶量。
[0100]5.粘度测暈
[0101]对由于颗粒的溶胀和糊化而增加的淀粉粘度以及由于α淀粉酶而减少的粘度的测量，则使用Newport Instruments SUPER4粘度计进行自动化和微型化。该高度自动化的器械允许对升温速率和由此产生的水解进行精确控制，以用于评价和表征淀粉、淀粉酶，以及作为控制淀粉的蒸煮补充的各种技术。
[0102]实例I
[0103]42%干固体淀粉浆料的粘度研究及其与38%干固体淀粉浆料的比较
[0104]使用RVA Super4(瑞典胡丁厄(Huddinge Sweden)的Newport Scientif ic/PertenInstruments)进行一系列实验，以比较38%干固体淀粉衆料与42%干固体淀粉衆料的高温粘度曲线。还使用酶改性的42%干固体淀粉浆料进行比较，以比较峰值粘度。
[0105]本测试使用两种粘度测试曲线。第一种测试曲线用于测试在60°C下温育的38或42%干固体的淀粉浆料的粘度变化，在160rpm下经过30分钟温育期进行持续混合，不加入酶。所用的RVA项目设置为:步骤I)测试在30°C下开始，以160rpm混合，步骤2)温度保持在30°C下I分钟，步骤3)浆料在I分钟内加热到60°C，步骤4)浆料保持在60°C下以160rpm持续混合，以及步骤5)浆料冷却至30°C并且终止测试。
[0106]图2示出当浆料在60°C下温育30分钟，以160rpm混合，不加入任何酶时，粘度几乎呈指数级持续增加。 图3示出在30分钟温育期间使淀粉接触浓度增加的α淀粉酶将使浆料减少至小于200cP。
[0107]实例2
[0108]高干固体实验室级液化
[0109]1329g淀粉浆料的制备如下:在2升不锈钢烧杯中，将693g颗粒淀粉(88.15%干固体)加入636g水中，得到46.4%干固体。用碳酸钠将pH调整到5.7。将两升不锈钢烧杯悬浮于60°C水浴中，加热至60°C，持续搅拌。加入0.2GAU/gdss (0.3093g)和4AAU/gdss(0.1758g)。在20分钟处理之后，收集淀粉浆料样品，LC结果发现16%可溶，可溶性级分包含 43%DP1、18%DP2、8%DP3 和 31% 高级糖。
[0110]保持在60°C下30分钟后，将淀粉浆料泵入由两个悬浮于温控油浴中的延时线圈组成的实验室级蒸煮器。第一个线圈为预热线圈，停留时间约105秒，第二个线圈为主要蒸煮线圈，包含7-8分钟停留时间。测量温度并在蒸煮线圈的入口和出口对其进行控制。对于该测试，温度设置为108.6°C。在15psi的背压下保持系统中的温度，使用弹簧加载安全阀使蒸煮在>100°C下进行。使250ml蒸煮淀粉的等分试样保持在95°C，以模拟商业液化系统中的糊精化步骤。在30、60、90和120分钟测定DE0 DE发展速率为0.075DE/分钟，120分钟时DE为21.4。
[0111]使用0PTIMAX?HDS糖化酶向120分钟样品加入0.llGAU/gdss，其比率为20:80GA:ASPU,得自丹尼斯克?杰能科公司(Genencor A Danisco Company)。在不同时间收集样品，通过LC测试糖分布，结果在表1中示出。
[0112]在制备液化淀粉用于糖化时，通过RI确定DS为48%。由于来自水解的化学增益，糖化结束时由RI确定的最终干物质为52.1%。[0113]表1
【权利要求】
1.一种加工颗粒淀粉的方法，包括: (a)使颗粒淀粉、水和一种或多种颗粒淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，接触以生成浆料，其中干固体的浓度大于38重量％， (b)在高于40°C并且在等于或低于所述颗粒淀粉的糊化温度的温度下温育所述浆料至少五分钟，生成其中所述颗粒淀粉已通过所述一种或多种酶部分地水解为寡糖和/或单糖的组合物；以及 (c)将所述部分地水解的组合物的所述温度升高并且保持高于所述颗粒淀粉的所述糊化温度，以生成液化组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括(d)使所述液化组合物接触支链淀粉酶和葡糖淀粉酶并且温育以生成葡萄糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)中所述温育持续足够的时间，使得步骤(b)结束时不溶性干固体的浓度不超过38重量％。
4.根据权利要求1- 3中任一项所述的方法，其中2% - 30%的所述干固体在步骤(b)结束时是可溶的。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中干固体的百分比在步骤(a)- (d)期间为至少39%。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中干固体的浓度在步骤(a)- (d)期间为39重量％ - 45重量％。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述干固体的百分比在步骤(a)和(d)之间保持相同或增加。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中在步骤(b)、(c)和(d)期间向所述浆料加入不超过10重量％的水。
9.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中在步骤(b)、(c)和(d)期间不再向所述衆料加入水。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种酶包括α淀粉酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶为芽孢杆菌α淀粉酶。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶为SPEZYME?ΑΑ、SPEZYME k XTRA k、SPEZYME li FRED, GYZMEu G997、TERMAMYL l1、120-L、LC、SC、SUPRA 或Fuelzyme?。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种酶包括至少两种类型的α淀粉酶。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶是耐热的并且在步骤(c)中保持活性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述温度为55°C-67 V。
16.根据权利要求1- 15中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述温育持续5分钟至四小时。
17.根据任何前述权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中的温度为90°C-110°C。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物保持在90°C-110°C达5分钟至4小时。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物保持在100°C- 110°C达5 - 20分钟，并且保持在90°C - 100°C达1- 2小时。
20.根据权利要求2- 19中任一项所述的方法，其中步骤(d)中支链淀粉酶与葡糖淀粉酶的比率按单位计为至少9:1。
21.根据权利要求2-20中任一项所述的方法，其中步骤(d)在40°C-80°C的温度下进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(d)进行20- 150小时。
23.根据权利要求2-22中任一项所述的方法，其中葡萄糖的产率为至少95重量％的颗粒淀粉。
24.根据权利要求23所述的方法，其中葡萄糖的产率为95重量％- 96重量％的颗粒淀粉。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种酶包括α-淀粉酶，并且所述方法还包括在步骤(C)之后使所述α淀粉酶失活。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述α淀粉酶的所述失活是通过热处理或酸处理来进行。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后不加入酸或碱来改变所述pH。
28.根据权利要求2-27中任一项所述的方法，其中在步骤(b)、(c)和(d)期间所述pH在4.9和5.5之间。
29.根据权利要求2- 28中任一项所述的方法，其中在步骤(d)期间或之后进行不超过一个蒸发步骤来浓缩所述葡萄糖。
30.根据权利要求2- 29中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述支链淀粉酶来自芽孢杆菌，并且所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉或灰腐质霉。
31.根据权利要求2- 30中任一项所述的方法，其中所述支链淀粉酶和葡糖淀粉酶作为共混物被提供。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述颗粒淀粉通过湿磨来产生。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种酶是一种或多种α淀粉酶，并且所述方法还包括允许所述液化组合物冷却，从而步骤(a)的所述一种或多种α淀粉酶或一种或多种新鲜α淀粉酶将所述液化组合物中的淀粉水解为寡糖，生成麦芽糖糊精组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中允许所述液化组合物冷却包括在高于大气温度和低于步骤(C)温度的温度下温育所述液化组合物。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述颗粒淀粉在一个温度范围糊化，并且步骤(b)中的温度低于所述范围的低限。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述颗粒淀粉是小麦、大麦、玉米、裸麦、稻米、高粱、豆类、木薯、粟、马铃薯、甘薯或木薯的颗粒淀粉。
【文档编号】C12P19/14GK103842516SQ201280047663
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】S·H·李, J·K·舍蒂, B·A·斯托姆 申请人:丹尼斯科美国公司