氧化还原敏感的钙传感蛋白及其用途方法

氧化还原敏感的钙传感蛋白及其用途方法
【专利摘要】本文提供了组合物，其涉及在氧化条件下显示出显著减少的荧光的，并且在暴露于细胞间钙离子时，产生具有提高的信噪比的荧光信号的基因编码的钙指示剂蛋白的生产和用途，及其使用方法。
【专利说明】氧化还原敏感的钙传感蛋白及其用途方法
【技术领域】
[0001]本公开涉及组合物，其涉及在氧化条件下能够显示出显著减少的荧光的，并且在暴露于胞内钙离子时，产生具有提高的信噪比的荧光信号的基因编码的钙指示剂蛋白，及其使用和生产方法。
【背景技术】
[0002]钙(Ca2+)在细胞的生理学和生物化学中发挥重要作用。钙离子在几种重要的信号转导通路中作为第二信使，参与神经元中神经递质的释放以便于神经传导，介导所有肌细胞类型的收缩，并在生殖功能中发挥重要作用，使精子获能和精子活力以及卵子的机制能够预防多精入卵。此外，许多酶需要钙离子作为辅因子以正确行使功能。因此，对伴随着这些不同细胞和生理现象的胞内钙浓度的动态变化进行监测的方法在生物医学研究和药物开发上具有广泛的用途。
[0003]已经开发了两类Ca2+指示剂:小分子荧光染料和基因编码的钙指示剂(GECI)。小分子荧光染料，例如fura-2和fluo-3，在与钙结合时改变它们的荧光特性。它们的宽动态范围、高灵敏度和快速动力学使得它们成为非常受欢迎的工具。但是，染料不能靶向特定的细胞，并且染料加样可能引起细胞毒性。另一方面，GECIs提供了染料的替代选择，其能够通过简单地将信号肽与GECI蛋白融合，从而容易地针对任何亚细胞区室。此外，GECIs可以靶向生物活体的特定的细胞类型或组织，并且它们在靶细胞中的表达水平稳定持续数天至数月，从而可以进行长时间的延时拍摄实验。
[0004]单荧光蛋白GECIs含有一个环形重新排列的荧光蛋白，其荧光受到发色团环境中钙结合依赖性变化的调节。一种类型的单荧光蛋白GECI是GCamP，其由环形重新排列的增强GFP(cpEGFP)部分，钙结合蛋白钙调蛋白(CaM)，和被称为M13的Ca2+-CaM-结合肽组成(Nakai et al., Nature Biotech.，2001，19:137-41;Akerboom et al., 2009, J.Biol.Chem.，284:6455-64)。天然EGFP的发色团位于11-链的β -桶状结构桶状结构的中心，其保护发色团不接触大量溶剂。在GCamP传感蛋白的cpEGFP结构域中，EGFP原有的N-和C-末端通过连接肽连接在一起，并且通过在桶的一侧打开一个β -折叠产生新的N-和C-末端，导致发色团暴露于溶剂。Μ13和CaM结构域分别与cpEGFP新的N-和C-末端融合。在Ca2+-结合时，cpEGFP结构域上的人工开口被Ca2+_CaM/M13复合体部分堵塞，以保护发色团不接触溶剂，并且使得该发色团在荧光的、去质子化的形式中是稳定的。相反，apo-CaM结构域在缺乏钙的条件下将不与M13结合，导致由于接触溶剂而介导的cpEGFP发色团变暗。
[0005]虽然GECIs例如GCamP的开发和使用为研究者提供了有价值的工具，以检测胞内钙离子浓度的波动，但是现有的GECIs具有严重的缺陷，限制了其实际应用，例如低信噪t匕、温度灵敏度、次优的动 力学、非线性和低光稳定性。特别是，低信噪比是GCamP和其他GECIs的主要缺点。死亡细胞或受损细胞干扰钙特异性荧光信号的测量。作为坏死或程序性细胞死亡的结果，这些细胞经常表现出增加的胞内钙水平，因此它们的荧光能够增加背景荧光检测并降低使用GECIs进行的基于钙的检测的整体灵敏度。[0006]因此，所需要的是在胞内钙水平的测量过程中显示出提高的信噪比的GECI蛋白，特别是当检测中包括死亡的、垂死的、或受损的细胞时。
[0007]本说明书通篇引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如期刊文章)。为所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开通过引用被整体并入本文。
[0008]发明简沭
[0009]本文提供的本发明公开了，尤其是GCamP钙传感蛋白钙传感蛋白，在死亡的、垂死的或受损的细胞中通常所观察到的氧化条件下，其显示出减少的荧光，并且与未改造的GCamP钙传感蛋白相比具有总体上更高的信噪比。本发明另外提供了在检测中使用GCamP钙传感蛋白的方法，所述检测的目的是为了筛选能够调节(例如增加或减少)胞内钙浓度的化合物。
[0010]相应地，本文提供了分离的核酸，其包括编码钙传感蛋白的核苷酸序列，所述钙传感蛋白从N末端到C末端包括Ml3结构域、环形排列的绿色灭光蛋白结构域和钙调蛋白(CaM)结构域，其中在钙传感蛋白中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365，和/或T332和E348的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，其中氨基酸残基的位置对应于SEQ ID N0:1的位置，并且其中与还原条件下显示出的荧光水平相比，钙传感蛋白在氧化条件下显示出减少的荧光。在另一个方面，本文提供了包括本文所述的任何核酸的载体。在还另一个方面提供了包含本文所述的任何核酸或载体的分离的细胞。在一个方面，本文提供了包括本文所述的任何细胞的非人动物。在另一个方面，本文提供了包括本文所述的任何细胞的组织切片。
[0011]在另一个方面，本文提供了分离的钙传感蛋白，其包括的氨基酸序列从N末端到C末端包含M13结构域、环形排列的绿色荧光蛋白结构域和钙调蛋白(CaM)结构域，其中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365和/或T332和E348的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，其中氨基酸残基的位置对应于SEQ ID NO:1的位置，并且其中与还原条件下显示出的荧光水平相比，钙传感蛋白在氧化条件下显示出减少的荧光。
[0012]在还另一个方面，本文提供了用于筛选能够增加或减少细胞中胞内钙浓度的试剂的方法，所述方法包括:(i)使所述试剂与表达由本文所述的任何核酸编码的钙传感蛋白的细胞接触；以及(ii)确定荧光水平，其中荧光的增加表示所述试剂能够增加胞内钙浓度，荧光的减少表示所述试剂能够减少胞内钙浓度。
[0013]在另一个方面，本文提供了试剂盒，其包括以下各成分的一种或更多种:(i)本文所述的一种或更多种核酸，例如载体；(ii)本文所述的一种或更多种钙传感蛋白本文所述的一种或更多种细胞；(iv)本文所述的一种或更多种非人动物；(V)和/或本文所述的一种或更多种组织切片。
[0014]应当理解本文所述的各个实施方案的一个、一些或全部特征可以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对本领域技术人员来说将会变得显而易见。
[0015]附图简沭
[0016]图1描述GCaMP2的一级氨基酸序列的示意图，其说明结构域构成。示意图下方的插入符号示出结构域间连接肽的位置。
[0017]图2描述redoxGCamP钙传感蛋白的体外筛选。加入⑷10 μ M离子霉素或(B) 100 μ M乙酰胆碱并记录转染的ΗΕΚ293细胞的荧光变化。Fmax代表最大荧光信号疋0代表背景荧光信号。(C)转染的HEK293细胞在MOPS缓冲液中的粗裂解物分别在存在100 μ M DTT或100 μ M H2O2的条件下的荧光强度。(D)转染的ΗΕΚ293细胞在存在或不存在100 μ MH2O2的条件下用细胞死亡检测缓冲液处理30分钟后的荧光变化。 [0018] 图3描述转染的ΗΕΚ293细胞的粗裂解物分别在存在2mM CaCl2或IOmM EGTA的条件下的荧光激发和发射光谱(A-F:未转染、GCamP、N77C/Y95C、L134C/T E201C、T331C/T365C和 T332C/E348C)。激发光谱(300_500nm)在 520nm 检测，发射光谱(500_600nm)在 470nm激发。
[0019]图4描述用于表征redoxGCamP 钙传感蛋白的体外钙滴定实验的结果。
[0020]图5描述在可变钙、还原条件和氧化条件下测量分离的GCamP蛋白的荧光光谱的实验结果。(A)代表在525nm检测的激发光谱，而(B)代表在470nm激发的发射光谱。
[0021]图6描述在可变钙、还原条件和氧化条件下测量分离的N77C/Y95C redoxGCamP钙传感蛋白的荧光光谱的实验结果。(A)代表在525nm检测的激发光谱，而(B)代表在470nm激发的发射光谱。
[0022]图7描述在可变钙、还原条件和氧化条件下测量分离的L134C/T201C redoxGCamP钙传感蛋白的荧光光谱的实验结果。(A)代表在525nm检测的激发光谱，而(B)代表在470nm激发的发射光谱。
[0023]图8描述在可变钙、还原条件和氧化条件下测量分离的T331C/T365C redoxGCamP钙传感蛋白的荧光光谱的实验结果。(A)代表在525nm检测的激发光谱，而(B)代表在470nm激发的发射光谱。
[0024]图9描述在可变钙、还原条件和氧化条件下测量分离的T332C/E348C redoxGCamP钙传感蛋白的荧光光谱的实验结果。(A)代表在525nm检测的激发光谱，而(B)代表在470nm激发的发射光谱。
[0025]图10描述观察到的用GCamP或redoxGcamP 钙传感蛋白和5HT2a受体共转染的HEK293细胞的荧光强度。
[0026]详细描沭
[0027]本发明提供了，尤其是在氧化条件下能够显示出显著减少的荧光的基因编码的钙指示剂(GECI)，及其使用和生产方法。发明人已构建了一系列GCamP钙传感蛋白，与对氧化条件不敏感的GCamP钙传感蛋白相比，其具有总体上提高的信噪比。发明人鉴别了用半胱氨酸残基对取代GCamP嵌合蛋白的一级氨基酸序列的几个位点。不受理论的限制，相信那些半胱氨酸残基上的硫醇基在氧化条件下易于形成二硫键，那些二硫键的形成导致GCamP的三级和/或四级结构发生重要的构象变化，从而降低了蛋白发出荧光的能力。但是，在活细胞中通常观察到的还原条件下，相信替换的半胱氨酸的硫醇基保持质子化状态，因此防止对暴露于胞内钙时的突光发射或激发可能有负面影响的GCamP的任何结构破坏。
[0028]这些独特的钙传感蛋白可以在体外或在生物活体内靶向特定的细胞或组织，以测量胞内钙水平。而且，在使用胞内钙作为第二信使的细胞类型中表达的钙传感蛋白可被用于筛选能够通过与例如质膜结合蛋白受体(例如但不限于G蛋白偶联受体)的相互作用选择性改变胞内钙水平的化合物。
[0029]1.通用技术
[0030]本发明的实施将采取，除非另外指出，分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这在本领域技术范围内。这些技术在文献中有详细说明，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)，，，second edition (Sambrook et al., 1989) ; “Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”(M.J.Gait，ed.，1984) ; “Animal Cell Culture (动物细胞培养)”(R.1.Freshney, ed.，1987) ; “Methods in Enzymology (酶学方法)”(AcademicPress, Inc.) ; “Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验指南)，，(F.M.Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates) ; iiPCR: The PolymeraseChain Reaction (PCR:聚合酶链式反应)”，(Mullis et al., eds., 1994).Singleton etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物学和分子生物学词典)2nd ed., J.ffiley&Sons(New York, N.Y.1994), March, “Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure (高等有机化学反应、机理和结构)” 4th ed., Johnffiley&Sons (New York, N.Y.1992)和 “Neuronal Calcium Sensor Proteins (神经兀钙传感蛋白)，”NOVA Publishers, (Philippov&Koch, eds., 2006)为本领域技术人员提供了关于本申请中所使用的许多术语的一般指导。
[0031]II.定义
[0032]如本文所使用的，术语“蛋白质”包括多肽、肽、蛋白片段和融合蛋白。
[0033]如本文所使用的，“分离的”分子或细胞(例如分离的蛋白、分离的核酸或分离的细胞)是已被鉴别并从其天然环境的成分中分离和/或回收的。
[0034]术语“异源蛋白”指来源于与宿主细胞不同的生物体、物种或菌株的蛋白。在一些实施方案中，异源蛋白与在相同的天然宿主细胞中发现的野生型蛋白不同。
[0035]如本文所使用的，“核酸”指在单链或双链形式中共价结合在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0036]术语“重组核酸”指感兴趣的核酸，其不含有在作为所述感兴趣的核酸的来源的生物体中天然存在的基因组中位于所述感兴趣的核酸侧翼的一个或多个核酸(例如基因)。该术语因此包括，例如，整合到载体中、自主复制质粒或病毒中、或原核或真核生物的基因组DNA中的，或者以独立于其他序列的单独的分子(例如cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA片段)形式存在的重组DNA。
[0037]“异源核酸”指来源于与宿主细胞不同的生物体、物种或菌株的核酸。在一些实施方案中，异源核酸与在相同的天然宿主细胞中发现的野生型核酸不同。例如，编码在宿主细胞中转化的或整合到宿主细胞染色体中的钙传感蛋白的核酸是异源核酸。
[0038]如本文所使用的，“表达控制序列”指指导感兴趣的核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列可以是“天然的”或异源的。天然的表达控制序列来源于与被表达的基因相同的生物体、物种或菌株。异源表达控制序列来源于与被表达的基因不同的生物体、物种或菌株。“诱导型启动子”是受到环境或发育调节时被激活的启动子。
[0039]“可操作地连接”是核酸表达控制序列(例如启动子)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
[0040]“突变”包括确定的一级氨基酸序列中至少一个氨基酸的氨基酸缺失、氨基酸插入和氨基酸取代。在一些方面，一级氨基酸序列中一个或更多个氨基酸的突变可以导致由该氨基酸序列编码的蛋白质在细胞中具有改变的活性或表达水平。在其他方面，一级氨基酸序列中一个或更多个氨基酸的突变(例如保守突变)可能不会导致由该氨基酸序列编码的蛋白质在细胞中的活性或表达水平有实质变化。
[0041]氨基酸的“取代”指确定的一级氨基酸序列中的至少一个氨基酸成分被另一个氨基酸(例如半胱氨酸)替换。在一些方面，一级氨基酸序列中一个或更多个氨基酸的取代可以导致由该氨基酸序列编码的蛋白质在细胞中具有改变的活性或表达水平。在其他方面，一级氨基酸序列中一个或更多个氨基酸的取代(例如保守取代)可能不会导致由该氨基酸序列编码的蛋白质在细胞中的活性或表达水平有实质变化。
[0042]如本文所使用的，蛋白质或氨基酸序列的“氨基酸序列同一性百分比(%) ”指候选序列中与特定蛋白质或氨基酸序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在对序列进行比对并且如果需要的话，导入缺口，以达到最大百分比的序列同一性之后获得，同时不将保守取代视为序列同一性的一部分。为确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN?(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于测量比对的合适的参数，包括为了达到所比较序列全长上的最大比对所需要的任何算法。[0043]如本文所使用的，DNA或RNA序列的“核苷酸序列同一性百分比(%) ”指候选序列中与特定DNA或RNA序列中核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比，在对序列进行比对并且如果需要的话，导入缺口，以达到最大百分比的序列同一性之后获得，同时不将保守取代视为序列同一性的一部分。为确定核苷酸序列同一性百分比的目的进行的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于测量比对的合适的参数，包括为了达到所比较序列全长上的最大比对所需要的任何算法。
[0044]“嵌合蛋白”是包括来源于一种或更多种不同蛋白质的一个或更多个部分的蛋白质，例如GCamP嵌合蛋白。嵌合蛋白可以通过培养用编码该嵌合蛋白的核酸转染的重组细胞产生。
[0045]“G蛋白偶联受体(GPCR) ”指通过与G蛋白偶联从而介导信号转导的受体超家族的任何成员。一类影响胞浆钙水平的GPCR的一个实例是通过Gq类型的G蛋白发挥作用，其激活磷脂酶C(PLC)通路，导致磷酸肌醇水解产生两类不同的第二信使，即二酰甘油和肌醇磷脂。二酰甘油依次激活特定的蛋白激酶Cs (PKCs)，而肌醇磷脂(例如但不限于IP3)刺激钙从胞内库例如内质网、肌质网(肌细胞的)和/或线粒体移动。
[0046]除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的意义。
[0047]如本文所使用的，单数术语“一(a，an)”和“这(the) ”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。
[0048]本说明书通篇给出的每一最大数值限度包括每一较低的数值限度，如同该较低的数值限度在本文中明确记载一样。本说明书通篇给出的每一最小数值限度包括每一较高的数值限度，如同该较高的数值限度在本文中明确记载一样。本说明书通篇给出的每一数值范围包括落入该较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同该较窄数值范围在本文中全部明确记载一样。[0049]II1.本发明的组成
[0050]A.蛋白质
[0051]在一些方面，本文提供了分离的钙传感蛋白，其包括M13结构域、环形排列的绿色荧光蛋白(cpGFP)结构域和钙调蛋白(CaM)结构域，其中至少一对半胱氨酸残基被加入到钙传感蛋白的一级氨基酸序列中，并且其中与还原条件下显示出的荧光水平相比，所述钙传感蛋白在氧化条件下显示出减少的荧光。在该上下文中，术语“环形排列”(“cp”)指天然GFP的N-和C-末端连接起来(例如通过氨基酸连接肽序列连接起来)，并通过GFP氨基酸序列中的两个肽键的断裂产生新的N-和C-末端。正如图1所示出的示意图中所能观察到的，钙传感蛋白的CpGFP结构域包括第一 cpGFP结构域(天然GFP以前的C-末端)和第二 cpGFP结构域(天然GFP以前的N-末端)。
[0052]相应地，在一个方面，cpGFP结构域包括第一 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列的氨基酸残基149-238，和第二 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列的氨基酸残基1-144。在一个实施方案中，cpGFP结构域包括第一 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 12中示出的氨基酸序列的氨基酸残基148-237，和第二 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 12中示出的氨基酸序列的氨基酸残基1-143。参见Tsien，Annu.Rev.Biochem.(生物化学综述年刊)，1998,67:509-44的第513页中示出的氨基酸序列，其公开通过引用被整体并入本文。在一个实施方案中，cpGFP结构域包括第一 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 13中示出的氨基酸序列的氨基酸残基148-237，和第二 cpGFP结构域，其包括SEQ ID NO: 13中不出的氨基酸序列的氨基酸残基1-143 (Tsien, Annu.Rev.Biochem.(生物化学综述年刊)，1998，67:509-44的第513页)。
[0053]在另一个实施方案中，钙传感蛋白结构域的排列使得M13结构域位于CaM结构域和cpGFP结构域的C-末端。在一些实施方案中，钙传感蛋白结构域可以排列成M13结构域位于cpGFP结构域和CaM结构域的N-末端。在其他实施方案中，钙传感蛋白的GFP环形排列在SEQ ID NO: 11，12或13示出的氨基酸序列的氨基酸残基135-155之间的任何位置。在特定的实施方案中，GFP环形排列在SEQ ID NO: 11显示的氨基酸序列的氨基酸残基位置144 处。
[0054]在一些实施方案中，分离的钙传感蛋白还包括可选的标签(例如纯化标签)。用于分离和纯化所表达的蛋白质的蛋白纯化标签有许多，且是本领域中常用的。非限制性实施例包括组氨酸标签(His tag)、麦芽糖结合蛋白标签或谷胱甘肽标签。在一个实施方案中，蛋白纯化标签是包括至少六个组氨酸残基的组氨酸标签。在另一个实施方案中，蛋白标签含有蛋白酶识别位点，以使蛋白纯化标签能够从钙传感蛋白的其余部分上被除去。
[0055]在一些实施方案中，连接肽可以在环形排列的位点处被插入到cpGFP的一级氨基酸序列中。在一些实施方案中，环形排列的位点处的连接肽的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的任一种。在一个实施方案中，环形排列的位点处的连接肽的长度为6个氨基酸。在还另一个实施方案中，环形排列的位点处的连接肽包括氨基酸序列:G G T G GS(SEQ ID NO: 14)。在另一个实施方案中，连接肽可以被插入到可选的蛋白纯化标签和M13结构域之间。在一些实施方案中，可选的蛋白纯化标签和M13结构域之间的连接肽的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的任一种。在一个实施方案中，可选的蛋白纯化标签和M13结构域之间的连接肽的长度为3个氨基酸。在还另一个实施方案中，可选的蛋白纯化标签和M13结构域之间的连接肽包含氨基酸序列:M V D0在还另一个实施方案中，连接肽可以被插入到M13结构域和第一 cpGFP结构域之间。在一些实施方案中，M13结构域和第一 cpGFP结构域之间的连接肽的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的任一种。在其他实施方案中，M13结构域和第一 cpGFP结构域之间的连接肽的长度为2个氨基酸。在还另一个实施方案中，M13结构域和第一 cpGFP结构域之间的连接肽包括氨基酸序列:L E0在另一个实施方案中，连接肽可以被插入到第二 cpGFP结构域和CaM结构域之间。在一些实施方案中，第二 cpGFP结构域和CaM结构域之间的连接肽的长度为约1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10个氨基酸的任一种。在其他实施方案中，第二 cpGFP结构域和CaM结构域之间的连接肽包括氨基酸序列:TR。
[0056]在一些方面，向钙传感蛋白的一级氨基酸序列加入至少一对半胱氨酸残基可以采用以下形式:将半胱氨酸残基对插入到一级氨基酸序列中或者用半胱氨酸残基取代一级氨基酸序列中的残基对。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对半胱氨酸残基的任一种被插入到钙传感蛋白的一级氨基酸序列中或者替换其中至少两个氨基酸。在另一个实施方案中，所述一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对位于钙传感蛋白的cpGFP结构域中。在再另一个实施方案中，所述一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对位于钙传感蛋白的CaM结构域中。在另一个实施方案中，所述一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对位于钙传感蛋白的M13结构域中。在其他实施方案中，所述至少一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对的一个成员位于cpGFP结构域中，而另一个成员位于CaM结构域中。在另一个实施方案中，所述至少一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对的一个成员位于cpGFP结构域中，而另一个成员位于M13结构域中。在还另一个实施方案中，所述至少一个或更多个插入的或替换的半胱氨酸残基对的一个成员位于CaM结构域中，而另一个成员位于M13结构域中。
[0057]在一些方面，钙传感蛋白的一级氨基酸序列中的至少两个残基被至少两个半胱氨酸残基取代。在一个实施方案中，选自由N77/Y95、L134/T201、T365/T332和T332/E348组成的组的钙传感蛋白的一级氨基酸序列的一个或更多个氨基酸残基对的任意组合被半胱氨酸残基取代，其中氨基酸残基位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
[0058]在一些方面，钙传感蛋白包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID N0:l、2、3、4或5 中出示的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在另一个方面，钙传感蛋白包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的氨基酸残基36-451具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基36-451。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQID N0:3的氨基酸序列。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID N0:3的氨基酸残基36-451。在还另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID NO:4的氨基酸残基36-451。在再另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQ ID N0:5的氨基酸序列。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括SEQID NO: 5的氨基酸残基36-451。在另一个实施方案中，钙传感蛋白包括氨基酸序列，该氨基酸序列与 Souslova et al., BMC Biotechnology (BMC 生物技术)，2007，7:37 中公开的任何钙传感蛋白具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性,该文献的内容通过引用被整体并入本文。
[0059]在一些实施方案中，钙传感蛋白包括N77/Y95、L134/T201、T365/T332和/或T332/E348的约5个氨基酸残基内的一个或更多个半胱氨酸残基对的插入，其中氨基酸残基的位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
[0060]蛋白质的修饰，包括特定的氨基酸取代或插入，通过本领域熟知的方法进行。例如，可以通过编码钙传感蛋白的多核苷酸中核苷酸的位点特异性突变进行修饰，从而产生编码该修饰的DNA，并随后在重组细胞培养物中表达该DNA。在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代的技术也是本领域熟知的，例如引物突变和PCR突变。
[0061]本文所述的钙传感蛋白可以包括保守取代。保守取代如以下的“氨基酸取代表”所示，其标题词为“优选取代”。
[0062]氨基酸取代
[0063]
【权利要求】
1.分离的核酸，所述分离的核酸包括编码钙传感蛋白的核苷酸序列，所述钙传感蛋白从N末端至C末端包括M13结构域、环形排列的绿色荧光蛋白结构域和钙调蛋白(CaM)结构域， 其中所述钙传感蛋白中位于N77和Y95、L134和T201、T331和T365和/或T332和E348的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，其中所述氨基酸残基的位置对应于SEQID NO:1中的位置，并且 其中与在还原条件下显示出的荧光水平相比，所述钙传感蛋白在氧化条件下显示出减少的荧光。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述钙传感蛋白包括与SEQID NO:1具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的核酸，其中所述钙传感蛋白包括SEQID NO:2, SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
4.包括权利要求1-3任一项所述的核酸的载体。
5.如权利要求4所述的载体，其中所述载体是表达载体。
6.如权利要求3或权利要求4所述的载体，其中所述载体来源于细菌、病毒、粘粒、酵母或植物。
7.如权利要求3或权利要求4所述的载体，其中所述表达载体是病毒载体。
8.如权利要求7所述的载体，其中所述病毒载体选自由以下载体组成的组:AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体和慢病毒载体。
9.如权利要求4-8任一项所述的载体，其中所述载体是低拷贝载体或高拷贝载体。
10.包括权利要求1-3任一项所述的核酸的分离的细胞。
11.包括权利要求4-8任一项所述的载体的分离的细胞。
12.如权利要求10或权利要求11所述的细胞，其中所述细胞选自由动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞和酵母细胞组成的组。
13.如权利要求12所述的细胞,其中所述动物细胞是人细胞或非人细胞。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述人细胞是在细胞培养物中。
15.如权利要求12所述的细胞，其中所述非人细胞选自由啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞和非人灵长动物细胞组成的组。
16.如权利要求15所述的细胞，其中所述非人细胞是在细胞培养物或在非人动物中。
17.如权利要求13-16任一项所述的细胞，其中所述动物细胞是肌肉细胞、生殖细胞、神经细胞、癌细胞或内分泌细胞。
18.如权利要求17所述的细胞，其中所述肌肉细胞选自由平滑肌、骨骼肌和心肌组成的组。
19.如权利要求10-18任一项所述的细胞，其中编码所述钙传感蛋白的所述核酸被整合到所述细胞基因组中。
20.如权利要求10-19所述的细胞，所述细胞还包括一种或更多种质膜蛋白，所述质膜蛋白选自由G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、离子通道蛋白和离子泵蛋白组成的组。
21.如权利要求20所述的细胞，其中所述一种或更多种质膜蛋白是异源表达的或是内源表达的。
22.如权利要求20所述的细胞，其中所述细胞还包括位于载体上的或位于所述细胞基因组中的编码GPCR的核酸。
23.如权利要求22所述的细胞，其中所述GPCR选自由α-1肾上腺素受体(a1-AR)、尾加压素(UT)受体、5-ΗΤ2和5-ΗΤ6血清素受体、下视丘分泌素(食欲素)受体、组胺HI受体、缓激肽BI和Β2受体、蛙皮素ΒΒ2受体、Ρ2Υ嘌呤受体、乙酰胆碱受体、mGluR5谷氨酸受体、加压素V2和VI受体、血管紧张素AGTRl受体、胆囊收缩素CCKAR和CCKBR受体、内皮素ENDRA受体、胃饥饿素GHSRla受体、褪黑素MTNRl A受体、神经降压素NTSRl受体、血小板活化因子PTAFR受体、泌乳素释放肽受体PRLHR受体、G-偶联5-ΗΤ2、5_ΗΤ2Α、5_ΗΤ6和5-ΗΤ7血清素受体、G1-偶联GABA-BJiK Η3和mGluR2/4谷氨酸受体组成的组。
24.如权利要求10-14或19-23任一项所述的细胞，其中所述细胞是Hela细胞、KEK293细胞或人胚肾(HEK)细胞。
25.如权利要求24所述的细胞，其中所述细胞是KEK293细胞。
26.包含权利要求10-25任一项所述的细胞的细胞群。
27.包含权利要求10-25任一项所述的细胞的非人动物。
28.包含权利要求10-25任一项所述的细胞的组织切片。
29.分离的钙传感蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列从N末端至C末端包括Ml3结构域、环形排列的绿色荧光蛋白结构域和钙调蛋白(CaM)结构域， 其中位于N77和Y95、L134和T20UT331和T365和/或T332和E348的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，其中所述氨基酸残基的位置对应于SEQ ID ΝΟ:1中的位置，并且 其中与在还原条件下显示出的荧光水平相比，所述钙传感蛋白在氧化条件下显示出减少的荧光。
30.如权利要求29所述的钙传感蛋白，所述钙传感蛋白包括与SEQID NO:1具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求29所述的钙传感蛋白，所述钙传感蛋白包括SEQID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5示出的氨基酸序列。
32.—种筛选能够增加或减少细胞中胞内钙浓度的试剂的方法，所述方法包括: (i)使所述试剂与表达由权利要求1-3任一项所述的核酸编码的钙传感蛋白的细胞接触；以及 (?)确定荧光水平，其中荧光的增加表示所述试剂能够增加胞内钙浓度，并且荧光的减少表示所述试剂能够减少胞内钙浓度。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞选自由动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞和酵母细胞组成的组。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述动物细胞是人细胞或非人细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述人细胞是在细胞培养物中。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述非人细胞选自由啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞和非人灵长动物细胞组成的组。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述非人细胞是在细胞培养物或在非人动物中。
38. 如权利要求32-37任一项所述的方法，其中所述动物细胞是肌肉细胞、生殖细胞、神经细胞、癌细胞或内分泌细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述肌肉细胞选自由平滑肌、骨骼肌和心肌组成的组。
40.如权利要求32-39任一项所述的方法，其中所述细胞还包括一种或更多种质膜蛋白，所述质膜蛋白选自由G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、离子通道蛋白和离子泵蛋白组成的组。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述一种或更多种质膜蛋白是异源表达的或是内源表达的。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述核酸被整合到所述细胞基因组中。
43.如权利要求32-42任一项所述的方法，其中所述细胞是在细胞培养物中。
44.如权利要求32-42任一项所述的方法，其中所述细胞是在非人动物中。
45.如权利要求32-44任一项所述的方法，其中所述试剂是小分子化合物、抗体、蛋白质、抑制性核酸或其任意组合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述抑制性核酸选自由三链形成寡核苷酸、适体、核酶、短干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸和微小RNA(miRNA)组成的组。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述小分子化合物是来自于化学文库的化合物。
48.如权利要求32-47任一项所述的方法，其中所述方法是高通量方法。
49.包括下述一种或更多种物质的试剂盒: (i )权利要求4-9所述的一种或更多种载体； (? )权利要求29-31所述的一种或更多种钙传感蛋白； (iii )权利要求10-25所述的一种或更多种细胞； (iv )权利要求27所述的非人动物；和/或 (V )权利要求28所述的组织切片。
【文档编号】C12N15/79GK103958684SQ201280051540
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年3月19日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】刘杰, 蔡斌 申请人:瑞健生物医药（苏州）有限公司