多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

专利名称：多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。
背景技术：
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞，它在形态学、表观遗传学、全基因表达谱及分化潜能方面与胚胎干细胞(ESCs)极其相似，其优点是个体特异来源的iPS细胞能避免免疫排斥问题。同时iPS细胞生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题。科学研究等工作中需要多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞。

发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。本发明的技术解决方案是:一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是:包括下列步骤: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包装(I)转染前质粒的准备1.1重组质粒Pac I单酶切，37°C酶切2h ；1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质权浓度；(2)转染2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔
4.5X105个细胞，种于6孔板，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜；2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opt1-MEM培养液；2.3取2 μ g线性化的质粒加入250 μ I经37°C预热的Opt1-MEM中，混勻；2.4取5“ llipofectamine2000 加入 250μ I Opt1-ΜΕΜ 中，混匀，室温放置 5min ；2.5将500 μ I复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37°C，5%的CO2的培养箱中培养5-6小时后,换上完全培养液,继续置培养箱中培养；2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至IOcm培养皿中，加入IOml
完全培养基；2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，_80°C保存；(3)用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；(4)初级病毒液的扩增
4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在IOcm培养皿中以3X IO6细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90% ；4.2感染时在IOcm皿中加入100 μ I初级病毒液，混匀；4.3在37°C，5%的CO2的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管；4.5将收集的细胞置于_80°C，30分钟，随后置于37°C 15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于_80°C保存备用；(二)小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合笼；(2)每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的
0.5 天；

(3)取怀孕12.5 13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；(7)用显微剪将鼠胚躯干剪成lmm3以下的碎块，吸置于离心管内；(8)室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；(9)向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；(10)离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%_90%融合时传代或冻存；(11)在第3 5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10 μ g/ml，放回培养箱处理2.5小时；(12)将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；(13)弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；(14)消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6 X IO4个/cm2 ；(15)待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；(16)将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；(三)MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞(I)先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出IXIO5个细胞用于感染实验所需的细胞量；(3)将所需的含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45 μ m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；(4)将IXlO5的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μ I助转剂polybrene,助转剂polybrene使用浓度为10 μ g/ml,将整个体系混勻后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37° C培养箱中，10小时后去病毒；(5)将上述慢病毒感染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔IXio4的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上；(6)第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次；(7)细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞；(四)小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞(I)小鼠iPS细胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于IOOmm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数；(2)将所需的分别含目的基因rox-l，NeuroD, MafA的腺病毒载体Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一个 15ml 离心管中，混匀后，用0.45 μ m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；(3)将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次；(4) 6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中；(5)待大量细胞自胚 体爬出时消化传代。本发明方法简便、易操作、效果好。


下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1小鼠iPS细胞克隆在显微镜下的形态(X 200)图。图2 (A)第16代小鼠iPS细胞克隆的碱性磷酸酶染色(X 200) (B)第16代小鼠iPS细胞克隆的干细胞表面标记Nanog、ReX-l及SSEA-1的免疫荧光染色(X400) (C)小鼠iPS细胞干细胞内源基因的RT-PCR检测结果(D)小鼠iPS细胞的核型图。图3A)小鼠iPS细胞来源的胚体在体视显微镜下的形态(X60) (B)小鼠iPS细胞来源的胚体三胚层基因的RT-PCR检测结果(C)小鼠iPS细胞形成畸胎瘤的HE染色。图4是I3DX-UNeuroD和MafA转染的小鼠iPS在荧光显微镜下同一视野的明视野及荧光图(X 100)。图5是定向诱导分化的小鼠iPS细胞外源性转录因子及胰岛细胞功能基因的RT-PCR检测结果使用图。图6是胰岛素分泌细胞胰岛素蛋白的表达(X 400)示意图。图7是定向诱导分化的小鼠iPS细胞在不同浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量对比示意图。图8是细胞移植区胰岛素表达的免疫组化检测结果(A)正常胰岛(X100) (B)链脲霉素破坏后的胰岛(Xioo) (C)糖尿病小鼠肝脏注射区(X40)⑶图C局部放大图(X100)。图9是移植组和未移植组糖尿病小鼠7周的空腹血糖值不意图。
具体实施例方式材料:健康C57BL/6J 小鼠(南通大学实验动物中心)，LV-ef la-Hygromicin-TRE-0ct4/Sox2/Klf4/cMyc及表达rtTA的慢病毒载体(上海Sidansai公司)，293T细胞(Invitrogen), pVSVG, delta8.91 (Invitrogen), HIVp24ELISA (Cell Biolabs),转染试剂 Fugene (Roche), polybrene (Sigma), Opt1-MEM 培养液(Invitrogen) ,0.25%Trypsin/EDTA (Sigma), DMEM 低糖培养基(Hyclone),胎牛血清(Gibco),谷氨酰胺(Sigma), PBS缓冲液(Hyclone),必需氨基酸(Sigma),丝裂霉素 C (Sigma), LIF (Prospec), DEPC(Sigma),微量 RNA 提取试剂盒(OMEGA), RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit (Fermentas),琼脂糖(Takara), Goldenview (上海赛百盛)，碱性磷酸酶染色试剂盒(Millipore), DNAMarker DL2000 (TaKaRa), PCR 试剂盒(Fermantas),兔抗小鼠膜岛素多克隆抗体(Santa Cruz), Cy3羊抗兔突光抗体(Proteintech),小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia), Triton X-100 (Sigma),牛血清白蛋白(Sigma), Hochest (Sigma),链服霉素(Sigma),明胶(Sigma), knockout DMEM (Gibco), β -巯基乙醇(Sigma),抗突光淬灭封片液(碧云天公司)，羊抗小鼠Rex-1IgG抗体(Santa Cruz SC-50668),兔抗小鼠Nanog IgG抗体(Santa CruzSC-33760)，小鼠抗小鼠 SSEA-1IgM 抗体(Abeam abl6285), FITC 驴抗羊突光抗体(Proteintech)，Texas Red羊抗兔突光抗体(Proteintech)，Cy3羊抗小鼠突光抗体(Proteintech)，C02细胞培养箱(美国NUAIRE公司)，生物安全柜(美国Thermo公司)，正置、倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，电泳仪(美国BIO-RAD公司)，PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)，生物分光光度计(美国MPLEN公司)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司),体视显微镜(日本Olympus公司)1、含目的基因PDX-1，NeuroD, MafA腺病毒载体

由英潍捷基(上海)贸易有限公司提供。2、含目的基因PDX-1，NeuroD, MafA腺病毒包装(I)转染前质粒的准备1.1重组质粒Pac I单酶切，37°C酶切2h。1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质权浓度。(2)转染2.1取细胞状态良好，处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5X105个细胞，种于6孔板，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜；2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opt1-MEM培养液；2.3取2 μ g线性化的质粒加入250 μ I Opt1-MEM (经37°C预热)中，轻轻混匀；2.4 取 5 μ I lipofectamine2000 加入 250 μ I Opt1-MEM 中，轻轻混匀，室温放置5min ；2.5将500 μ I复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37°C，5%的CO2的培养箱中培养5-6小时后,换上完全培养液,继续置培养箱中培养；2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化；并细胞转移至IOcm培养皿中，加入IOml
完全培养基；
2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应。收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，_80°C保存。(3)用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液。(4)初级病毒液的扩增4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在IOcm培养皿中以3X IO6细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%。4.2感染时在IOcm皿中加入100 μ I初级病毒液，轻轻混匀。4.3在37°C，5%的CO2的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮。4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管。4.5将收集的细胞置于_80°C，30分钟，随后置于37°C 15分钟。反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来。4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片。4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于_80°C保存备用。

(5)腺病毒的滴度测定采用免疫法检测腺病毒滴度，原理是通过抗腺病毒的多抗与感染了腺病毒供试样品的细胞结合，再用辣根过氧化物酶标记的二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗)与一抗(兔抗腺病毒多抗)结合，经显色液显色，被感染的细胞显示出明显的棕色，通过计数及计算，即可确定腺病毒的滴度。3、含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表达rtTA的慢病毒由上海斯丹赛生物技术有限公司提供。4、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的分离培养及饲养细胞的制备(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合笼。(2)每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5 天。(3)取怀孕12.5 13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于另一盛有PBS平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。(7)用显微剪将鼠胚躯干剪成1_3以下的碎块，吸置于离心管内。(8)室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块。(9)向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基(DMEM低糖+10%FBS+4mmol/L谷氨酰胺)中，反复多次以上操作直至组织块消失。(10)离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%_90%融合时传代或冻存。(11)在第3 5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10 μ g/ml，放回培养箱处理2.5小时。(12)将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次。(13)弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍。
(14)消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内(种植的细胞数为6 X IO4个/cm2)。(15)待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，得饲养层细胞。(16)将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用。在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基。5、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞(I)先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间约为10分钟。(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出IXIO5个细胞用于感染实验所需的细胞量。(3)将所需的含有目的基因0ct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒(LV-efla-Hygromicin-TRE-0ct4> LV-efla-Hygromicin-TRE-Sox2>LV-ef Ia-Hygromicin-TRE-Klf4>LV-ef Ia-Hygromicin-TRE-cMyc)及表达 rtTA 的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45 μ m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；(4)将IXlO5的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5 μ I助转剂polybrene (使用浓度为10 μ g/ml),将整个体系混勻后,转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37° C培养箱中，10小时后去病毒。(5)将慢病毒感 染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔IX IO4的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上。(6)第2天，将MEF培养基换成mESC培养基(knockout DMEM+15%FBS+1 X必需氨基酸+1XL-G+0.1mM β -巯基乙醇+LIF1000U/ml )，继续培养，以后每2天换液一次。(7)细胞长至第13天左右，可以挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增。6、碱性磷酸酶染色(I)吸出细胞培养液，用PBS润洗2-3次，用多聚甲醛固定1-2分钟。(2)吸出固定液，用PBS洗2次。(3)吸出 PBS，用 TBST 润洗一次。(4)准备碱性磷酸酶试剂(上海斯丹赛生物技术有限公司):溶液A:溶液B:溶液C=50y 1:50 μ 1:400 μ I。加足量的染色试剂使染色液能足够覆盖孔底，室温避光放置15分钟。吸出染色液，用PBS缓冲液润洗一次，最后保持于PBS中，显微镜下观察结果。7、核型分析(I) 40 μ g/ml秋水仙素处理3小时，终止培养，PBS洗一次。(2)低渗氯化钾(0.075mol/L)处理30分钟。(3)滴加少量固定液(冰醋酸:甲醇为1:3)预固定I分钟，离心1500rpmX5分钟。(4)去上清液，保留1ml，轻轻吹打悬起，缓慢加入5ml固定液，30分钟后离心1500rpmX 5 分钟。(5)重复步骤(4)两遍。(6)滴片(载玻片要事先放在冰水浴中，取出玻片后不要等玻片温度上升及干燥就从闻处滴片)。(7) 80°C烤片3小时后取出置室温，胰酶消化后吉姆萨染色10分钟显带。(8)镜检。8、拟胚体形成小鼠iPS细胞扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除饲养细胞，吹打成单细胞后悬浮培养在MEF培养基中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次。收集拟胚体后用Trizol裂解，抽提RNA，_80°C保存待检测。9、畸胎瘤形成实验将得到的小鼠iPS细胞系传代培养至10代以上后，消化洗涤，去除饲养细胞后悬浮在小于400 μ I的培养液中，无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞量约为2-3 X 106。8周后取出畸胎瘤进行HE染色，观察分化为三胚层情况。10、RT-PCR10.1细胞总RNA的提取(I)将细胞培养基去掉，用DEPC水洗一遍，加Iml Trizol裂解约5分钟。(2)每使用Iml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，静置约2_3分钟。(3)4°C 12 000Xg离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。(4)把水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用Im Trizol加入
0.5ml异丙醇，静置10分钟。(5)4°C 12000Xg离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清。(6)用75%乙醇洗涤RNA沉淀，加lml75%乙醇，4°C 7500g离心5分钟，弃上清。(7)室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5_10分钟，加入50-100 μ I无RNase的水，用枪头吸打几次溶解RNA，紫外分光光度计测RNA浓度后-80°C保存。10.2 第一链 cDNA 合成( I)取出逆转录试剂盒置于冰上融化，混匀。(2)取各组模板 RNA0.lng-5 μ g, oligo (dT) 18primerl μ I,再加 nuclease-freewater 至 12 μ I。(3)按以下组份继续添加至无菌的nuclease-free的离心管中。(4)混匀并离心，42° C孵育60分钟。(5)70° C孵育5分钟终止反应。10.3PCR 扩增反应条件:94°C预变性5分钟，后经过35个循环的94°C变性30秒、55_60°C退火30秒、72 °C延伸30秒，最后72°C总延伸10分钟。10.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳PCR 结束后，每管加入 6 X loading buffer4 μ I (如为 Dream TaqTM GreenPCRMaster Mix (2 X)则不需加6 X loading buffer)，混匀后取10 μ I上样，行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统检测电泳结果。11、细胞免疫荧光(I)首先把细胞固定在4%多聚甲醛中，室温放置30分钟。
(2)在无水乙醇中浸泡3次，每次10分钟(限于核蛋白)。(3)吸干上述溶液，先用I XPBS洗涤一次，再用抗体稀释液(0.2%牛血清白蛋白和
0.l%TritonX100 溶于 PBS)洗涤 2 次。(4)用封闭液(含6%牛血清白蛋白+0.3%TritonX100的PBS溶液)封闭细胞。(5)将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，4°C放置过夜。(6)用 PBT (0.l%TritonX100)洗涤细胞 3 — 5 次。(7)将二 抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置I小时(从步骤7开始，样品要注意避光)。(8)用 PBT 洗涤 3 次。(9)将hochest (lmg/ml)母液以1: 1000用PBS稀释,室温放置30分钟。(10)用PBS洗涤3次，每次5分钟。12、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞(I)小鼠iPS细胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于IOOmm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数。(2)测定病毒感染靶细胞的最适病毒滴度，将所需的Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad -mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一个 15ml 离心管中，混匀后，用 0.45 μ m 过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质。(3)将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中(2ml/孔)，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次(24小时)。(4) 6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中。(5)待大量细胞自胚体爬出时消化传代，备下一步实验用。13、ELISA13.1标本收集(I)取受染11天的分化细胞，吸去培养液，加入KRB缓冲液预培养I小时。(2)吸去缓冲液，再加入不同葡萄糖浓度的KRB缓冲液继续培养I小时。(3)将缓冲液收集-80°C保存待检测。13.2操作步骤(I)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒及标本，平衡至室温。(2)以酶结合物稀释液稀释酶结合物(1:10)，临用前15分钟配好。(3)以双蒸水稀释洗涤液(1:20)，临用前15分钟配好。(4)取出板条，吸出10 μ I标准品和标本加入相应的孔中。(5)每孔加入100 μ I酶结合物稀释液。(6)封板胶纸封住反应孔，室温下在摇床上反应2小时。(7)每孔加入350 μ I洗涤液，洗板6次。(8)每孔加入200 μ I显色液,室温避光孵育15分钟。(9)每孔加入50 μ I终止液，充分混匀。(10)多功能酶标仪(450nm吸光度)测量结果。14、细胞移植
14.1糖尿病动物模型的建立(I) 12-16周的C57BL/6J小鼠共18只，雌雄各半，随机分为3组(n=6)，第一组为糖尿病小鼠未移植组(糖尿病未移植组)，第二组为糖尿病小鼠肝脏注射转PDX-l+NeuroD+MafA iPSCs组(糖尿病移植组)，第3组为无糖尿病正常小鼠组(健康对照组)。(2)链脲霉素以160mg/kg的剂量注射到第一、二组每只小鼠腹腔内，健康对照组不予处理。(3)监测小鼠空腹血糖。14.2体外获取的胰岛素分泌细胞移植至糖尿病小鼠肝脏(I)待小鼠链脲霉素注射后7天，将胰岛素分泌细胞计数后用少量完培重悬。(2)细胞移植前小鼠以3%戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉。(3)糖尿病小鼠麻醉后固定消毒，手术进腹，胰岛素分泌细胞悬液100 μ I注射到肝左叶。(4)移植后每三天测定糖尿病小鼠空腹血糖。15、免疫组化检测(I)细胞移植后9天处死实验及正常小鼠，取出肝脏及胰腺，10%福尔马林固定48小时。 (2)行石蜡包埋切片，片厚ΙΟμπι。(3)石蜡切片常规脱蜡，PBS洗3次X3分钟。(4)用pH6.0,0.0lMCB热诱导修复(微波3档20分钟)，室温自然冷却，PBS洗3次X 3分钟。(5)0.3%Η202室温下抑制内源性过氧化物酶20分钟。(6 ) PBS 洗 3 次 X 3 分钟。(7) 20%正常羊血清室温孵育30分钟，不洗。(8)滴加一抗兔抗小鼠胰岛素多克隆抗体(1:100) 37°C孵育2小时。(9 ) PBS 洗 3 次 X 3 分钟。(10) EnVision 试剂(HRP/R) 37°C 30 分钟。(11) PBS 洗 3 次 X3 分钟。(12) DAB 显色 8-12 分钟。(13)苏木素染色，热水蓝化。(14)吹干后，树脂封片。(15)显微镜镜检。16、统计学处理每组数据来自3次独立的实验，所有数据均以Z±s表示，用STATA7.0软件进行One-Way-ANOVA分析。结果P〈0.05表示差异具有统计学意义。
权利要求
1.一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是:包括下列步骤: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包装 (1)转染前质粒的准备 ·1.1重组质粒Pac I单酶切，37°C酶切2h ；· 1.2 采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度； (2)转染 ·2.1取处于对数生长期的29 3A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔·4.5X105个细胞，种于6孔板，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜； ·2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opt1-MEM培养液； ·2.3取2Pg线性化的质粒加入250μ1经37°C预热的Opt1-MEM中，混匀； ·2.4 取 5μ1 lipofectamine2000 加入 250μ1 Opt1-ΜΕΜ 中，混匀，室温放置 5min ； · 2.5将500μ1复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37°C，5 %的CO2的培养箱中培养5-6小时后,换上完全培养液,继续置培养箱中培养； ·2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至IOcm培养皿中，加入IOml完全培养基； ·2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现； ·2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，-80°C保存； (3)用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液； (4)初级病毒液的扩增 ·· 4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在IOcm培养皿中以3X IO6细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90% ； ·4.2感染时在IOcm皿中加入ΙΟΟμΙ初级病毒液，混匀； `4.3在37°C，5%的CO2的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；` ·4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管； `4.5将收集的细胞置于-80°C，30分钟，随后置于37°C 15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来； `4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片； `4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80°C保存备用； (二)小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备 (O性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合笼；(2)每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天; (3)取怀孕12.5 13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞； (4)用显微剪将鼠胚躯干剪成1_3以下的碎块，吸置于离心管内；(5)室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块； (6)向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失； (7)离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%-90%融合时传代或冻存； (8)在第3 5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为IOPg/ml，放回培养箱处理2.5小时； (9)将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次； (10)弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍； (11)消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6 X IO4个Zcm2 ； (12)待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞； (13)将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基； (三)MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞 (1)先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；(2)用0.25% trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出IX IO5个细胞用于感染实验所需的细胞量； (3)将所需的含有目的基因0ct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45ΜΠ1过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质； (4)将IXlO5的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μ1助转剂polybrene,助转剂polybrene使用浓度为10Pg/ml,将整个体系混勻后,转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37° C培养箱中，10小时后去病毒； (5)将上述慢病毒感染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔IXlO4的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上； (6)第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次； (7)细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞； (四)小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞 Cl)小鼠iPS细胞用0.25% trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于IOOmm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数； (2)将所需的分别含目的基因roX-1，NeuroD,MafA的腺病毒载体Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一个 15ml 离心管中，混匀后，用0.45Mffl过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质； (3)将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次； (4)6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中； (5)待大量细胞自胚体爬出时消化传代。
全文摘要
本发明公开了一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装、小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞。本发明方法简便、易操作、效果好。
文档编号C12N5/10GK103146754SQ20131004432
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者王志伟, 朱铭岩, 范向军, 陆玉华, 朱沙俊, 王尧, 郭青松, 王雷, 黄龑, 薄祥坤, 常旭, 袁骁琪, 张太哲 申请人:南通大学附属医院