专利名称：短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因(如set、survivin、c_myc、Bcl_2 等)和抑癌基因(如 p53、DCC、nm23、APC、PTEN、PP2A 等)与人结直肠癌的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多与人结直肠癌发病相关的致癌基因、抑癌基因尚未发现。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。该技术已被用于疾病基因治疗领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、月巴胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法，肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。该技术比其它治疗手段的毒副作用会更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的短发夹shRNA，并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM-001013649.3，定位于2ρ11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示:该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ IDNO:1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID N0:3。本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述。实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，本发明所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。本发明具有以下有益效果:1、本发明为制备治疗人结直肠癌的药物提供了一种新方法，可促进人结直肠癌新药的开发。2、本发明所述shRNA片段不仅可应用于制备治疗人结直肠癌的药物，而且可用于人c2orf68基因在结直肠癌发病中的作用和机理研究。
图1是荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。图2是荧光定量PCR实验中内参gapah基因引物的标准曲线图。图3是人结直肠癌细胞株SW480的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)、阴性对照组SW480_、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)中人c2orf68基因表达的柱状图。图4是人结直肠癌细胞株SW620的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)、阴性对照组 SW620_、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)中人c2orf68基因表达的柱状图。图5是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA、阴性对照细胞株SW480-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡图。图6是流式细胞仪检测SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的细胞凋亡率柱状图。图7是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA、阴性对照细胞株SW620-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡图。图8是流式细胞仪检测SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的细胞凋亡率柱状图。图9是MTT实验中SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的生长曲线图。图10是MTT实验中SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的生长曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook, Russell的分子克隆；实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:RNA干扰靶点的确定及shRNA的设计与合成以人c2orf68基因的mRNA序列作为基础,采用siRNA在线设计软件(http://www.ambion.com)设计短发夹shRNA, siRNA在线设计软件显示RNA干扰祀点的核苷酸序列是SEQID NO:1中第327位至345位的核苷酸序列，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:3。根据所述靶序列设计了一对短发夹shRNA，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所述。shRNA通过化学合成方法制备，委托有关专业公司合成(广州锐博生物科技有限公司)。实施例2:短发夹shRNA的干扰效率实验1、细胞培养用胎牛血清的体积比为10%的DMEM高糖培养基(从HyClone公司购买)于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养人结直肠癌SW480细胞株和SW620细胞株(SW480、SW620从美国ATCC公司购买)至铺满培养瓶。2、shRNA 转染 SW480 细胞和 SW620 细胞2.1分别取培养瓶中1/6人结直肠癌SW480细胞和SW620细胞接种于6孔细胞培养板的每一孔中；2.2 24h后细胞培养板覆盖率约达70% 80%，丢弃原培养基。将6孔板中的细胞用2ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)培养4h ；2.3 于 EP 管内配制 A 液:5μ I (20ymol/L) shRNA+250ul DMEM 培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；于EP 管内配制 B 液:Lipofectamine 2000 (invitrogen 公司)+25Oul DMEM 培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；室温静置5min ；于EP管内 配制C液:A液+B液，混合均匀，室温静置25min ；2.4弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入新鲜的1.5ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)；2.5将C液逐滴逐滴的加入到培养板中，每孔各500 μ I ;2.6将转染shRNA的SW480细胞和SW620细胞放入37°C、5% CO2细胞培养箱孵育；实验设置3个组，分别为实验组、空白对照组、阴性对照组；2.7 6h后，弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入2ml含胎牛血清的DMEM高糖培养基；放入37°C、5% CO2细胞培养箱孵育。3、总RNA的提取3.1取转染shRNA片段48h后的结直肠癌SW480细胞和SW620细胞，加入TRIzol试剂(invitrogen公司)lml，然后转移至Ij 1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min ；3.2加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，摇匀15秒左右，室温静置2-3min，4°C离心机中离心(12000r/min, 15min)；3.3将上清转移至新管(1.5ml的Eppendorf管)中，加入0.5ml的异丙醇,充分混匀，室温静置10min，4°C离心机中离心(12000g/min，15min)，弃上清，在管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA ；3.4加入Iml质量浓度75%的乙醇，混合震荡，4°C离心机中离心(7500g/min)5min，弃上清，通风，室温中干燥5min，让乙醇挥发；然后加入50 μ I质量浓度0.1%的DEPC处理水溶解RNA ；3.5凝胶电泳和分光光度计检测浓度和纯度，保证每个样本的0D260/0D280的值在1.8 2.0之间，并通过琼脂糖电泳检测每个样本的28S及18S条带的灰度值来进一步严格控制RNA质量，并且每个样本的RNA均使用DNA酶进行处理以去除基因组污染。4、cDNA第一链的合成取总RNA样品I μ g，Oligo dT I μ I入PCR反应管，再加质量浓度0.1%的DEPC处理水至总体积12 μ 1,65°C,反应5分钟,反应结束后取出置于冰上孵育2min,再加入缓冲液(Buffer ) 4μ 1，RNA抑制剂I μ I,，浓度10mmol/L的dNTP 2 μ 1，逆转录酶I μ I至总体积达到20 μ I，将混合液置于37°C反应60分钟，再于70°C反应5分钟，之后冰上冷却终止反应，-20°C保存。5、荧光定量PCR试验5.1荧光定量PCR引物设计根据人c2orf68基因全长cDNA的开放读码框(Open Reading Frame, 0RF)序列，设计荧光定量PCR所需引物。所用软件为Primer Premier 5.0&01ig6。保证PCR产物长度在IOObp 250bp。引物设计好后，进一步在NCBI上通过BLAST比对验证引物的特异性是否良好。采用人gapdh (核苷酸序列见NCBI数据库)作为内参，引物序列见下表。表I定量PCR引物
权利要求
1.一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，其特征在于它来源于序列表中SEQ ID NO:1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:3所述。
2.—种权利要求1所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述。
3.权利要求2所述短发 夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
全文摘要
一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，来源于序列表中SEQ ID NO1所述的人c2orf68基因，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO3。一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA，由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO2所述。实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，所述短发夹shRNA可在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
文档编号C12N15/11GK103146689SQ20131004436
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者陈尧, 温晓霞 申请人:四川大学