专利名称：人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，它涉及一种人胰岛素基因的分泌表达，特别是人胰岛素基因在甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中的分泌表达。
背景技术：
胰岛素是一种由B细胞分泌的唯一能降低血糖的天然激素。它的主要作用在于体内调节血液中葡萄糖的含量并转运葡萄糖到一定的靶细胞中，参与体内三大物质及能量的代谢。人体内血糖的过高或过低都是一种疾病。无论什么原因导致胰岛素分泌的降低，不为体内调节血糖所需，都会引起患者得胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。治疗这类患者，胰岛素是必须的。人胰岛素对任何器官均没有专属性。实际上在肝、肌肉和脂肪细胞中进行的大量代谢活动均有胰岛素参与。有胰岛素存在时，许多组织器官的细胞通透性增加，促进物质从细胞外向细胞内转移。胰岛素可促进葡萄糖进入细胞内，加速其降解，从而使葡萄糖水平下降。血浆中葡萄糖或氨基酸、CAMP以及Ca++水平的升高均会引起胰岛素的释放，因此进食后血浆中胰岛素水平升高。同时，它还能促进骨骼、肌肉、心脏及脂肪组织对糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖原异生，从而降低血糖。临床上应用胰岛素已有80年历史。早期使用的是猪、牛等动物胰岛素，用这些动物的胰腺通过生化提取的方法而获得，来源有限，且原材料的质量难以保证。如果糖尿病人长期使用动物胰岛素，人体会对其产生抗体从而降低其功效，长期皮下注射会在注射部位产生硬结等副作用。
基因工程技术的兴起改变了人们生产、利用蛋白质类(包括多肽类)药物的整个生产程序，大大推进了这一领域的发展。利用基因工程技术研制生产胰岛素至今仍是世界性热门课题之一。人胰岛素也是世界上第一个基因工程药物。医用人胰岛素只能由基因工程方法生产，其结构和人体内产生的胰岛素完全一致，不会给患者带来如使用动物胰岛素造成的副作用。生产过程中的原材料的质量可以得到保证，虽然人胰岛素的生产成本较动物胰岛素的生产成本高，但随着人们生活水平的提高，人胰岛素会逐渐被广大的糖尿病患者所接受。从1982年人胰岛素上市以来的发展趋势也可以看出，动物胰岛素会逐渐被基因工程的人胰岛素所取代。由于人胰岛素基因工程生产过程中的技术难度，全球可以生产人胰岛素的厂家为数并不多，主要有美国礼莱(Eli Lilly)，丹麦的诺和诺德(Novo Nordisk)两家。
现在，生产人胰岛素的技术基本分为两种一种是将胰岛素的A、B链分别表达，分离纯化后再化学合成人胰岛素(指以化学法促使A、B链间二硫键的形成)；另一种是在宿主细胞内表达人胰岛素原，纯化后酶切除掉链结肽(C肽)而变成胰岛素。当然，每家公司使用的工艺不同，宿主菌前者是大肠杆菌，后者是酵母。C肽可以是2个氨基酸，也可以是多个氨基酸(天然胰岛素含30个氨基酸)。近几十年对胰岛素的研究发现，通过胰岛素链内氨基酸的替换等方法，已生产出一系列胰岛素类似物。它们既具胰岛素的生理活性，又不象天然胰岛素那样容易聚合，以增加生物利用度。
天然成熟的胰岛素含有两条氨基酸链即A与B链。A链由21个氨基酸组成；B链由30个氨基酸组成。A、B链之间由2个二硫键互相交连；A链内尚有第3个二硫键。由此形成一定的三维结构，行使上述特定的生理功能。
天然的人胰岛素基因首先合成一种含有信号肽的胰岛素原(proinsulin)。胰岛素信号肽为由24个氨基酸组成的一段肽链。由于受其在胞质中内质网上的信号肽受体的吸引而引导新生肽穿过内质网膜进入内质网腔，在内质网腔内由一种与膜结合的蛋白酶将信号肽(Signal(Pre)sequence)切除，剩下的胰岛素原在路经高尔基体时在一系列类似于胰蛋白酶/羧肽酶B的作用下在连续两个碱性氨基酸序列处切去C肽，产生成熟的胰岛素(Steiner et al.Cell Bid.34(1984)121-130)。
文献报导C肽在胰岛素成熟过程中起连接A链与B链并形成适当的空间构型，便于胰岛素的成熟(Bell et al.，Nature284(1980)26-32)。文献还证明，C肽的链长度是可以变化的，这种变化不影响最终该基因的表达及活性胰岛素分子的生成。其中C肽最链短的可以是二个氨基酸(EP-0-195691)。
啤酒酵母已被用来表达生产多种药用蛋白质。在酵母细胞中合成的蛋白质通过一套特有的机制来完成成熟及分泌过程。通常采用的是α-因子信号(pre)原(pro)引导序列。其中pre序列由19个氨基酸残基组成；而pro序列则由66个氨基酸残基组成。这66个氨基酸残基中包含着3个N-糖基化位点和1个能识别2个碱性氨基酸残基的Kex2内切蛋白酶位点(Waters et al.，JBC(1988)，263，6209-6214)。
近年的研究表明，用甲醇酵母来表达外源基因有更多的优点而受到广泛关注。有资料显示该系统可以根据不同的表达基因获得比其他表达系统高出10-100倍的表达量。因为它可以高密度生长及一个可为甲醇严格诱导表达的乙醇氧化酶基因启动子-AOX1。和啤酒酵母一样，甲醇酵母也具有相同的分泌表达机制(Yan Wang et al.，(2001)Biotechnology &Bioengineering73，74-79)。一种胰岛素前体(IP)在此系统中已得到很好地表达(Kjeidsen et al.，(1999)Biotechnol.Appl.Biochem，29，79-86)。但是，这些研究仍然采用传统的方法，先表达纯化出胰岛素原，再经过转肽去掉C链等极为复杂的过程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人胰岛素基因在甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中的分泌表达，它解决了现有技术表达基因获得的表达量较低、且需要经过转肽去掉C链等极为复杂的过程的缺陷。
本发明运用分子生物学成果设计了这一条胰岛素生成形成的新路线，其技术方案为以特殊的方式改变了胰岛素基因，以甲醇酵母表达系统直接分泌表达人胰岛素，其特征在于(1)人胰岛素基因A、B链采用酵母偏爱密码子；(2)人胰岛素A、B链分别置于同一经改造了的甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中表达质粒pPIC9K表达盒α-因子信号肽之后，以甲醇进行诱导表达；(3)其表达产物成熟并分泌于酵母培养基中，利于分离纯化。上述人胰岛素基因A、B链全部酵母源化，胰岛素基因B链及A链分别有选择的置于表达质粒pPIC9K AOX1信号肽及引导序列的Kex2酶切位点位点之后，并组建到同一母体pPIC9K表达质粒中，此质粒以电激法转化宿主细胞GS115，其所需部份插入到宿主细胞，使用同样的启动子以相同速率等量表达。将所得的产物用重组质粒筛选法筛选阳性重组子；通过从小到大体积摇瓶培养法系统筛选出高表达量的转化子。
本发明采用相同的两个启动子，分别等量、同时合成后的A及B链在其后的成熟及分泌过程中可以自然地形成成熟分子的胰岛素。事实上，在利用E.coli表达生产胰岛素时，就是分别表达并纯化A、B链后，在体外特定件下使此二肽人为地形成二硫键，成为成熟活性分子的(Goeddel et al.，(1979)Pro.Natl.Acad.Sci.USA，76106-110)。这一特定条件本身就存在于真核生物的酵母表达系统中。
用上述方法组建的甲醇酵母人胰岛素表达工程菌菌种保藏于中国武汉，武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心。
本发明省去了转肽去掉C链等极为复杂的过程，减少了生产步骤，缩短了工时，因此它具有工艺简单的优点，采用本发明比其它表达系统高出10-100倍的表达量，因此将大大提高其产量。
图1.人胰岛素原天然序列与酵母偏爱密码子序列1)Insulin b-c-a(NCBI)为天然人胰岛素原序列。
2)Yeast most b-c-a为酵母偏好的人胰岛素原序列，下有“-”的表示二者不同。
3)黑体字代表人胰岛素B及A链序列。
图2.人胰岛素B-C(2肽)-A(B-C’-A)“PCR”产物电泳图1)PCRmarker为PCR分子量标准，各带分子量分别为1K，0.75K，0.5K，0.3K，0.15K。
2)1#，2#为“PCR”合成的人胰岛素B-C’-A片断。
3)3#，4#和5#，6#分别是所用2种“引物”。
图3.pPIC9K(B-C’-A)的结构1)原始质粒pPIC9K由美国Invitrogen公司购得。
2)其中氨苄青霉素(Ampicilin)和卡那霉素(Kanamycin)分别用于E.coli和酵母菌(Yeast)平板的筛选和液体培养。
3)PBR3220为E.coli质粒PBR322的复制起始位点。
4)5’AOX1为酵母AOX1基因的启动子部份，3’AOX1(TT)为其终止子部份。
5)B-C’-A分别为人胰岛素原B、C’、A片断。其中C’代表特定的二肽密码子AAA AGA。
图4.pPIC9K(B-C’-A)中B-C’-A序列分析比较1)Yeast human Proims.为酵母偏好人胰岛素原序列。
2)WHS0862和WHS0863为两个被选出的阳性重组子目标部份分别测序的结果。
3)C’代表非天然的2肽C链。
图5.新表达质粒pPIC9K(+B+A)的构建路线图1)“B”代表人胰岛素B链，“A”代表人胰岛素A链。
2)B、A链合成中的模板为质粒pPIC9K(B-C’-A)。
图6.中间体质粒pPIC9K(+B)结构1)同图3。
2)其中+B代替B-C’-A。
图7.中间体质粒pPIC9K(+A)结构1)同图3。
2)其中+A代替B-C’-A。
图8.新人胰岛素表达质粒pPIC9K(+B+A)结构1)同图3。
2)在pPIC9K(+B)中间体质粒中的AatII酶切位点插入A片断表达盒。。
3)其中(+B+A)分别代表B链及A链。
图9.点ELASA1)IN1，IN3，IN5代表三种浓度递增的标准人胰岛素。
2)9K代表用质粒pPIC9K转化的细胞外液。
3)0h，24h，48h，72h，96h，120h分别代表经筛选出的阳性重子转化菌株发酵不同时间细胞外液。
图10.Western Blot1)IN代表标准人胰岛素。
2)1，2，3，4分别代表别代表经筛选出的阳性重子转化菌株发酵24，48，72及96小时的细胞外液。
图11.HPLC分析1)2代表经筛选出的阳性重子转化菌株发酵96小时的细胞外液洗脱曲线，24.5分钟处有一洗脱峰。
2)2+IN代表样品1)加标准人胰岛素样品，24.5分钟处洗脱峰值有明显增加。
3)IN代表标准人胰岛素样品洗脱曲线，24.5分钟处有一对应洗脱峰。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，如图5所示，本发明具体包括下述步骤第一步表达质粒pPIC9K(+B+A)的构建1.含2肽C链人胰岛素原(B-C’-A)质粒pPIC9K(B-C’-A)的制备。
本发明中所涉分子生物学操作均按常规经典的方法进行(Ausubel，F.M.，et al.，Short Protocols in Molecular Biology SecondEdition，1992)。
a)B-C’-A DNA片断的制备采用酵母偏好密码子人胰岛素原(C’)序列(图1).在美国Integrated DNA Technologies，Inc.合成下列二条类似引物的单链DNA片断5’-USAp(100nt)5’-GCATTACGTATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACT3’-USAp(104nt)5’-ATATGCGGCCGCTTAGTTACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAAATAGAAGTACAACATTGTTCAACAATACCTCTTTTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGA。
其中两条“引物”的3’端有20个互补的核苷酸用以互相延伸成双链B-C’-A的DNA片断；5’端分别含有内切核酸酶SnaBI和NotI位点(这些均以下横线标示出)。
b)B-C’-A片断合成示意图5’USAp 5’USAp
其中实线部份分别代表5’-USAp(100nt)和3’-USAp(104nt)两条引物；虚线部份代表“PCR”中的延伸部份。
c)(B-C’-A)的PCR合成在预冷于冰浴的0.5ml的微型离心管中按以下顺序加入5ul 10倍浓度的缓冲液，8.5ul每种含1.25mM浓度的dNTP，10ul的5’USAp(50-100ng)，10ul的3’USAp(50-100ng)，0.5ul Taq DNA聚合酶(5u/ul)，加ddH20至50ul。反应在自动控温PCR仪中进行94℃ 4分钟，55℃ 2分钟，72℃ 3分钟。如此5个周期。产物用0.7％的琼脂糖凝胶鉴定(图2)。证明获得了预期的184bp片断。
d)纯化并以SnaBI和NotI双酶切处理合成的184bp“PCR”片段及pPIC9K质粒，用DNA连接酶连接。其连接产物转化大肠杆菌(E.coli)TOP10F’，得中间体质粒pPIC9K(B-C’-A)(图3)。经酶切电泳确定B-C’-A片断是否正确插入，筛选阳性重组子。
e)序列分析结果及其分析。
由宝生物工程(大连)有限公司作序列分析上述阳性重组质粒的相关部份得5’-GCATTACGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACTAAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAAGCGGCCGCATAT-3’的插入序列。其结果经DNAMAN计算机软件同源序列对比分析(图4)。证明“PCR”合成之序列与预设的序列完全一致。
在质粒pPIC9K(B-C’-A)基础上按图5路线构建表达质粒pPIC9K(+B+A)如下。
2.中间体质粒pPIC9K(+B)的构建a)引物5’-引物(36nt)5’-ATCTCTCGAGAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTG3’-引物(36nt)5’-ATCTGAATTCATCTTAAGTCTTTGGAGTGTAGAAGA.
此二引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
b)模板pPIC9K(B-C’-A)。
c)参照前述PCR反应条件，以30个反应周期合成B链，其全长为122bp。
5’-ATCTCTCGAGAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACTTAAGATGAATTCAGAT-3’其中在5’端和3’端分别含有XhoI和EcoRI酶切位点。
d)上述PCR产物经XhoI和EcoRI双酶切片处理再插入经XhoI和EcoRI双酶切处理后的质粒pPIC9K中得质粒pPIC9K(+B)(图6)。以酶切法确证插入，并筛选阳性重组子。
3.中间体质粒pPIC9K(+A)的构建。
a)引物5’-引物(36nt)5’-ATCTCTCGAGAAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTG3’-引物(36nt)5’-ATCTGAATTCATCTAGTTACAGTTAGTTTTCCAATT此二引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
b)模板pPIC9K(B-C’-A)。
c)参照前述PCR反应条件，以30个反应周期合成A链，其全长为95bp，5’-ATCTCTCGAGAAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAGATGAATTCAGAT-3’。
其中在5’端和3’分别含有XhoI和EcoRI酶切位点。
d)上述PCR产物经XhoI和EcoRI双酶切片处理再插入经XhoI和EcoRI双酶切处理后的pPIC9K中得质粒pPIC9K(+A)(图7)。以XhoI和EcoRI双酶切法筛选阳性重组子。
4.pPIC9K A链表达盒的制备。
a)引物5’(30nt)5’-ATCTGACGTCAGATCTAACATCCAAAGACC3’(30nt)5’-ATCTGACGTCAAGCTTGCACAAACGAACTT此二引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。其两端均含有AatII内切酶位点(以下横线标示)。
b)横板pPIC9K(+A)。
c)PCR反应参照前述条件，反应30个周期。电泳检测后纯化并用AatII酶处理，得如下1697bp 5’-AOX1-S-InsA-3’AOX1(TT)结构物。
5.pPIC9K(+B+A)的构建与阳性质粒的鉴定。
1697bp 5’-AOX1-S-InsA-3’AOX1(TT)结构物再与用AatII酶处理并纯化后的pPIC9K(+B)连接。经转化、筛选等程序便获得最终表达质粒pPIC9K(+B+A)(图8)。以酶切法确证插入，并筛选阳性重组子。
第二步GS115宿主细胞的培养、转化与转化子的鉴定。
宿主细胞的培养、转化与转化子的鉴定等按David R.Higgins等(PichiaProtocols.Methods in Molecular Biology Edited by David R.Higgins and JamesM.Cregg.1998 Humana Press)推荐的方法进行。大致过程包括GS115的培养，转化，转化子的筛选，表现型(-his+葡萄糖/-his以及+甲醇)确定，Mut表现型的选择及表达试验，摇瓶或发酵罐中选择高表达量菌珠。其转化(电激法)及阳性重组子的选择过程是①制备感受态GS115.2，②加入线型化(SalI)的pPIC9K(+B+A)的质粒DNA，③混匀后加到0.2转化管中，④电击条件1.5KV，2’5uF，200ohm(电击后如显示T1和T2在4-5之间为好)，⑤用1.0ml 1.0M的山梨醇诜出，⑥涂布于MD/-HIS平板上，30℃ 24小时后检查酵母斑，⑥挑单菌落分别涂布于葡萄糖选择培养皿(MD)或甲醇选择培养皿(MM)上，在MM平板上生长迅速的是Mut+，其它的是Muts(甲醇缓慢利用型)，⑦重新接种到含G418不同浓度的平板上，筛选抗性最大(即插入拷贝数最高)的菌落，保存备用。
第三步人胰岛素的表达。
置高拷贝转化子先于25ml的MGY培养基中30℃ 300rpm培养过夜(OD600＝4左右)，转入1升的MGY培养基中30℃ 300rpm培养至生长对数期(OD600＝4左右)，2500×g室温下离心5分钟，沉淀物重新悬浮于BMMY培养基中(OD600＝1.0)，30℃ 300rpm继续培养，每天补加100％的甲醇至培养液中含0.5％的甲醇以诱导胰岛素B、A链的表达，以气相色谱法监测甲醇含量。如此培养90小时左右。2500×g室温下离心5分钟，上清液存于-80℃下备用。
第四步人胰岛素表达产物的鉴定第三步所得产物沉淀浓缩后经点ELASA，Western Blot证明在甲醇酵母中由B及A链在共同组建的质粒上的人胰岛素得到了表达(图9，图10)，并且形成了正常人胰岛素分子。产物还在HPLC分析中用内标胰岛素确定了其相对流出位置(图10)及相对表达量为400mg/升左右，比其他表达系统高出10-100倍的表达量。
Insulin序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>马，延高马，向东<120>人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达<130>Patentl<140>2004-10-29<141>2004-10-29<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>100<212>DNA<213>人工序列<400>1gcattacgta ttcgttaacc aacacttgtg tggttctcac ttggttgaag ctttgtactt 60ggtttgtggt gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact 100<210>2<211>104<212>DNA<213>人工序列<400>2atatgcggcc gcttagttac agtagttttc caattggtac aaagaacaaa tagaagtaca 60acattgttca acaatacctc ttttagtctt tggagtgtag aaga 104<210>3<211>184<212>DNA<213>人工序列<400>3gcattacgat tcgttaacca acacttgtgt ggttcttcac ttggttgaag ctttgtactt 60ggtttgtggt gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact aaaagaggta ttgttgaaca120atgttgtact tctatttgtt ctttgtacca attggaaaac tactgtaact aagcggccgc180atat 184<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>4atctctcgag aaaagattcg ttaaccaaca cttgtg 36
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----------Sequence NameA链表达盒3’-引物
权利要求
1.一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于(1)人胰岛素基因A、B链采用酵母偏爱密码子；(2)人胰岛素A、B链分别置于同一甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中表达质粒pPIC9K的表达盒α-因子信号肽之后，进行诱导表达；(3)其表达产物成熟并分泌于酵母培养基中，利于分离纯化。
2.根据权利要求1所述的一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于所述人胰岛素基因A、B链全部酵母源化。
3.根据权利要求1所述的一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于胰岛素基因B链和A链有选择的分别置于表达质粒pPIC9KAOX1信号肽及引导序列的Kex2酶切位点位点之后。
4.根据权利要求1所述的一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于将权利要求3的胰岛素基因B链与A链组建到同一母体pPIC9K表达质粒中，使B、A链因插入到宿主细胞的同一位点，分别使用同样的启动子而以相同速率等量表达。
5.根据权利要求1所述的一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于将权利要求所得之质粒以电激法转化宿主细胞GS115，用重组质粒筛选法筛选阳性重组子。
6.根据权利要求1所述的一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于通过从小到大体积摇瓶培养法系统筛选出高表达量的转化子。
全文摘要
本发明涉及一种人胰岛素基因的分泌表达，特别是人胰岛素基因在甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM
文档编号C12N15/81GK1614019SQ200410061039
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者马延高, 马向东 申请人:马延高, 马向东