室温扩增dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种室温扩增DNA的方法，包括：（1）提取模板DNA；（2）将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10～60分钟，得到所需的扩增DNA。本发明实现了在常温下DNA的扩增，在资源有限的情况下，使扩增DNA成为可能，并缩短反应时间，得到特异性扩增产物；简化了DNA引物配对以及DNA聚合酶复合物延伸的过程。
【专利说明】室温扩增DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种扩增DNA的方法，特别是涉及一种室温扩增DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 目前DNA扩增的方法有常规PCR、等温PCR等，这些技术都能在短时间内，迅速使目 标DNA得到100万倍甚至更高倍数的放大。自1983年面世以来，常规PCR依赖三温度(解 链、退火、延伸)循环，对PCR仪器的稳定性有着非常高的要求。两温循环虽然能缩短反应时 间，但是DNA聚合酶活性并不处于最优的温度，所以只能扩增较短的片段，而且耗时没有大 幅度降低。等温PCR依赖于高于常温的一个稳定温度(例如60°C )，还是需要一个精确的温 度控制的仪器。
[0003] 室温PCR则依赖重组酶和具有链置换的聚合酶扩增比较短的序列，需要ATP再生 系统，从而使反应体系更加复杂，容易引发副反应，干扰检测效果。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种室温扩增DNA的方法。该方法通过在常温 下，利用原核生物重组酶和真核生物DNA复合物彼此在室温下不同的反应特点，两个系统 协同，能实现DNA在室温下快速复制。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的室温扩增DNA的方法，包括步骤：
[0006] (1)以核酸抽提试剂盒或以氯仿苯酚法，提取模板DNA ;
[0007] (2 )将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10?60分 钟，得到所需的扩增DNA;
[0008] 其中，扩增试剂的组分包括：
[0009] 1) 10 ?30mM ρΗ7· 2 ?7. 8Tris_HAc
[0010] 2 ) 20 ?80mM 醋酸钾（KAc )
[0011] 3) 2 ?5mM 醋酸镁【Mg(Ac)2】
[0012] 4) 1?4mM疏基乙醇
[0013] 5)质量百分比为1%?3. 5%的聚乙二醇（PEG) 20000
[0014] 6) 50 ?100 μ M dNTPs
[0015] 7) 100?500nM引物(包括：一对上游引物和下游引物）
[0016] 8) 0· 5 ?ImM ATP
[0017] 9) 50?100nM RFC (真核DNA扩增环状复合物）
[0018] 10) 100 ?200nM PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen，增殖细胞核抗 原）
[0019] 11) 50?ΙΟΟηΜ pol δ复合酶或人ρ〇1 η聚合酶
[0020] 12) 1 ?2 μ Μ RPA (真核 DNA 复制蛋白 A)。
[0021] 所述步骤（2)中，扩增试剂的组分，还包括：13)0. 5?2. 5μ Μ T4噬菌体紫外敏感 酶1 ;14)0. 5?2. 5μΜ T4噬菌体紫外敏感酶2 ;
[0022] 其中，Τ4噬菌体紫外敏感酶1和Τ4噬菌体紫外敏感酶2,可根据公开的文献 [Farid A. Kadyrov，John W. Drake. Properties of Bacteriophage Τ4 Proteins Deficient in Replication Repair.The Journal of Biological Chemistry，2003,278:25247 -25255】制备得到。
[0023] 步骤（2)的扩增混合液中，模板DNA的浓度为2X 10-8ng/u L?lOng/μ L ;室温的 温度范围为25?42Γ。
[0024] 步骤（2)中，涉及的所有扩增试剂的组分浓度值是在扩增混合液中的终浓度值。
[0025] 另外，步骤（2)的扩增试剂的组分中，真核DNA扩增环状复合物RFC包括： 酵母RFC和人RFC，其中，酵母RFC和人RFC可根据公开的文献【Olga Chilkova，et al.The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588_6597】和【Zhenxin Hu，et al.The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012,287:38442_38448】制备得到；
[0026] 增殖细胞核抗原（PCNA)包括：酵母PCNA和人PCNA ;其中，人PCNA可根据公开 的文献【Zhenxin Hu, et al. The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012,287 :38442_38448】制 备得到；酵母 PCNA 可根据公开的文献【Olga Chilkova，et al· The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588-6597】制备得到；
[0027] ρο?δ复合酶包括：酵母Ρ〇1δ复合酶和人Ρ〇1δ复合酶；其中，人Ρ〇1δ 复合酶可根据公开的文献【Zhenxin Hu，et al. The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287 :38442-38448】制备得到；酵母pol δ复合酶可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588_6597】 制备得到；
[0028] 人pol η聚合酶可根据公开的文献【Hoffman PD，et al· Biochemical evolution of DNA polymerase eta:properties of plant,human, and yeast proteins. Biochemistry，2008,47(16) :4583-4596】制备得到；
[0029] 真核DNA复制蛋白A(RPA)包括：酵母DNA复制蛋白A和人DNA复制蛋白A(人体和 酵母的RPA都是重组的，在大肠杆菌中表达);其中，酵母DNA复制蛋白A可根据公开的文献 【Olga Chilkova,et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588_6597】 制备得到，人DNA复制蛋白A可根据公开的文献【Zhenxin Hu, et al. The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive. The Journal of Biological Chemistry，2012, 287 :38442-38448】制备得到。
[0030] 本发明中，酵母RFC和人RFC，酵母PCNA和人PCNA，酵母RPA和人RPA，人pol δ， 和Τ4噬菌体紫外敏感酶1、2是由大肠杆菌体系表达纯化。
[0031] 另外，所述步骤（2)中，得到所需的扩增DNA包括：人Radl8B基因。
[0032] 本发明的有益效果如下：
[0033] (1)实现了在常温下DNA的扩增，在资源有限(没有PCR仪器或者没有熟练操作人 员）的情况下，使扩增DNA成为可能；
[0034] (2)由于有DNA链复制环极大改进了 DNA复制的速度和效率，克服了常温DNA扩增 依赖ATP再生系统，反应体系不稳定，容易引发副反应等弊端，从而缩短反应时间，得到特 异性扩增产物；
[0035] (3)不需要特别的能量体系，简化了 DNA引物配对以及DNA聚合酶复合物延伸的过 程。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明：
[0037] 图1是常规PCR与本发明的室温扩增DNA的电泳图；其中，1为分子量标准，
[0038] 2 为模板 0· 2ng/ μ L (10000000 拷贝数 / μ L)，3 为模板 0· 02ng/ μ L (1000000 拷 贝数 / μ L)，4 为模板 0· 002ng/ μ L (100000 拷贝数 / μ L)，5 为模板 0· 00002ng/ μ L (1000 拷贝数 / μ L)，6 为模板 0· 0002ng/ μ L( 10000 拷贝数 / μ L)，7 为模板 0· 000002ng/ μ L( 100 拷贝数/ uL)，8 为模板 0· 0000002ng/ yL (10 拷贝数/ yL)，9 为模板 0· 00000002ng/ μ L (1拷贝数/μ L)，10为模板〇.〇〇〇〇〇〇002ng/μ L (0. 1拷贝数/μ L)，11为模板0 (阴性对 照)，且2-11为常规PCR扩增，12为本发明的室温DNA扩增、模板0. 000002ng/ μ L (100拷 贝数/μυ;
[0039] 图2是本发明的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1为阳性标准，2为 30°C、模板 0· 2ng/ μ L (10000000 拷贝数 / μ L)，3 为 20°C、模板 0· 2ng/ μ L (10000000 拷贝 数 / μ L)，4 为 37°C、模板 0· 2ng/ μ L (10000000 拷贝数 / μ L)，5 为 37°C、模板 0· 02ng/ μ L (1000000 拷贝数/ yL)，6 为 37°C、0. 002ng/ μ L( 100000 拷贝数 / μ L)模板，7 为 37°C、模板 0· 0002ng/ μ L (10000 拷贝数 / μ L)，8 为 37°C、模板 0· 00002ng/ μ L (1000 拷贝数 / μ L)，9 为 37°C、模板 0.000002ng/yL (100 拷贝数/yL)，10 为 37°C、模板 0.0000002ng/yL (10 拷贝数 / μ L)，11 为 37°C、模板 〇.〇〇〇〇〇〇02ng/μ L (1 拷贝数 / μ L)，12 为 37°C、模板 0 (阴 性对照）；
[0040] 图3是实施例3中的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1是模板拷贝数为 1拷贝数/ μ L，2是模板拷贝数为10拷贝数/ μ L，3是模板拷贝数为100/ μ L，4是模板拷贝 数为1000/ μ L，5为分子量标准，6为阴性对照，7是模板拷贝数为10000/ μ L，8是模板拷贝 数为100000/μ L，9是模板拷贝数为1000000/μ L ;
[0041] 图4是实施例4的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1是模板拷贝数为1 拷贝数/ μ L，2是模板拷贝数为10拷贝数/ μ L，3是模板拷贝数为100/μ L，4是模板拷贝 数为1000/ μ L，5是模板拷贝数为10000/ μ L，6是模板拷贝数为100000/ μ L，7为分子量标 准。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例中涉及的质粒、PCR试剂、化学试剂等，如未特别说明，可采用商业产 品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。
[0043] 以下实施例中涉及的模板DNA浓度和扩增试剂的组分浓度都为在DNA扩增反应总 体系(反应扩增总混合物）中的终浓度值。
[0044] 以下实施例中涉及的扩增试剂中的蛋白，均可按照如下公开的文献制备：
[0045] 酵母 RFC 和人 RFC 可根据公开的文献【Olga Chilkova, et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588_6597】和【Zhenxin Hu，et al· The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive. The Journal of Biological Chemistry，2012, 287 :38442-38448】制备得到；
[0046] 人 PCNA 可根据公开的文献【Zhenxin Hu，et al· The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry, 2012.287 :38442-38448】制备得到；酵母PCNA可根据公开的文献【Olga Chilkova，et al.The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007, 35 (19) :6588-6597】制备得到；
[0047] 人 pol δ 复合酶可根据公开的文献【Zhenxin Hu，et al· The Human Lagging Strand DNAPolymerase δ Holoenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistir，2012,287 :38442-38448】制备得到；酵母pol δ复合酶可根据公开的文献 【Olga Chilkova, et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588_6597】 制备得到；
[0048] 人pol η聚合酶可根据公开的文献【Hoffman PD，et al. Biochemical evolution of DNA polymerase eta:properties of plant,human, and yeast proteins. Biochemistry，2008,47(16) :4583-4596】制备得到；
[0049] 酵母DNA复制蛋白A (RPA)可根据公开的文献【Olga Chilkova，et al· The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res，2007,35(19) :6588-6597】制备得到；人 DNA 复 制蛋白 A (RPA)可根据公开的文献【ZhenxinHu，et al· The Human Lagging Strand DNA Polymerase δ Holoenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry, 2012.287 :38442-38448】制备得到。
[0050] T4噬菌体紫外敏感酶1和T4噬菌体紫外敏感酶2,可根据公开的文献【Farid A.Kadyrov, John W. Drake. Properties of Bacteriophage T4Proteins Deficient in Replication Repair. The Journal of Biological Chemistry,2003, 278:25247 - 25255] 制备得到。
[0051] 实施例1常规PCR与本发明的对比实验
[0052] -、模板DNA的制备
[0053] 采用商业化的核酸抽提试剂盒（Qiagen公司），按照其说明书进行提取 pUC18-Radl8B质粒的DNA。其中，该pUC18质粒上含有人体Radl8B基因。
[0054] 其中，pUC18_Radl8B质粒的构建如下：
[0055] 以人cDNA为模板(购自上海天裕生物科技有限公司），并以AAA TCT AGA TAT GAA TCA TTCCAG CTT TG (SEQ ID NO. 1 所示）和 AAA GGT ACC TGT CGA CCC CGG CCC GTA G (SEQ ID N0. 2所示）为上下游引物，经PCR扩增，得到人Radl8B基因扩增片段，然后，对该 人Radl8B基因扩增片段以Xbal和ΚρηΙ双酶切，获得人Radl8B基因的DNA片段，然后，将 该DNA片段插入pUC18质粒(购自上海天裕生物科技有限公司）中，用T4连接酶连接，转化 成功后，经测序验证，获得pUC18-Radl8B质粒。
[0056] 二、扩增人Radl8B基因
[0057] 常规PCR与本发明室温DNA扩增中的条件如下：
[0058] 1、人Radl8B基因的引物序列
[0059] 正向引物（上游引物）:5'-CATTCCAGCTTTGTTCAACAATGGCCGAAACTC-3'（SEQ IDN0. 3 所示）
[0060] 反向引物（下游引物）：5'-ATG TTT CAT CCA AAT GTG TAT GCT GAT GGT AGC-3' (SEQID Ν0· 4 所示）
[0061] 2、反应体系
[0062] 常规PCR的反应总体积为10 μ L，采用商业化的PCR反应试剂盒(购于上海天裕 生物科技有限公司）进行制备，具体为：试剂盒中的2Χ的预混液中，加入正向和反向引物 后，加入不同浓度的模板后，以超纯水补足到1〇μ L。其中，DNA模板分别为0. 2ng/y L、 0. 02ng/μ L>0. 002ng/μ L>0. 0002ng/μ L>0. 00002ng/μ L>0. 000002ng/μ L>0. 0000002ng/ yL、〇.〇〇〇〇〇〇02ng/yL (PCR反应总体系中的终浓度）；引物浓度为：250nM的上述正向引 物、250nM的上述反向引物。
[0063] 本实施例的室温扩增DNA的方法如下：
[0064] 室温30°C下的DNA扩增的反应总体积为10 μ L，其中，DNA模板为0. 000002ng/ μ L，DNA扩增中的扩增试剂是由以下的组分构成：
[0065] 1) 20mM pH7. 5Tris-HAc
[0066] 2) 50mM KAc
[0067] 3) 3mM Mg(Ac)2
[0068] 4) 2mM疏基乙醇
[0069] 5)质量百分比为2%的聚乙二醇（PEG) 20000
[0070] 6) 50 μ M dNTPs (上海天裕生物科技有限公司）
[0071] 7)250nM的SEQ ID N0. 3所示的正向引物、250nM的SEQ ID N0. 4所示的反向引物
[0072] 8) ImM ATP
[0073] 9)100nM 酵母 RFC
[0074] 10 ) 200nM 酵母 PCNA
[0075] 11) 100nM 酵母 pol δ 复合酶
[0076] 12)2以]?酵母1?^。
[0077] 3、反应条件
[0078] 常规PCR反应条件为：将模板DNA、引物与PCR反应试剂盒中的反应试剂混合后， 在PCR仪(杭州博日PCR扩增仪)上，以95°C 300秒，然后95°C 60秒，55°C 90秒，72°C 30秒， 扩增循环数为30,总耗时1小时45分钟。
[0079] 本发明的室温DNA扩增的反应条件为：将模板DNA与上述扩增试剂混合，在室温 (30°C )下，进行DNA扩增30分钟。
[0080] 4、扩增人Radl8B基因的产物电泳检测
[0081] 人Radl8B基因的扩增产物以1. 5%琼脂糖电泳检测，上样量是4 μ L，结果如图1所 示，其中，人Radl8B基因的扩增产物长度为226bp。
[0082] 由图1可知，常规PCR扩增中，在目标产物前沿，有非常明显的引物二聚体，而且随 着模板浓度越低，引物二聚体越明显。同时，在模板浓度低于10000拷贝数/ μ L时，常规 PCR无法有效扩增。图1中，本发明的室温DNA扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测 的引物二聚体。
[0083] 因此，本发明与常规PCR相比，具有以下优点：检测所需模板浓度低，不易于形成 引物二聚体，耗时更短，可以依赖仪器。
[0084] 实施例2人体基因 Radl8B的室温扩增
[0085] 一、模板DNA的制备
[0086] 采用商业化的核酸抽提试剂盒（Qiagen公司），按照其说明书进行提取 pUC18-Radl8B质粒的DNA，获得模板DNA。
[0087] 其中，模板DNA在30°C孵育下，按10倍比例依次稀释，获得稀释的模板DNA。
[0088] 二、室温DNA扩增
[0089] 将模板DNA (包括稀释的模板DNA)与扩增试剂混合，在30°C下，进行DNA扩增30 分钟（DNA扩增的反应总体积为10 μ L)，获得人Radl8B基因的DNA扩增产物；其中，扩增试 剂是由以下的组分构成：
[0090] 1) 20mM pH7. 5Tris-HAc
[0091] 2) 50mM KAc
[0092] 3) 3mM Mg(Ac)2
[0093] 4 ) 2mM巯基乙醇
[0094] 5)质量百分比为2%的聚乙二醇（PEG) 20000
[0095] 6) 50 μ M dNTPs (上海天裕生物科技有限公司）
[0096] 7)250nM的SEQ ID N0. 3所示的正向引物、250nM的SEQ ID N0. 4所示的反向引物
[0097] 8) ImM ATP
[0098] 9)100nM 酵母 RFC
[0099] 10 ) 200nM 酵母 PCNA
[0100] 11) 100nM 酵母 pol δ 复合酶
[0101] 12)2以]?酵母1?^
[0102] 13) 1 μ MT4噬菌体紫外敏感酶1
[0103] 14) 1 μ ΜΤ4噬菌体紫外敏感酶2。
[0104] 将DNA扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶【10% (10g/100mL)非变性】电泳，结果如图2 所示。该图中，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度 为1拷贝数/μ L时，仍然能检测出。
[0105] 实施例3人体基因 Radl8B的室温扩增
[0106] 按照实施例2的方法进行操作，其中，将扩增试剂修改成由如下的组分所构成：
[0107] 1) 30mM pH7. 8Tris-HAc
[0108] 2) 80mM KAc
[0109] 3) 5mM Mg (Ac) 2
[0110] 4)4mM巯基乙醇
[0111] 5)质量百分比为3. 5%的聚乙二醇20000
[0112] 6) 80 μ M dNTPs
[0113] 7)500nM的SEQ ID NO. 3所示的正向引物、500nM的SEQ ID NO. 4所示的反向引物
[0114] 8) 0. 8mM ATP
[0115] 11) 80nM 人 pol η 聚合酶
[0116] 12)1.5yM、RPA
[0117] 13) 1μΜΤ4噬菌体紫外敏感酶1
[0118] 14) 1 μ ΜΤ4噬菌体紫外敏感酶2。
[0119] 本实施例中的DNA扩增产物，经聚丙烯酰胺凝胶（10%非变性)电泳，结果如图3所 示，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度为1拷贝数 /μ L时，仍然能检测出。
[0120] 实施例4人体基因 Radl8B的室温扩增
[0121] 按照实施例2的方法进行操作，其中，将扩增试剂修改成由如下的组分所构成：
[0122] 1) 10mM pH7. 2Tris-HAc
[0123] 2) 20mM KAc
[0124] 3) 2mM Mg (Ac) 2
[0125] 4)lmM巯基乙醇
[0126] 5)质量百分比为1%的聚乙二醇20000
[0127] 6) 100 μ M dNTPs
[0128] 7)100nM的SEQ ID NO. 3所示的正向引物、100nM的SEQ ID NO. 4所示的反向引物
[0129] 8) 0. 5mM ATP
[0130] 9)50nM 人 RFC
[0131] 10) lOOnM 人 PCNA
[0132] 11) 50nM 酵母 pol δ 复合酶
[0133] 12)1μΜ人RPA
[0134] 13) 1 μ MT4噬菌体紫外敏感酶1
[0135] 14) 1 μ ΜΤ4噬菌体紫外敏感酶2。
[0136] 本实施例中的DNA扩增产物，经聚丙烯酰胺凝胶（10%非变性)电泳，结果如图4所 示，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度为1拷贝数 /μ L时，仍然能检测出。
[0137] 实施例5人体基因 Radl8B的室温扩增
[0138] 按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为25°C，反 应60分钟后，电泳检测反应产物，依然能检测出226bp的扩增产物。
[0139] 实施例6人体基因 Radl8B的室温扩增
[0140] 按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为42°C，反 应10分钟后，电泳检测反应产物，依然能检测出226bp的扩增产物。
[0141] 实施例7人体基因 Radl8B的室温扩增
[0142] 按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为25°C，反 应30分钟后，电泳检测反应产物，检测出226bp的扩增产物。
[0001] 序列表 <110〉胡振新 <120〉室温扩增DNA的方法 <130>CPC-NP-12-17243 <160>4 <170>PatentTn version 3.3 <210>1 <211)29 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>raisc_feature <223〉引物 <400>1 aaatctagat atgaatcatt ccagctttg 29 <210>2 <211)28 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>misc_feature <223〉引物 <400>2 aaaggtacct gtcgaccccg gcccgtag 28 <210>3 <211)33
[0002] <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>misc_feature <223〉引物 <400>3 cattccagct ttgttcaaca atggccgaaa etc 33 <210>4 <211>33 <212>DNA 〈213>人工序列 <220〉 <221>misc_feature <223〉引物 <400>4 atgtttcatc caaatgt'gt.a tgctgatggt age 33
【权利要求】
1. 一种室温扩增DNA的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 提取模板DNA ; (2) 将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10?60分钟， 得到所需的扩增DNA ; 其中，扩增试剂的组分包括： 1) 10 ?30mM pH7. 2 ?7. 8Tris-HAc 2) 20?80mM醋酸钾 3) 2?5mM醋酸镁 4) 1?4mM巯基乙醇 5) 质量百分比为1%?3. 5%的聚乙二醇20000 6) 50 ?ΙΟΟμΜ dNTPs 7) 100 ?500nM 引物 8) 0.5 ?ImM ATP 9) 50?ΙΟΟηΜ真核DNA扩增环状复合物RFC 10) 100?200nM增殖细胞核抗原PCNA 11) 50?ΙΟΟηΜ ρο? δ复合酶或人ρ〇1 η聚合酶 12) 1?2μ Μ真核DNA复制蛋白A。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，扩增试剂的组分，还包括： 13) 0. 5?2. 5 μ Μ T4噬菌体紫外敏感酶1 ; 14) 0. 5?2. 5 μ Μ Τ4噬菌体紫外敏感酶2。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)的扩增混合液中，模板DNA的 浓度为 2Χ 10 8ng/y L ?lOng/μ L。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，室温的温度范围为25? 42。。。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，扩增试剂的组分浓度值是 在扩增混合液中的终浓度值。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，引物包括：一对上游引物 和下游引物。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，真核DNA扩增环状复合物 RFC包括：酵母RFC和人RFC ; 增殖细胞核抗原PCNA包括：酵母PCNA和人PCNA ; ρο?δ复合酶包括：酵母ρ〇1δ复合酶和人ρ〇1δ复合酶； 真核DNA复制蛋白Α包括：酵母DNA复制蛋白Α和人DNA复制蛋白Α。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，得到所需的扩增DNA包括： 人Radl8B基因。
【文档编号】C12N15/10GK104059905SQ201310086850
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】胡振新 申请人:胡振新