水稻抗病相关基因pal4的制作方法

水稻抗病相关基因pal4的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】。具体涉及一个水稻抗病相关基因PAL4的功能验证及应用。本发明验证的PAL4基因是水稻抗病反应中的正调控因子，它参于调控水稻抵抗从根部侵染的稻瘟病菌。所述的PAL4基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其编码对pH值和温度敏感的苯丙氨酸解氨酶，该苯丙氨酸解氨酶的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示。本发明还公开了所述基因在水稻遗传改良中的应用。
【专利说明】水稻抗病相关基因 PAL4

【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程【技术领域】。具体涉及一个水稻抗病相关基因 PAL4的功 能验证。本发明验证的PAL4基因是水稻抗病反应中的正调控因子，它参于调控水稻抵抗从 根部侵染的稻瘟病菌。

【背景技术】
[0002] 植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病 毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：（1)寄主植物内的病原菌成功繁 殖引起相关的病症；（2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。通过利用抗性 基因资源来改良植物抗病性既可以预防病害又能够减少喷施农药带来的环境危害。
[0003] 水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水 稻稻癌病由稻癌病菌（Magnaporthe oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的真菌性病害 之一。目前普遍认为稻瘟菌是一种典型的地上组织（比如叶片等）侵染的半活体营养型的 病原菌，其侵染途径是：分生孢子在病谷和染病的残留稻草中越冬，当气温和湿度合适的条 件下病原菌产生大量分生孢子，而这些孢子通过空气扩散到水稻的地上组织，完成侵染水 稻细胞的过程导致水稻出现病症。而这些被侵染的细胞又产生新的菌丝分生孢子释放到环 境中再次扩散到其他水稻完成重复侵染，从而导致病害的迅速蔓延。然而随着人们对稻瘟 病菌的不断认识，研究者发现稻瘟病菌可以由根部侵染水稻，在根部和地上部分产生病斑， 并稻瘟菌根部侵染也和叶部侵染一样适用于基因对基因假说（Sesma和0sb 〇Urn，2004)。进 一步的研究表明，稻瘟菌从根部侵染水稻属于活性营养型，可以在整个植株上产生系统性 侵染，具有典型的土传病原菌的特征和特性（Marcel等，2010)。近年来真菌分类学家又把 稻癌病菌划分到了新建立的包含上传病原菌的Magnaporthaceae家族（Rossman等，2007), 改变了人们对稻瘟病菌只能从地上组织侵染的传统观点。而这一发现也对稻瘟病菌的流行 病学方面的观点产生了重要的意义，从根部侵染可能是稻瘟病菌的初侵染源之一，是稻瘟 病菌发生和流行的一个重要影响因素。也有研究指出稻瘟病菌的循环是由带病的水稻种子 在萌发的过程中由于稻瘟病菌的不断积累导致这些带病的种子在很小就死亡，而这些死亡 的染病水稻苗就作为最初的感染源侵染附近健康植株的根和叶片，感染新萌发秧苗根和叶 形成菌丝，然后这些染病的植株再发展病症直到再次感染种子完成循环（Faivre-Rampant 等，2012)。对于水稻来说，不同的侵染途径会导致水稻防御反应相关基因表达强度以及时 空的差异。因此，研究水稻抗稻瘟根部侵染的病程相关基因有助于理解水稻抗稻瘟病的抗 性机制，对于抗稻瘟品种的选育也提供了新的策略，在学术上以及生产应用上都有深远的 意义。
[0004] 植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为 两类：⑴主效抗病基因，又称MR (major resistance)基因和⑵抗病相关基因。目前人 们普遍认为主效抗病基因编码蛋白的主要功能是作为受体直接或间接与病原物质相互作 用来启动植物体内的抗病信号传导路径（Kou和Wang，2010 ;Zhang和Wang，2013)。抗病基 因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但是在运用抗病基因改良植物抗性的过程 中受到以下几点的限制：（1)主效抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害 白叶枯病的主效抗病基因大约只有37个；(2)主效抗病基因具有病原种类和病原生理小种 特异性，导致抗病范围有限；（3)因为病原的快速突变，一个主效抗病基因的作用往往不能 持久。抗病相关基因是指除主效抗病基因外所有参于抗病反应的基因，通常认为它们的编 码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。 这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导 前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因（Maleck等，2000 ;Schenk等， 2000 ;Zhou等，2002)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗 病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但基于以下原因，它们是值得大力 开发的基因资源：（1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用， 这类基因是具有持久抗性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原 特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；（3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽 然鉴定了很多抗病相关基因（Zhou等，2002 ;Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的 作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。分离克隆抗 病相关基因对水稻抗病机理的研究有重大意义，同时抗病相关基因在应用上比抗病基因提 供了更为广谱以及长效的抗性。了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种 的抗性，控制病害的发生。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因进行水 稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育 种和改良技术所不能达到的。
[0005] 本发明所描述的苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL)基因属 于一个基因家族，广泛存在于植物中，是植物体内多种次生代谢途径的关键酶。莽草酸途径 产生的苯丙氨酸经过PAL解氨作用后生成肉桂酸，进入苯丙烷类代谢途径，可生成类黄酮、 木质素等多种次生代谢产物，一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或者间接生成 的，而产生的次生产物在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中都起着重要的作用。近些年 来，随着研究的不断深入，发现许多黄酮类物质具有抗自由基，调解血脂，抗癌，抗菌抗炎的 作用，掀起了黄酮类物质研究开发利用的热潮。苯丙烷类和黄酮类化合物的代谢途径是植 物重要的次生代谢途径之一，黄酮类化合物的生物合成都是通过苯丙烷类生物合成途径而 来，而PAL是其中极为关键的酶。由此产生的黄酮类化合物柚皮素具有多种生物活性，可以 被多种酶类进行结构修饰生成衍生物，是许多代谢产物的前体，具有抗菌、抗炎、清除自由 基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。柚 皮素经过转甲基酶转入一个甲基可以形成樱花素，樱花素是一种很好的黄烷酮类植物抗 毒素，是植物防御体系的重要组成部分。
[0006] 综上所述，发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制稻瘟病害的发生、减少 或避免水稻病害所带来的损失最经济有效的措施。另一方面，PAL是苯丙烷类和黄酮类化合 物代谢途径中极为重要的酶，通过对它的发掘对于研究次生代谢反应有很大的利用价值， 同时也能更好的将黄酮类代谢产物运用于医药，食品领域。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的是鉴定一个水稻PAL基因在水稻-病原互作中的功能，为利用这个 基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。 申请人:将这个基因命名为PAL4。
[0008] 本发明涉及的PAL4基因赋予水稻对由从其根部侵染的稻瘟病菌所引起的病害产 生抗病反应。该基因的DNA序列如序列表SEQ ID N0:1所示，或者基本上相当于SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0:1所示序列的亚片段。对其序列进行 分析表明，它编码一种苯丙氨酸解氨酶。阻止这种酶的表达，减弱水稻对稻瘟病的抗性，同 时降低其根中黄酮类次生代谢产物如植物抗毒素的含量。
[0009] 本发明涉及分离一种包含0sPAL4基因的DNA片段并鉴定其功能，提供了该基因 的核苷酸序列和氨基酸序列。其中，所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所示， 或者基本上相当于SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，也包括在添加、取代、插入或缺失一 个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，或者其功能相当于SEQ ID N0 :1所 示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它编码一种苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase)，将苯丙氨酸解氨基形成肉桂酸。
[0010] 在本发明的实施例部分， 申请人:阐述了对PAL4基因的功能验证过程以及其编码 的苯丙氨酸解氨酶的特点。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 序列表SEQ ID N0 :1 :是PAL4基因的核苷酸序列。序列全长为2261bp。
[0012] 序列表SEQ ID NO :2 :是PAL4基因编码的蛋白质的氨基酸序列。编码713个氨基 酸。
[0013] 图1 :本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因 PAL4以及验证该基因功能的流程 图。
[0014] 图 2 :用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR) 技术检测感病水稻品种C039和抗病水稻家系C101A51接稻瘟病菌菌株CHL358后PAL4基 因的表达模式。水稻样品来源于接种CHL358后0. 5、1、2、24、72、120、168小时后的材料。
[0015] 图3 :PAL4基因结构以及T-DNA插入突变体05Z11DD35中T-DNA插入位点⑷和 突变体基因型的验证分析（B)。图中横线条代表PAL4基因的内含子，黑色横柱条表示外显 子的编码序列。数字表示每一种结构的核苷酸数目和T-DNA插入位点前核苷酸数目（按 序列表SEQ ID NO :1.所示序列编号）。"ATG"和"TAG"分别是翻译起始密码和终止密码。 箭头PAL-1F、PAL1R-2、NTLB5分别表示用来验证突变体是否正确的PCR引物；其中PAL-1F 和PAL1R-2引物是根据PAL4基因序列设计，分别位于T-DNA插入位点两侧；NTLB5是根据 T-DNA内部序列设计的引物。图3，B中的WT(对照）表示野生型（非转基因）水稻品种中 花11。
[0016] 图4 :是本发明涉及的原核表达载体pMAL_c2示意图。
[0017] 图5 :PAL4蛋白具有苯丙氨酸解氨基的活性。PAL4蛋白催化底物L-苯丙氨酸脱 氨基形成产物反式肉桂酸。ck:原核表达标签蛋白。
[0018] 图6 :温度和pH值影响PAL4蛋白的酶活性。
[0019] 图7 :PAL4基因 T-DNA插入突变体植株（05Z11DD35)对稻瘟病抗病性减弱。C039 是水稻稻瘟病感病品种。对照为水稻品种中花11 (野生型），是T-DNA插入突变体遗传转化 的受体。对照1是从05Z11DD35株系后代中分离出的阴性植株。突变体的病斑面积较对照 显著增加。感染率是指每个水稻细胞中含有的稻瘟病菌细胞的比率。突变体植株中的感染 率高于中花11野生型对照和阴性对照。
[0020] 图8 :PAL4基因 T-DNA插入突变体植株（05Z11DD35)植株根中的PAL酶活、水杨酸 和黄酮类植保素的含量降低。对照为水稻品种中花11 (野生型），是T-DNA插入突变体遗传 转化的受体，对照1是从05Z11DD35株系后代中分离出的阴性植株。酶活的下降导致水杨 酸下降到原来的三分之一，导致樱花素和柚皮素的含量减少95%以上。

【具体实施方式】
[0021] 本发明的前期研究工作结果揭示，在水稻-细菌性病原互作中，PAL4(原文献中命 名PAL)基因的表达量发生改变，提示该基因可能参于水稻抵抗病原菌反应（Qiu等，2007)。 为了验证这一分析推测，产生了本发明。
[0022] 以下实施例中进一步定义本发明，图1描述了鉴定PAL4基因功能的流程。根据以 上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发 明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0023] 实施例1 :PAL4基因在不同水稻品种中的表达模式分析
[0024] 用 PAL 结构域 PF00221 (Pfam database，http://pfam. sanger. ac. uk/)在水稻全 基因组序列中进行Blastp检索，得到9个PAL家族成员。本发明所研究的基因在MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice. plantbiology. msu. edu/)中的编号为 L0C_ 0s02g41680,按照各个PAL家族成员在染色体的位置排列， 申请人:将该基因命名为PAL4。
[0025] 为了证实PAL4基因是否参与抗病反应的调控，本发明采用定量反转 录 _PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术（Qiu 等，2007)分析 了 PAL4基因在感病水稻品种C039和抗病水稻家系C101A51中接种稻瘟病菌CHL358后的 表达模式。CHL358是常用稻瘟病菌株（Fu等，2011)。C039是国际上常用的稻瘟病感病水 稻品种，C101A51是以C039为背景的含有抗稻瘟病主效基因 Pi-2的近等基因系（Jiang和 Wang，2002)。稻瘟病菌接种采用喷雾法对3-4叶期的水稻进行接种（Fu等，2011)。接种后 分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1?5 μ g总RNA用DNasel (美国 Invitrogen公司）处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等（2002)的方法， 使用〇lig〇(dT) 15寡聚引物和M-MLV反转录酶（购自美国Promega公司）进行反转录。采用 实时定量PCR分析试剂盒SYBR?GreenPCR Master Mix (宝生物工程（大连）有限公司）， 并根据试剂盒使用说明书，在 ABI 7500Real_Time PCR system(美国 Applied Biosystems 公司）仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白（actin)基因的表达量衡量、并 均一化样品RNA含量（Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的PAL4基因特异PCR引物是DL-〇sP AL4F(5， -GGGCAACCCAGTGACCAA-3')和DL-〇sPAL4R(5， -CGATTGCCTCGTCGGTCTT-3')， 肌动蛋白基因 PCR 引物是 actinFb' -TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3')和 actinRb' -A ATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3 ; )〇
[0026] 实验结果显示接种稻瘟病菌CHL358后，PAL4基因在感病品种C039中被迅速诱导 直至72小时出现表达高峰，而抗病品种中PAL4的表达首先有个抑制过程，直至72小时才 被诱导上升（图2)。C101A51携带抗稻瘟病主效基因 Pi-2,在没有稻瘟病菌侵染时，PAL4 基因在抗病水稻C101A51中的表达量显著高于在感病水稻C039中的表达量（图2)。这一 结果提示：PAL4基因可能参与抗稻瘟病反应的调控。
[0027] 实施例2 :确定水稻品种中花11中的PAL4基因的序列和结构
[0028] 1.分离水稻品种中花11中的PAL4基因的序列
[0029] 水稻全基因组序列数据库的L0C_0s02g41680位点信息中包含有PAL4基因的cDNA 序列[GenBank(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)注册号：AK068993]，该 cDNA 序列编码 713 个氨基酸。水稻全基因组序列数据库中的水稻序列来自于粳稻品种日本晴（Oryza sativa ssp. Japonica)，cDNA序列AK068993也来自于日本晴。
[0030] 我们根据水稻品种日本晴中的PAL4基因编码区两侧的序列设计了一对PCR引物： EC0R1-0SPAL4F(5 ; -ATGAATTCATGGAGTGCGAGAACGGCCGC-3 ')(下划线代表用于载体连接 的接头中EcoRI限制性内切酶消化位点）和XBA1-0SPAL4R(5 ' -ATTCTAGATCAGCAGATTGGCA GGGGCTC-3')(下划线代表用于载体连接的接头中的Xbal限制性内切酶消化位点）。利用 这对PCR引物从粳稻品种中花11中扩增包含PAL4基因的cDNA片段并将这个片段克隆到 载体上。中花11是常用水稻品种（Wu等，2003)。利用美国Applied Biosystems公司的测 序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法（美国Applied Biosystems公司）从载体两端测序 得到PAL4的编码区序列。同时利用位于基因内部的PCR引物PAL3RC -TGAGTCAGGTGGTC GGTGTA-3 测量内含子的序列，序列拼接后得到一长2261bp的DNA序列（见序列表SEQ ID NO :1)，它包含完整的PAL4基因的编码序列（图3, A)。
[0031] 2.水稻品种中花11中的PAL4基因结构分析
[0032] 申请人:将中花11中的PAL4基因组测序以后，与水稻品种日本晴中的PAL4基因序 列进行比较，发现编码区以及内含子的序列与日本晴中完全相同。比较中花11中的PAL4 基因的基因组序列和cDNA序列，确定中花11中的PAL4基因编码区包含两个外显子和一个 内含子（图3，A)。第一个外显子由395个核苷酸组成（位于序列表SEQ ID N0:1的l-395bp 处），第一个内含子由119个核苷酸组成（位于序列表SEQ ID NO :1的396-514bp处），第 二个外显子由1747个核苷酸组成（位于序列表SEQ ID N0:1的515-2258bp处）（图3，A)。 下文中涉及的PAL4基因均来自水稻品种中花11。
[0033] 3.PAL4基因编码产物的分析
[0034] PAL4基因编码一个由713个氨基酸组成的蛋白质（序列表SEQ ID N0 :2)，具有苯 丙氨酸/组氨酸解氨酶保守结构域（MacDonald和Cunha，2007)。已知苯丙氨酸解氨酶 可以催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸（Koukol和Conn, 1961)。为了验证PAL4蛋白具有 苯丙氨酸解氨酶活性，本发明在大肠杆菌中表达PAL4蛋白，分离纯化该蛋白用于酶活性分 析。具体操作如下：从水稻品种中花11中抽取总RNA和通过反转录获得cDNA，以此为模板 采用PCR技术扩增PAL4基因的编码区的cDNA片段。用于扩增的PCR引物为EC0R1-0SPAL 4F(5 ; -ATGMTTCATGGAGTGCGAGAACGGCCGC-3 ;)(下划线代表用于载体连接的接头中EcoRI 限制性内切酶消化位点）和 XBA1-0SPAL4R(5 ' -ATTCTAGATCAGCAGATTGGCAGGGGCTC-3 ;) (下划线代表用于载体连接的接头中的Xbal限制性内切酶消化位点）。将PCR产物与TA 克隆载体PMD18-T(购自宝生物工程（大连）有限公司）连接，通过酶切筛选阳性克隆，再 经测序验证无核苷酸突变。用限制性内切酶EcoRI和Xbal消化带有PAL4基因编码区段 的阳性克隆和PMAL-C2载体[见图4 ;购自纽英伦生物技术（北京）有限公司];酶切完毕 在65°C水浴10分钟灭活限制性内切酶。将酶切片段在0. 8%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收 目的条带。用包含PAL4基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应。通过酶切及测序验 证阳性克隆，将获得的重组质粒电转化（电转仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压 为1800v，具体操作参考该仪器的使用说明书）进入大肠杆菌表达用宿主菌株BL21 (购自德 国Novagen公司）进行原核表达。将pMAL-c2空载体也导入BL21作为对照。pMAL-c2载 体带有麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein, MBP)标签。挑取单克隆培养过夜，以 1 : 100 (体积比）扩大培养2-3小时，待其0D值达到0. 5,加入异丙基硫代-β -D-半乳糖 苷（IPTG)至终浓度为ImM/L，诱导3小时，收集菌体，表达蛋白（空载体对照带有ΜΒΡ标签， PAL4重组蛋白氨基端带有MBP标签）用麦芽糖亲和树脂Amy lose Resin[购自纽英伦生物 技术（北京）有限公司]进行纯化，操作参照说明书。PAL4蛋白酶反应程序参照前人的方 法略作修改（Hu等，2011)。具体操作如下：在lmL Tris-HCl缓冲液中加入500yL 20mM底 物L-苯丙氨酸和3μ L纯化的PAL4蛋白，以空载体表达出的标签蛋白作为对照，在37°C反 应lh后，加入0. 25mL 4M的盐酸终止反应。用甲醇：水（体积比）为1 : 1的溶剂将反应 产物稀释10倍后进超快速液相色谱-质谱/质谱联用仪（UFLC-MS/MS) (SHIMADZU，日本） 做定性分析。用Tecan光栅型酶标仪（INFINITE 200,奥地利）测量290nm的吸光值计算样 品酶活做定量分析。样品中蛋白质含量的测定采用Bradf〇rd(1976)报道的方法。L-苯丙 氨酸和反式肉桂酸的标准样品分别从Duchefa和Sigma公司购得。
[0035] 结果显示，加入MBP-PAL4重组蛋白进行反应后会生成产物反式肉桂酸，而MBP标 签蛋白对照不能生成反式肉桂酸，证明PAL4蛋白是苯丙氨酸解氨酶（图5)。MBP-PAL4蛋 白在碱性环境下酶活性更高，且酶活随着温度的升高逐渐上升，直到55°C达到峰值后随温 度的上升快速下降（图6)。这些结果说明PAL4是对pH值和温度敏感的苯丙氨酸解氨酶。
[0036] 实施例3 :PAL4基因在水稻-病原互作中的功能验证
[0037] 1.筛选水稻突变体库和突变体植株插入位点共分离分析
[0038] 为了验证PAL4基因在水稻-病原互作中的功能， 申请人:利用PAL4基因的序列检 索水稻T-DNA插入突变体数据库RMD (Zhang等，2006)，发现该数据库中的突变体05Z11DD35 具有375bp的侧翼序列，该侧翼序列与PAL4基因的一段序列（序列表SEQ ID N0 :1中的 483-857bp)同源。提示T-DNA插入在PAL4基因内部。序列比较分析提示T-DNA插入在 序列表SEQ ID N0:1所示序列的857bp后，即T-DNA插入在PAL4基因的第2个外显子内 (图3，A)。PAL4基因 T-DNA插入突变体（05Z11DD35)具有粳稻中花11的遗传背景（Wu等， 2003)。
[0039] 为了验证所获得的突变体的正确性， 申请人:根据PAL4基因的序列设计了一对位 于 T-DNA 插入位点两侧的 PCR 引物（图 3, A) :PAL1F(5 ' -TCACGGAGTTGATCTCACGC-3 ') 和 PAL1R-2 (5 ' -CACAGGAGGACCAAGGAGGG-3 ')。另外，根据 T-DNA 序列设计了 PCR 引物 N TLB5 (5 ' -AATCCAGATCCCCCGAATTA-3 ' ) (Wu 等，2003)。利用这 3 条 PCR 引物分析所获得突 变体的T-DNA是否插入在PAL4基因的内部。这一分析的基本原理是：在05Z11DD35纯合突 变体（一对同源染色体中都有T-DNA的插入）植株中，由于插入的T-DNA片段大约14kb(Wu 等，2003)，利用引物PAL1F和PAL1R-2、采用常规PCR方法无法扩增如此大的DNA片段，而用 弓丨物PAL1R-2和NTLB5可以扩增一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在 05Z11DD35的杂合突变体（一对同源染色体中只有一条染色体中有T-DNA插入）植株中，用 引物PAL1F和PAL1R-2可以扩增一段大小已知的水稻基因组的DNA片段，用引物PAL1R-2 和NTLB5也可以扩增一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在05Z11DD35 的阴性（家系中分离出的没有T-DNA插入的）植株中，用引物PAL1F和PAL1R-2可以扩增 一段大小已知的水稻基因组DNA片段，但是用引物PAL1R-2和NTLB5不能够扩增出DNA片 段。 申请人:对随机选取的10株05Z11DD35家系的?\植株进行了上述PCR分析。结果显示 其中6株（1、2、3、4、6、7)是纯合突变体，4株（5、8、9、10)是杂合突变体（图，3Β)。这些结 果说明 申请人:获得的水稻材料05Z11DD35是PAL4基因突变体。
[0040] 2.突变体植株对稻瘟病的抗性分析
[0041] 申请人:对纯合的PAL4基因 T-DNA插入突变体（05Z11DD35)以及分离出来的阴性 对照（05Z11DD35阴性）植株和具有同样遗传背景的野生型对照水稻品种中花11进行了根 部接种稻瘟病菌RBll(Fu等，2011)。具体方法如下：培养管底部填充3厘米厚的蛭石（蛭 石用蒸馏水浸泡1小时后浙干），放入和培养管孔径一样大小的生长均匀并铺满稻瘟病菌 的菌丝块，然后铺上1厘米厚的蛭石，放入正常发芽后的水稻种子，再在表层铺上少许蛭石 以固定种子。密封培养管以阻止水分的流失，放入生化培养箱内生长。光强为12000-15000 勒克司，设置温度28°C，16小时光照8小时黑暗循环处理。直至水稻长至3叶期（大约 15天左右），调查叶片上出现的病斑。同时取水稻叶片DNA样品进行稻瘟病菌侵染率分析 (Kawano等，2010)。DNA的抽提方法是：样品在抽提缓冲液[50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，150mM NaCl，100mM EDTA(pH8.0)]中充分研磨，加入50yL 10%SDS，37°C处理1-3小时，处理后加 入 75 μ L5M NaCl，混匀后加入 65 μ L CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB 溶于 0· 7M NaCl)与 65°C 处理30-60分钟，加入等体积氯仿：异戊醇（体积比24 : 1)混匀15分钟，10000g离心10 分钟，小心吸取上清。加入0. 6倍体积异丙醇与-20°C沉淀1小时后10000g离心10分钟。 弃上清，沉淀加入75 %乙醇，10000g离心5分钟，吹干后溶水。得到的DNA采用实时定量PCR 分析试剂盒SYBR?Green PCR Master Mix(宝生物工程（大连）有限公司），并根据试剂盒 使用说明书，在 ABI7500 Real-Time PCR system(美国 Applied Biosystems 公司）仪器上 进行实时定量PCR反应。分别用水稻内源泛素（ubiquitin)基因的PCR引物ubiquitinF(5 ' -AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3'）和 ubiquitinR(5' -ACGATTGAITTAACCAGTCCATGA-3'）扩增的 样品含量定量DNA样品中含有的水稻细胞量，用稻瘟病菌内源的基因 Pot2的PCR引物Pot2 F(5'-ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG-3'）和 Pot2R(5'-AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT-3'）扩增的 样品含量定量DNA样品中含有的稻瘟病菌细胞量。由于泛素基因在水稻中仅有1个拷贝而 Pot2基因在稻瘟病菌中有100个拷贝，所以感染率计算的公式为I = U(NubiquitinX 100) (Kawano 等，2010)。
[0042] 实验结果显示接种稻瘟病菌后，感病对照C039对稻瘟病菌株RB11表现为感病，野 生型中花11 (对照）和05Z11DD35阴性植株（对照）的病情指数分别为15. 2和11. 5,而纯 合PAL4基因 T-DNA插入突变体的病情指数为23(表1);说明与对照相比，抑制PAL4基因 功能造成抗性减弱（图7的左图）。同时基于DNA扩增的实时定量PCR结果也显示，纯合 PAL4基因 T-DNA插入突变体的感染率要高于对照植株（图7的右图）。该结果说明PAL4 基因是一个在抗稻瘟病育种中有应用前景的基因。
[0043] 表1. PAL4基因 T-DNA插入突变体（05Z11DD35)对稻瘟病菌株RB11的反应
[0044]

【权利要求】
1. 一种增强水稻对从根部侵染的稻瘟病菌产生抗性的PAL4基因，其核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO :1所示。
2. 权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因编码对pH值和温度敏感的苯丙氨 酸解氨酶，该苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
3. 权利要求1或2所述的基因在增强水稻对从根部侵染的稻瘟病菌抗性中的应用。
【文档编号】C12N9/88GK104059930SQ201310086104
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】王石平, 段柳 申请人:华中农业大学