专利名称：针对免疫球蛋白Fc段的单域重链抗体T10的制作方法
技术领域：
本发明涉及单域重链抗体技术(又称为纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是涉及针对免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG ) Fe 段(fragment crystalline,Fe)的单域重链抗体或多肽。
背景技术：
重链抗体(Heavy-chain antibody)是一种天然缺失轻链,仅由重链组成的抗体，存在于骆骑、S鱼等动物中。单域重链抗体(又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domainof heavy chain of heavy-chain antibody)是指仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体。与普通抗体相比，单域重链抗体具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点，目前已广泛应用于基础研究、医学诊断和检测、药物研发等领域。免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条链都含有可变区(variable region, V区)和恒定区(constant region, C区),其中可变区提供抗原结合位点和特异性，恒定区构成免疫球蛋白的框架，具有生物效应功能。用木瓜蛋白酶消化IgG,可将其分成3个功能区，即2个相同的抗原结合片段(fragmentantigen binding, Fab)和一个可结晶片段(fragment crystalline, Fe)。Fe 段位于恒定区，由两条重链羧基端的一半组成。由于Fe段远离抗原结合部位，因此提供了一个与抗体结合而不影响抗原抗体反应的区域，是最有效的二抗试剂结合的表位区。目前，已有针对IgGFe段的多克隆抗体、单克隆抗体的公开报道。与单域重链抗体相比，这些抗体存在生产成本较高，制备过程繁琐等缺点。单域抗体具备分子量小、稳定性高、易于表达等性质，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明之目的是提供针对免疫球蛋白G的Fe段的单域重链抗体(包括含有所述单域重链抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，可被用于制备检测或纯化、富集IgG的试剂和工具。一种针对免疫球蛋白Fe段的单域重链抗体，其特征如(a)或(b)所述:
(a)具有SEQID N0.:1所示的氨基酸序列；或
(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对免疫蛋白Fe段单域重链抗体结合活性的由(a)衍生的与(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。这些改造的序列可以通过常规的易错PCR法对(a)序列进行改造，并通过固相淘选和鉴定获得，优选(b)所述氨基酸序列为SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:4序列。本发明还涉及编码(a)或(b)所述针对免疫球蛋白Fe段的单域重链抗体的核苷酸序列；编码(a)氨基酸序列的核苷酸序列优选为SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。本发明涉及包含前述核苷酸序列的载体。以及包括所述载体的宿主细胞。前述针对免疫球蛋白Fe段单域重链抗体在建立纯化或检测免疫球蛋白方法中的应用。本发明还提供了一种纯化或检测免疫球蛋白G的方法，其特征是含有上述蛋白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与免疫球蛋白G特异性结合的能力，建立免疫球蛋白G的纯化或检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA),突光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA),免疫芯片法和亲和层析法。本发明所提供的 氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。本发明提供一种针对免疫球蛋白G的Fe段的单域重链抗体，具有SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分如图1所示。图1所提供的单域重链抗体包括4个框架区(Framework region, FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架区(FR1-FR4),互补决定区(CDR1-CDR3)。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着维持蛋白质结构的作用。本发明中所叙述的一些术语具有如下含义:
同源性:描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间同源性的百分比可以通过第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量除以第一个氨基酸序列中氨基酸总数再乘以100%来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨基酸相比)被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的计算机运算程序如NCBI Blast获得。结构域:蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。IMGT 编号:IMGT 数据库(The International ImMunoGeneTics Database)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmann，F.，Q.Kaas, et al.(2010)."IMGT/3Dstructure_DB and IMGT/DomainGapAlign: adatabase and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC,IgSF and MhcSF." Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D301-307.Lefranc, M.P., C.Pommie, et al.(2003).〃IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-1ike domains.〃 Dev CompImmunol 27(1): 55-77.)中的描述。密码子(codon):又称为三联体密码(triplet code),指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR):是一种常用的分子生物学实验技术，可用于扩增特定的DNA片段。
图1氨基酸编号及结构域示意图。图2间接phage-ELISA法测定噬菌体结合活性。纵坐标表示ELISA读数计测定450nm处吸光度值,横坐标表不按照表I加样,其中mlgG表不实验组,包被抗原为小鼠IgG,2表示背景对照，3表示空白对照a，4表示空白对照b。图3间接phage-ELISA鉴定结合特异性。纵坐标表示ELISA读数计测定450nm处吸光度值，横坐标从左至右分别为包被小鼠IgGl、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠血清、人IgG的Fe片段，空白对照a、空白对照b和背景对照。图4噬菌粒pHEN-TIO结构图。图5表达质粒pRXS -TIO结构图。图6融合表达质粒pAP-TIO。
具体实施例方式下面通过单域中链抗体的制备、分析以及应用，对本发明作进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。实施例1:
抗IgG Fe段单域重链抗体的淘选与鉴定。采用固相亲和淘选的方法从驼源天然单域重链抗体噬菌体展示文库RJR2中淘选针对IgG Fe段的单域重链抗体。采用亲和层析法纯化小鼠血清，得到mlgG溶液。用PBS稀释mlgG溶液至5(Tl00 y g/mL，每孔加入100 uL,4 °C，包被过夜；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300 u L 3% BSA-PBS, 37 °C，封闭2 h ；PBS洗板6次，加入100 u L噬菌体抗体库(约含2X IO11 CFU)，37 °〇，孵育1.5 h ;吸出未结合的噬菌体，用PBST (含0.5 %Tween-20)洗板5次(逐轮增加I次)，再用PBS洗板10次(洗板次数逐轮增加5次);以100U L洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH 2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用50 u L Tris-HCl (Imol/L,pH 8.0)中和洗脱物，取10 U L用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。经三轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接ELISA测定噬菌体颗粒的结合活性(图2)，实验设定阴性对照及背景对照，具体加样步骤见表I。表I间接phage-ELISA加样表
权利要求
1.一种针对免疫球蛋白Fe段的单域重链抗体，其特征如(a)或(b)所述:(a)、具有SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列；或(b)、将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对免疫蛋白Fe段单域重链抗体结合活性的由(a)衍生的与Ca)具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的针对免疫球蛋白Fe段的单域重链抗体，其特征在于(b)所述氨基酸序列优选为SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:4序列。
3.编码权利要求1或2所述针对免疫球蛋白Fe段的单域重链抗体的核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于为SEQID NO:5所示的核苷酸序列。
5.包含权利要求2或3所述核苷酸序列的载体。
6.—种包含权利要求5所述的载体的宿主细胞。
7.权利要求1或2所述的针对免疫球蛋白Fe段单域重链抗体在建立纯化或检测免疫球蛋白方法中的应用，优选为 ELISA法、荧光免疫法、免疫芯片法或亲和层析法中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，一种针对免疫球蛋白Fc段的单域重链抗体如(a)或(b)所述(a)具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列；或(b)、将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对免疫蛋白Fc段单域重链抗体结合活性的由(a)衍生的与(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。本发明抗体可被用于制备检测或纯化、富集IgG的试剂和工具。
文档编号C12N15/63GK103204937SQ20131015095
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者毋森雍, 陶勇, 许杨, 涂追, 付金衡 申请人:山西德丰信成生物科技有限公司