专利名称：禽流感病毒n9型rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及流感病毒N9型核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于流感病毒N9型引起暴发疫情的实验室应急检测。
背景技术：
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80 120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(Hl H16)和9个N亚型(NI N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。以往研究发现可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。目前，全球首次发现人感染H7N9禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。据报道，自2013年2月以来，我国上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例，其中确诊人感染H7N9禽流感3例，2例死亡。3例均为散发病例，目前尚未发现3例病例间有流行病学关联。此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。流行病学调查显示H9N2禽流感病毒的传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。H7N9禽流感病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染，现尚无人与人之间传播的确切证据。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。根据流行病学调查结果发现，H7N9禽流感病毒感染致死率较高，且暂时并没有相应的保护性疫苗可供使用。因此，疾病防控机构强烈需要快速、有效的H7N9禽流感病毒检测方法来加强对禽流感感染疑似病例及相关禽类中的H7N9禽流感病毒检测，从而提高我们对H7N9禽流感病毒感染的防制能力。目前，实验室病原学检测方法主要是病毒分离:从患者呼吸道标本中分离H7N9禽流感病毒。上述检测方法的不足是检测速度尚不能满足要求(通常需要5天左右)；而且操作比较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点。本发明的另一目的是提供一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，该方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。本发明采用的技术 方案是:
一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2, RT-PCR缓冲液、流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下:上游引物N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3，；下游引物N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3 ’ ；特异性探针N9-P: 5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQl-3’，其中 FAM-为荧光报告基团，BHQl为荧光淬灭基团；所述禽流感病毒N9基因标准品序列如下:GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACG GAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTAT CATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCA AGTACTAGTTGCCATGATGG。所述检测试剂盒中各组分的含量是:
权利要求
1.一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、禽流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下: 上游引物 N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3，； 下游引物 N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3，； 特异性探针 N9-P: 5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQl-3’，其中 FAM-为荧光报告基团，BHQl为荧光淬灭基团； 所述禽流感病毒N9基因标准品序列如下:GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACG GAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTAT CATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCA AGTACTAGTTGCCATGATGG。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于:所述检测试剂盒中各组分的含量是: 脱氧三磷酸核苷>5 Ul
3.一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行: (1)提取待测样品RNA; (2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成反应体系进行RT- PCR反应:上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷、MgCl2,RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、DNA聚合酶； 所述特异性引物和荧光探针序列如下: 上游引物 N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3， 下游引物 N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3， 特异性探针 N9-P:5’ -FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果；若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有禽流感H7型病毒。
4.根据权利要求3所述的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中PCR反应体系中各成分含量如下: RT-PCR缓冲液终浓度为Ix 脱氧三磷酸核苷5 ul MgC I21.25xl0_4mmolI OjimolZL上游引物Iul lOpmol/L下游引物IulIOj^inolZL特异性探针I ul DNA聚合酶4U MMLV逆转录酶200U RNA酶抑制剂20U 模板 RNA2-3\iL 其余是DEPC水，将反应体系补足至25iU。
5.根据权利要求4所述的禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于:所述荧光定量RT-PCR反应条件为:50°C 40min,95°C 2min进行逆转录，然后95°C 10s，55°C 35s，在55°C进行单点荧光检测，共进行40个循环。
全文摘要
本发明涉及禽流感病毒N9型RT-PCR检测试剂盒及检测方法。目的是提供的检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点，提供的方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。技术方案是一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、流感病毒N9基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针；一种禽流感病毒N9型的荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行(1)提取RNA；(2)进行RT-PCR反应；(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测。
文档编号C12Q1/70GK103255233SQ20131017631
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者陈直平, 张严峻, 李辉 申请人:浙江省疾病预防控制中心