专利名称：猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起怀孕母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状的传染病，俗称猪蓝耳病。乙型脑炎病毒(JEV)又称日本脑炎病毒，是一种人畜共患的病毒性传染病，导致母猪繁殖障碍和人的中枢神经系统疾病，该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展，而且严重威胁人类健康[3-5]。随着规模化养猪的不断发展，由PRRSV和JEV引起的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失[6]。目前，PRRSV和JEV主要的检测方法有病毒分离鉴定、微量血清中和试验、ELISA、单一病毒RT-PCR，然而这些诊断方法存在操作繁杂、敏感性低、费时费力等不足。
发明内容
本发明的目的是:提供一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，它能够对临床样品中猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，该诊断试剂盒的敏感性好、特异性高。本发明是这样实现的:猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括IOOPL DL2000、2(^L RT-PCR 一步法酶、250μ 酶缓冲液、30(^LRNase Free (ΙΗ^ΑΟμ 混合引物，各引物的浓度均为10 μ mol/L、20 PL阳性对照及20μ 阴性对照；混合引物包括PRRSV上游引物、PRRSV下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV上游引物的序列为:5 ’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3 ’，PRRSV 下游弓丨物的序列为:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’ JEV上游弓丨物的序列为:5’ -TCCTCGTCATAGGGATTTGCT-3’，JEV下游引物的序列为:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3，。阴性对照为超纯水。阳性对照为标准猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎RNA RT-PCR产物。所述的RT-PCR — 步法酶由 50% 的甘油、3 mmol/μ L 的 MgC12，25mmol/μ L 的Tris-HCl及0.5 μ L反转录酶组成。所述的酶缓冲液由3的 MgCl2, 500pmol/^L 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L的Tris-HCl组成。为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
I材料与方法 1.1病毒和细菌PRRSV北美洲株CH-1a株、JEV弱毒株、PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送。主要试剂
Goldview^ Tris^ EDTA>i^Z2000> PrimeScript I Step Enzyme Mix (RT-PCR 一步法酶)、2X1 Step Buffer (酶缓冲液)、7 舱％ Free dH20等购自宝生物(大连)工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。引物设计
根根据GenBank中的PRRSV 0RF7 N基因、JEV NSl基因序列，设计了 2对引物，用于扩增目的基因片段，引物的序列如下，PRRSV上游引物:5’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3’，PRRSV 下游引物:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’，预计目的基因片段大小为 245bp JEV 上游引物:5’ - TCCTCGTCATAGGGATTTGCT - 3’，JEV 下游引物:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3’，预计目的基因片段大小为504bp。病毒核酸的抽提
取待检样品肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg，加入800μ PBS缓冲液，待检样品研磨后-70°C反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于-70°C保存。单一病毒RT-PCR扩增 单一病毒的RT-PCR反应在25 PL体系中进行，上下游引物各WL (lOymol/L)、PrimeScript I Step Enzyme Mix 1M-L>2 X I Step Buffer I2.δμ 、模板 lKL,加FreedH20至 25 μ ，反应程序:5(TC 30 min ；94°C 5 min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C I min，30 个循环；最后72°C延伸10 min。取5PLRT_PCR扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。双重一步法RT-PCR反应条件的优化
双重一步法RT-PCR反应条件，包括退火温度(501:、551:、60°0，引物浓度(5Mmol/L、10 Mmol/L、20 Mmol/L),PrimeScript I Step Enzyme Mix (1ML、2KL)进行优化，以确定最佳反应条件，同时以记Vase Free dH20作为空白对照。双重一步法RT-PCR反应在50 μ 反应体系中进行。反应条件为:50°C 30 min ；94°C 5 min ；94°C 30s，退火温度(50°C、55°C、60°C)30s，72°C I min，30 个循环；最后 72°C 延伸 10 min。取 5μ PCR 扩增产物于 15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。敏感性试验
将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，2Pg的PRRSV和4Pg JEV RNA将2种病毒RNA混合，经10倍系列稀释的病毒核酸用于双重一步法RT-PCR ；2μδ的PRRSV、4Pg JEVRNA分别经10倍系列稀释的单一病毒核酸用于单一病毒的RT-PCR反应，以确定双重一步法RT-PCR的敏感性。特异性试验
以PRRSV、JEV、CFSV、PRV、PCV-2、PPV为模板分别进行双重一步法RT-PCR反应，以确定双重一步法RT-PCR的特异性。
重复性试验
应用建立双重一步法RT-PCR方法，重复检测PRRSV、JEV单一病毒RNA或混合RNA样品3次以检验结果的可靠性。双重一步法RT-PCR试剂盒组成
应用建立的双重一步法RT-PCR方法组装成试剂盒，包括:(I)规2000 ； (2) RT-PCR-步法酶(PrimeScript I Step Enzyme Mix) ; (3)缓冲液(2X I Step Buffer ) ； (4)RNaseFree dH20 ；(5)混合引物；(6)阳性对照；(7)阴性对照。双重一步法RT-PCR试剂盒对临床样品的检测
应用研制的双重一步法RT-PCR试剂盒对2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、铜仁地区几个规模化养猪场和养猪专业户采集的52份病料进行检测，同时结果与单一 PCR检测结果进行对比。
结果与分析
2.1双重一步法RT-PCR产物的鉴定
PRRSV, JEV的RT-PCR扩增片段经胶回收，送宝生物(大连)工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为各病毒的特异性条带。双重一步法RT-PCR反应
双重一步法RT-PCR反应在50 μ 反应体系中最佳反应条件为，退火温度55 °C，PrimeScript I Step Enzyme Mix 2M-L, 2X1 St印 Buffer 25.0 ML,引物浓度 10 Mmol/L均有效扩增出了其目的片段，分别为PRRSV 245bp，JEV 504bp，引物间无非特异性片段产生，见图1。敏感性试验
将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，2Pg的PRRSV和4Pg JEV RNA将2种病毒DNA混合，经10倍系列稀释的病毒核酸用于双重一步法RT-PCR ；2μδ的PRRSV和4PgJEV RNA分别经10倍系列稀释的单一病毒核酸用于单一病毒的RT-PCR反应,最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2ng/L、JEV 0.4 ng/L，见图2。在单一病毒的RT-PCR反应中，各病毒的最低检测量分别为，PRRSV 0.02ng/L、JEV 0.04 ng/L，见图3、图4。特异性试验
以CFSV、PRV、PCV-2、PPV为模板分别进行双重一步法RT-PCR反应，分别进行双重一步法RT-PCR反应均未扩增出条带，而PRRSV、JEV混合和单一 RNA均扩增出各病毒的特异性条带，见图5。重复性试验
应用建立的多重PCR方法，重复检测PRRSV、JEV单一病毒RNA或混合RNA样品3次，结
果均一致。双重一步法RT-PCR试剂盒对临床样品的检测
应用研制的PRRSV和JEV双重一步法RT-PCR试剂盒对52份病料进行检测，结果52份病料中有18份PRRSV阳性，阳性率最高，为34.61% (18/52) ；12份JEV阳性，阳性率为23.07% (12/52)。其中PRRSV和JEV均阳性7份，阳性率为13.46% (7/52)。其结果与单一病毒RT-PCR检测结果的符合率为100%。讨论PRRSV和JEV严重危害养猪业的发展，且均能导致猪繁殖障碍。许多学者从流产的死胎、公猪睾丸及蚊虫体内分离到PRRSV和JEV。陈钟鸣等通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒等的基因序列分析，设计多联PCR诊断方法诊断发病猪场上述病毒的混合感染，发现单病毒感染率在68.7% 81.5%之间，混合感染率在58.9% 90%之间。PRRSV据病毒基因组的差异可分为两个基因型，即欧洲型和北美洲型，我国自1996年首次分离到北美洲型PRRSV CH-1a株以来，在我国流行的PRRSV的基因型均为北美洲型。郝晓芳等PRRSV在NSP2缺失区的两端的保守区设计合成了一对引物，建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法，该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230 bp的片段，扩增经典型PRRSV时则获得320 bp的片段。但随着频繁的种猪国际贸易流动，欧洲型毒株的危害对我国养猪业存在着潜在的风险。娄高明等根据PRRSV核衣壳蛋白0RF7的序列，设计了 I对引物，建立检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。该法不仅能够扩增出特异性的核酸片段，同时可区分PRRSV北美洲型和欧洲型。本发明根据GenBank中PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株0RF7 N蛋白基因保守序列，建立了特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株的方法。宋建领等根据GenBank中PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列，设计I对特异性引物和I条探针，优化了 PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法，特异性、敏感性和重复性检测结果显示，该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株，与其它主要猪病病原检测无交叉反应，灵敏度可以达到10拷贝。然而目前在我国县级动物预控中心还没配备荧光定量PCR仪，只配备了普通PCR仪器，表明本研究研制的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒可以满足大规模流行病学调查需要，能够在我国大部分省地县级动物预控中心进行推广应用。由于采用了上述技术方案，本发明根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)0RF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NSl基因序列，设计了 2对引物，通过反应条件的优化，成功研制了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，扩增产物分别为245bp、504bp。敏感性、特异性结果显示，该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2ng/L、JEV 0.4 ng/L，而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明，该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一 PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性，可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。本发明采用的双重一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖有助于减少污染，试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2ng/L、JEV 0.4 ng/L，虽然敏感性比建立的单一病毒RT-PCR低，但这个敏感度高于传统的检测方法，可满足临床检测的需要。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。
附图1 为 PRRSV、JEV 双重一步法 RT-PCR ；
M: DL2000 ；1:PRRSV、JEV双重RT-PCR产物；2:PRRSV单一 RT-PCR产物；3 JEV单一 RT-PCR产物；4:空白对照；附图2为PRRSV、JEV双重一步法RT-PCR敏感试验；
M: DL2000 ;1 6:混合 RNA (2μδ 的 PRRSV 和 4Pg JEV) X 10 — 1 10 —6 稀释的病毒RT-PCR 结果；
附图3为PRRSV单一病毒RT-PCR敏感试验；
M: DL2000 ;1 7:2Pg PRRSV RNAX KT1 1(Γ7 稀释的病毒 RT-PCR 结果；
附图4为JEV单一病毒RT-PCR敏感试验；
Μ: DL2000 ;1 7:4μδ JEV RNAX KT1 1(Γ7 稀释的病毒 RT-PCR 结果；
附图5为PRRSV、JEV双重RT-PCR特异性试验；
Μ: DL2000 ；1:PRRSV、JEV 双重一步法 RT-PCR 产物；2:PRRSV 双重一步法 RT-PCR 产物；3 JEV双重一步法RT-PCR产物；4: CFSV双重一步法RT-PCR产物；5: PRV双重一步法RT-PCR产物；6:PCV-2双重一步法RT-PCR产物；7:PPV双重一步法RT-PCR产物。
具体实施例方式本发明的实施例:猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括DL2000、RT-PCR 一步法酶、缓冲液、RNase Free dH20、混合引物、阳性对照及阴性对照；混合引物包括PRRSV上游引物、PRRSV下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV上游引物的序列为:5’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3’，PRRSV 下游弓丨物的序列为:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’ JEV上游弓丨物的序列为:5’ -TCCTCGTCATAGGGATTTGCT-3’，JEV下游引物的序列为:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3’ ；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎RNA RT-PCR产物；所述的RT-PCR —步法酶由50%的甘油、3 mmol/μ L的MgC12, 25mmol/μ L的Tris-HCl及0.5 μ L反转录酶组成；所述的酶缓冲液由3的
MgCl2, 500pmol/^L 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 组成。
权利要求
1.一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:包括IOOKL DL2000、2(^L RT-PCR 一步法酶、250μ 酶缓冲液、30(^LRNase Free (1Η20、80μ 混合引物，各引物的浓度均为10 μ mol/L、20 PL阳性对照及20μ 阴性对照；混合引物包括PRRSV上游引物、PRRSV下游引物、JEV上游引物及JEV下游引物；PRRSV上游引物的序列为:5 ’ - CGCCCAACAAAACCAGTCCAGA - 3 ’，PRRSV 下游弓丨物的序列为:5’ - CAGTATATTGCTCGGCAAACT - 3’ JEV上游弓丨物的序列为:5’ -TCCTCGTCATAGGGATTTGCT-3’，JEV下游引物的序列为:5’-AGGCCCAAGGCGTGAGGGCGG - 3，。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:阳性对照为标准猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎RNA RT-PCR产物。
4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:所述的RT-PCR—步法酶由50%的甘油、3 mmol/yL的MgC12，25mmol/μ L的Tris-HCl及0.5 μ L反转录酶组成。
5.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于:所述的酶缓冲液由3的MgCl2, 500pmol/^L的dNTP 2.0 μ L,25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 组成。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，包括100μL DL2000、20μL RT-PCR一步法酶、250μL酶缓冲液、300μL RNase Free dH2O、80μL混合引物(浓度各为10μmol/L)、20μL阳性对照及20μL阴性对照。本发明根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列，设计了2对引物，通过反应条件的优化，成功研制了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒，它对这两种病毒具有敏感性、特异性。可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。
文档编号C12R1/93GK103215389SQ20131018172
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者余波, 冉懋韬, 谭诗文, 史开志 申请人:贵州省畜牧兽医研究所