一种香根草水孔蛋白基因VzPIP2-1 及其植物表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种香根草水孔蛋白基因VzPIP2-1及其植物表达载体及其应用。香根草质膜水孔蛋白VzPIP2-1基因，其CDS序列如SEQ?ID?NO.1所示。其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明基因为该种植物中首次报道，参与香根草植株体内的水分吸收和运转。转VzPIP2-1基因大豆植株吸水能力或含水量和蒸腾速率（Tr）比其原种显著提高。因此，本发明VzPIP2-1基因可用于构建或创制高吸水和运转能力的转基因植物，改善植物水分关系，促进植物的生长发育和水分利用。
【专利说明】一种香根草水孔蛋白基因VzPIP2-1及其植物表达载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种香根草水孔蛋白基因VZPIP2-1及其植物表达载体和应用。
【背景技术】
[0002]香根草(Vetiveria zizanioides L.)是禾本科香根草属多年生C4类草本植物,原产于印度等热带地区，一般只开花，不结果实和种子，以分蘖方式繁殖，不会自然扩散为杂草，株高1.5?2.0m，根系发达，深2.0?3.0m。它具有综合抗性强、生物产量高、栽培技术简单、用途广泛等优点，植株地上部主要成分纤维素、半纤维素水解后的葡萄糖、木糖含量与已报道的能源植物柳枝稷接近，近年来被广泛应用于农业水土保持、工程边坡固定、矿山生态恢复和土地复垦、净化水体、污染物清除等环保领域。香根草还具有提取香根油，作为饲用、编织、食药用菌栽培和造纸原料等经济用途(徐礼煜等，2003 ;徐礼煜和夏汉平，2008;毛萍等，2011)。
[0003]植物的水孔蛋白(Aquaporins, AQPs)是一类位于细胞质膜和内膜上的通道蛋白，主要介导水和部分中性小分子溶质(如尿素、甘油、硼酸和硅酸)及气体(如氨、CO2)的跨膜转运，不难看出它与植物体内的水分代谢关系至关密切(Maurel等，2008)。AQPs是一个大家族，一般由250-300个氨基酸残基组成，其分子量在26-34KDa之间，从微生物到高等动物和植物的水孔蛋白的一级结构是高度保守的(Zhao等，2008)。根据其多肽序列的长度和分布情况，植物水孔蛋白可以分为四类:质膜内在蛋白(PIPs)、液泡膜内在蛋白(TIPs)、与大豆N0D26同源的内在蛋白(NIPs)和小碱性内在蛋白(SIPs)，其中PIPs主要分布在质膜上，也是数量最大的一类。PIPs又被分为PIPl和PIP2两个亚类(Kaldenhoff和Fischer，2006 ；Zhao 等，2008)。
[0004]众所周知，蒸腾作用(蒸腾拉力)是植物进行水分吸收和运输的主要动力，特别是在照光条件下，植物的吸水(或运转)速率与蒸腾速率一般呈正相关的关系。植物进行蒸腾作用会导致体内水分散失，蒸腾速率越大，水分散失越多，甚至会破坏植物体内的水分平衡，引起水分亏缺和植株伤害。因此，植物的蒸腾速率须与其吸水速率(或含水量)相呼应，才能发挥蒸腾作用在植物生长和发育过程中许多积极的生理作用(比如促进植物矿质营养吸收、降低叶片温度和有利于CO2同化等)。目前对香根草的科学研究，主要集中在重金属土壤植物修复(Chen et al.，2004)、水土保持和工程边坡固定(Are et al.,2011)等生态环保应用方面，有关香根草的基因组学、基因克隆及功能等研究尚未见报道。所以，克隆香根草PIPs基因，通过构建植物表达载体和转植物基因操作，分析其在植物体内水分吸收和运转过程中的调控作用及其与植株蒸腾速率间的关系，对于深入揭示香根草PIPs基因在植物水分关系中的分子和生理功能，都具有重要的理论和实践意义。经检索目前未见这方面的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种香根草水孔蛋白基因VzPIP2-"I O[0006]本发明的另一目的是提供含有该基因的植物表达载体。[0007]本发明的又一目的是提供该基因的应用。[0008]本发明的目的可通过如下技术方案实现:[0009]香根草质膜水孔蛋白VzPIP2-l基因，其CDS序列如SEQ ID N0.1所示。[0010]所述的VzPIP2-l基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0011]含有所述的VzPIP2-l基因的植物表达载体。[0012]所述的植物表达载体，优选将所述的VzPIP2-l基因插入到pCambial300-GFP载体KpnI, SpeI酶切位点间所得。[0013]所述的VzPIP2 -1基因在构建高吸水能力和/或水运转能力的转基因植物中的应用。[0014]所述的含VzPIP2 -1基因的植物表达载体在构建或创制高吸水能力和/或水运转能力的转基因植物中的应用。[0015]有益效果:[0016]本发明首次提供了一个新的香根草水孔蛋白基因VzPIP2-l，将其
插入pCambial300-GFP载体Kpn1、SpeI酶切位点间构建得到植物表达载体pCambil300-VzPIP2-lo 利用 pCambil300-VzPIP2_l 转染农杆菌进而得到转 VzPIP2_l 基因大豆。所得到的转VzPIP2-l基因大豆蒸腾速率(Tr)比其原种显著提高。因此，本发明VzPIP2-l基因可用于构建高吸水能力的转基因植物，适用于干旱地区的植物种植或造林，使植物能够充分利用有限的水源。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1带目的片段的pCambial300-VzPIP2_l载体电泳图谱
[0018]泳道I 为 Trans 15K DNA Marker,泳道 2 为 pCambial300_GFP (10847bp),泳道 3为 pCambial300-VzPIP2-l (11720bp)。
[0019]图2VzPIP2_l目的片段的PCR验证电泳图
[0020]泳道I为Trans2K DNA Marker,泳道2为VzPIP2_l目的片段对照，泳道3为pCambial300-VzPIP2-l 中目的基因 PCR 验证。
[0021]图3pCambial300_GFP 载体图谱
[0022]图4pCambial300-VzPIP2_l 载体图谱片段
[0023]图5栽培大豆(Lee68)的不定芽原位诱导丛生芽实验
[0024]由左至右依次为:诱导期；幼芽形成；丛生芽形成；建立顶端优势；结荚期
[0025]图6转VzPIP2-l基因(Lee68)材料T1代PCR检测
[0026]图7大豆Lee68原种和转VzPIP2_l幼苗在光照下两对生叶片平面张角比较
[0027]A:两对生叶片平面张角示意图，B:光照时间与两对生叶片平面张角的关系。
[0028]图8大豆Lee68原种和转VzPIP2_l植株在正常培养条件下相关光合参数的比较。【具体实施方式】
[0029]实施例1香根草VzPIP2_l基因的克隆
[0030]1、从香根草中提取总RNA:①取少量香根草叶片于液氮中研磨，组织样品按50-100mg/ml Trizol加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。②按200 μ I氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混勻15min,室温放置15min。③4°C 12000g离心15min。④吸取上层水相，至另一离心管中。⑤按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-lOmin。⑥ 4°C 12000g 离心 IOmin,弃上清,RNA 沉于管底。⑦按 lml75% 乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。⑧4°C 8000g离心5min，尽量弃上清。⑨室温晾干或真空干燥 5-10min，然后用 50ul H2O, TE buffer 溶解 RNA 样品，55_60°C 5-10min。⑩RNA样品于-80°C保存。
[0031]2、将总RNA反转录合成cDNA第一条链:①在1.5ml Eppendorf管中加入2μ g总RNA0加入DEPC H2O使总体积为8 μ I。②加入I μ I Oligo (dT) 18primer,小心混匀。③65°C保温5min。④冰上放置lOmin。室温高速离心5s，将所有溶液收集到管底。⑤按次序分别加入下列试剂:2XFir·st-Strand BufferlO μ lRT-mixl μ I 终体积:20 μ I。⑥ PCR仪上42°C 50min ;⑦然后90°C处理5min。冰上冷却，室温高速离心5s，将所有溶液收集到管底，-20°C保存。·
[0032]3、通过NCBI网站上nucleotide blast工具对拟南芥、水稻、玉米、大麦等植物中已报道的PIPs基因序列进行比较分析，针对保守区域设计兼并引物正向引物Pl:5’ -GCSACGCTSMTSTTCSTST-3，，其中 S 代表 G 或 C，M 代表 C 或 T，(SEQ ID N0.3)
[0033]反向引物P2:5’-ANHCGSCCMACCCAGAAGAT-3’，其中 N 代表 A 或 G 或 C 或 T，H 代表A或T或C，M代表C或T，S代表G或C，(SEQ ID N0.4)
[0034]以上一步反转录合成的cDNA第一条链体外扩增出香根草质膜水孔蛋白VzPIP2_l基因的保守序列，大小为586bp。
[0035]4、利用3’和5’ RACE技术克隆出香根草水孔蛋白VzPIP2_l基因的开放阅读框序列，其开放阅读框序列如SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示。
[0036]5’ RACE实验步骤如下:
【权利要求】
1.香根草质膜水孔蛋白VZPIP2-1基因，其CDS序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的VzPIP2-1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有权利要求1所述的VzPIP2-1基因的植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于是将权利要求1所述的VzPIP2-1基因插入到pCambial300-GFP载体Kpn1、SpeI酶切位点间所得。
5.权利要求1所述的VzPIP2-1基因在构建高吸水能力和/或运转能力的转基因植物中的应用。
6.权利要求3所述的含VzPIP2-1基因的植物表达载体在构建或创制高吸水能力和/或运转能力的转基因 植物中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK103436539SQ201310395257
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】於丙军, 胡淑宝, 周强 申请人:南京农业大学