专利名称：羊草水孔蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水孔蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及来源于羊草的水孔蛋 白LcPIPl及其编码基因与应用。
背景技术：
植物在生长过程中经常会遭受到水分胁迫的伤害。为了维持水分胁迫下的水分稳 态，植物形成了一套适应水分胁迫的水分运输调节机制。 研究表明，植物中细胞_细胞途径是适应水分胁迫的重要途径，在这种途经中，经 过水孔蛋白的水分运输途径是最重要的途径。植物水孔蛋白(Aqu即orin， AQP)是质膜和 液泡膜上专一、高效的水分跨膜双向运输通道，属于MIP(Majorintrinsic protein)家族成 员，根据亚细胞分布及同源性分为4个亚类，即位于质膜上的内在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)、位于液泡膜上的内在蛋白(Tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、位于大豆(Glycine max)根瘤菌周膜上的类N0D26膜内在蛋白(N0D26_like intrinsic proteins, NIPs)禾口小的基本膜内在蛋白(Small basic intrinsic proteins, SIPs)。迄今，许多研究表明改变水孔蛋白基因的表达可改变细胞膜透水能力。干旱条件下 植物体内会发生许多变化，一些水孔蛋白或其同源物的表达就是植物适应干旱的一种积极 反应。豌豆中7a基因是第一个被鉴定的水分胁迫诱导的水孔蛋白，拟南芥中的At-RD28及 番茄中的TRAMP也是在干旱诱导下表达量增加的水孔蛋白基因。 水孔蛋白的表达往往受干旱、低温等诱导，也受脱落酸和生长素等激素的调节。同
时，水孔蛋白的表达也会影响植物的生长，蒸腾流中水的张力通过调节胞质中的Ca2+浓度
而调节水孔蛋白的活性。Netting认为，质外体水势高时，水分从导管流向叶肉细胞，轻度
水分胁迫下，叶肉细胞失水、气孔关闭，若胁迫进一步加重，细胞则处于静息状态；重新供水
时，细胞又恢复正常生理状态。水孔蛋白在细胞水分平衡中可阻止干旱条件下的水分丢失，
这就为植物采取诸如合成渗透调节物质等途径防止干旱胁迫赢得了时间。 羊草(Leymus chinensis)为禾本科赖草属中的多年生草本植物，中国的分布中心
在东北平原、内蒙古高原的东部和华北的山区、平原、黄土高原，西北省区也有广泛分布。羊
草为旱生植物，适应性强，能耐旱、耐寒、耐盐碱，能在排水不良的轻度盐化草甸土或苏打土
上良好的生长，也能在排水条件较差的黑土和碳酸盐黑钙土上正常生长。 目前对于羊草的研究仅限于人畜的食用及成份分析等方面，而将其作为耐旱植物
对其分子生物学方面的研究还少见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的羊草水孔蛋白及其编码基因与应用。
上述的目的通过以下的技术方案实现 羊草水孔蛋白LcPIPl，羊草水孔蛋白基因LcPIPl的编码蛋白，是具有以下氨基酸 序列的蛋白质
3
(1)序列表中的SEQ ID No :1 ; (2)序列表中SEQ ID No :1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加，且与SEQ ID No :1蛋白质序列具有相同活性的、由SEQ IDNo :1衍生的蛋白质。
所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，所述的羊草水孔蛋白基因LcPIPl是下列核苷酸序 列之一 (1)序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列； (2)编码序列表中SEQ ID No :1蛋白质序列的DNA ; (3)与序列表中SEQ ID No :2的DNA序列具有95%以上的同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列； (4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No :2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。 所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，所述的序列表中的SEQ ID No :1由288个氨基酸残 基组成，所述的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加是指不多于十个氨基酸残基的 取代、缺失或添加。 所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，所述的序列表中的SEQ ID No :2由1116个脱氧核 苷酸组成，开放读码框为自5'端第9位至第875位脱氧核苷酸。 所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，所述的高严谨条件可为在0. 1 X SSPE (或 0. IXSSC)，O. 1% SDS的溶液中，在65t:下杂交并洗膜。 含有权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl基因的表达载体或细胞系。
含有权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl基因的宿主菌。
羊草水孔蛋白LcPIPl基因在培育抗旱植物中的应用。
这个技术方案有以下有益效果 1.本发明获得了一个新的羊草水孔蛋白及其编码基因。转基因烟草实验证明该 基因的过量表达提高了烟草水孔蛋白基因的转录水平，因此将此基因作为目的基因导入植 物，利用基因工程技术提高植物中水孔蛋白的数量和活性，通过水孔蛋白调节气孔的关闭， 以减少植物的蒸腾，可增强转基因植物的抗旱能力。 2.本发明的水孔蛋白及其编码基因来自于羊草，具有适合于羊草等禾本科植物表 达的优化密码子，其基因工程受体植物除了烟草等双子叶植物外，更加适合于水稻、小麦、 玉米等单子叶植物。 3.本试验利用RT-PCR和3'RACE技术从羊草中获得了一个新的水孔蛋白基因，构 建了该基因的植物表达载体，并在转基因试验系统中研究了该基因的功能，对于从分子水 平上揭示羊草的抗旱机理，改良植物抗旱品质有很重要的作用。 4.本发明提供的LcPIPl蛋白及其编码基因是首次在羊草中获得的，可作为目的
基因导入植物，表达的水孔蛋白通过调节气孔的关闭，以减少植物的蒸腾，进而维持水分亏
缺时的水分平衡，可增强转基因植物的抗旱能力，从而进行植物品种改良。 5.本发明羊草水孔蛋白LcPIPl基因在培育抗旱植物中的应用，将抗旱基因
LcPIPl通过农杆菌介导、花粉管通道、基因枪或微注射的方法转入植物中，培育出抗旱性增
强的植物新品种。 携带有本发明的LcPIPl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、微注射、花粉管通道等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培 育成抗旱性增强的转基因植株。被转化的宿主可以是双子叶植物也可以是单子叶植物，如 拟南芥、烟草、番茄、油菜、大豆、水稻、小麦、玉米、杨树、草坪草、牧草、花卉等。
6.本发明所提供的LcPIPl基因可以构建在任何植物表达的Ti (或Ri)质粒双元 载体中。植物表达载体中的启动子可以是任何一种组成型启动子、组织特异性启动子或诱 导型启动子，如35S启动子、Ubiqutin启动子等。载体中的增强子可以是转录增强子，也可 以是翻译增强子。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，载体中还应有植物 可选择性标记(如GUS基因、GFP基因等)或具有抗生素等抗性的标记物(如卡那霉素、除 草剂等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境(如干旱) 筛选转化植株。
附图1是羊草LcPIPl基因与其他植物PIP1基因核苷酸序列比对；
附图2是利用Sosui分析的跨膜结构； 附图3是LcPIPl氨基酸序列与其它水孔蛋白的系统发育分析； 附图4是表达载体pBPIPl ; 附图5是转基因烟草植株的PCR检测； 附图6是转基因烟草植株的Southern杂交检测； 附图7是转基因烟草植株的RT-PCR检测(WT为野生型，1_7为转基因植株)；
附图8是转基因烟草离体叶片失水分析； 附图9是转基因烟草植株的抗旱性(转LcPIPl基因的烟草)；
附图10是转基因烟草植株的抗旱性(野生型烟草)；
附图11是转基因烟草和野生型烟草蒸腾速率的差异。
本发明的
具体实施例方式 实施例1 : 羊草水孔蛋白LcPIPl基因的克隆
1.总RNA的提取 待羊草幼苗长至3叶期时，用20% PEG6000进行根际胁迫，3h后剪取其叶片，液氮 研磨成粉末，利用RNAiso Reagent (TaKaRa)提取总RNA。
2.羊草水孔蛋白LcPIPl基因全长cDNA的克隆
(l)cDNA第一链的合成 以 Invitrogen公 司 的SuperScriptTM First-Strand Synthesis System forRT-PCR kit反转录获得cDNA第一链。反应体系如下，cDNA Synthesis Mix:5XcDNA Synthesis Buffer 4iU，0. 1M DTT 1 ii 1 ， DEPC-treated Water 1 ii 1 ， RNaseOUT(■/ ii 1) 1 ii 1， ThermoScript RT(15U/ii 1) 1 ii 1， total volume 8ii 1。 在冰上混合RNA 5ii 1 (< 5 ii g)， Primer Oligo (dT) 20 (50 ii M) 1 ii 1， d證s (10mM) 2 ii l，DEPC-treated Water 4iil，total volume 12iU。将RNA+Primer+dNTPs混合物置于65。C水浴5min，立即置于碎 冰中，然后加入8ii1 cDNA Synthesis Mix, 60。C水浴60min，再转入85。C水浴5min，最后加 入1 iil E. coli RNase H， 37"C水浴20min。得到cDNA第一链，作为简并PCR的模板。
(2)简并PCR获得羊草水孔蛋白LcPIPl基因的5'端片段 根据GenBank上公布的大麦、小麦、玉米等禾本科植物的水孔蛋白基因的核 苷酸和氨基酸序列，进行多重比对(DNAMAN4. 0)，寻找高度保守区域，利用软件Pr imer Premier 5. 0设计一对简并引物，序列如下Pril :5' -CAATGGARGRNAARGARGARGA-3， Pri2 : 5' -GCCRAYGAANGGDCCVACC-3'。 以羊草的cDNA第 一 链为模板进行PCR扩增。反应体系(25 iU)为 10XExTaq(Mg2 + ) Buffer 2.5iil，dNTP Mi x (2. 5mM) 2 ii 1 ， Pr i 1 (10 ii M) 1 ii 1 ， Pri2(10iiM)lii 1， cDNA(稀释lO倍)lii 1， ExTaq polymarase (5U/ii l)0.2ii 1。 PCR反应 程序为94。C 5min，94。C 40s，57。C 40s，72。C 70s， 30cycles，再72°C 7min。得到一个大小约 S03bp的cDNA片段，将其与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选。挑取阳性 克隆，经酶切鉴定和PCR鉴定后进行测序，将测序结果在NCBI上进行Blast比对，发现与其 它物种的水孔蛋白基因有较高的同源性。证明已得到包含起始密码子(ATG)在内的羊草水 孔蛋白基因的5'端片段。 (3)利用3' RACE技术扩增羊草水孔蛋白LcPIPl基因的3'端片段 利用Invitrogen公司的3， RACE Kit扩增水孔蛋白LcPIPl基因的3'端片段，采
用巢式PCR法。根据测序得到的803bp的cDNA片段序列，在靠近3'端设计3'RACE特异引
物p3-l和巢式特异引物p3-2，序列如下p3-l :5' -TCCTTCGGCGGCATGATCTTCG-3';p3-2 :5' -GCCAATCGGGTTCGCCGTGTTC-3，。 分别与3， RACE Kit中的AAP Primer : 5， -ggCCACgCgTCgACTAgTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，和AUAP Primer :
5， -ggCCACgCgTCgACTAgTAC-3，相配对。 反应分为两部分，反转录合成cDNA第一链和3'端cDNA扩增。反转录的体系为 MgC12 (25mM) 4 ii 1 ， 10 X RT buffer 2 ii 1 ， dNTP Mix (2. 5mM) 2 ii 1 ， RNaselnhibitor 0. 5 ii 1 ， AAP(10mM) 1 iil，总RNA 1 y g， DEPC处理水up to 20 yl。反转录程序为42。C保温2min， 加入AMV反转录酶(15U) ，42。C保温50min，95。C加热5min，4。C保温5min，获得cDNA第一 链。3，端cDNA扩增的体系:10 XExTaq(Mg2+) Buffer 2. 5ii 1， dNTP Mix (2. 5mM) 2 ii 1， Primer (10 iiM)各1 ii l，cDNA模板(稀释10倍)1 ii l，ExTaq polymarase (5U/ii 1)0. 2ii 1。 扩增程序94。C 5min，94。C 40s，60-64。C 40s，72。C 70s， 30cycles，再72°C 7min。得到一个 大小约487bp的cDNA片段，经同源性比较及序列分析，证明为正确3'端片段。
(4)全长cDNA的获得 将所得到的5'端cDNA片段序列和3'端cDNA片段序列拼接起来，去掉重叠部分， 得到1116bp的编码羊草水孔蛋白LcPIPl基因的全长序列，根据此序列设计特异引物Abam 和Akpn，序列如下Abam :5' -GCGGATCCATGGAAGVTAAAGAGGAGG-3'(含BamHI酶切位点)
Akpn :5， -CCGGTACCGTTTGAATAAACTTGACTGG-3，(含Kpnl酶切位点)
用常规PCR方法扩增得到羊草水孔蛋白基因的全长cDNA序列。
实施例2 :
LcPIPl基因序列分析
6
羊草水孔蛋白基因全长cDNA为1116bp，包括5'端第9位至第875位长度867bp的 开放读码框(Open Reading Frame, ORF) 、8个碱基的5，非翻译区(NonTranslated Region, NTR)和241个碱基的3'非翻译区，如序列表SEQ ID No :2。此cDNA编码一个由288个氨 基酸组成的多肽，如序列表中的SEQ ID No :l，推测分子量为30.8KD。 利用DNAMAN4. 0对不同水孔蛋白进行氨基酸序列比对分析，LcPIPl的氨基酸序 列与已克隆的其它水孔蛋白具有很高的同源性(如图l所示)，图中各物种的水孔蛋白在 GenBank上的登陆号分别为大麦(BAF41978)、小麦(ABI96812)、水稻(NP_001047672)、玉 米(AA086706)、甘蔗(ACC59097)、烟草(BAA20076)、拟南芥(BAA22097)。图1中加黑部分 是一致性的氨基酸。Protparam预测表明该水孔蛋白氨基酸分子量为30. 8KD，理论等电点 8. 81，不稳定系数约为29. 31，这是一个稳定蛋白。ProtScale预测水孔蛋白的疏水性氨基 酸多于亲水性氨基酸，因此可认为该蛋白是疏水性蛋白，符合膜蛋白的特征。Sosui预测该 水孔蛋白是有6个跨膜结构的膜蛋白(如图2所示)。ScanProsite预测该蛋白的编码基 因具有MIP基因家族序列的信号序列HNPAVTFG，并且含有植物质膜水孔蛋白的特征序列 GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。利用DNAMAN对该基因的氨基酸序列进行 系统发育分析(如图3所示)，羊草LcPIPl基因与同为禾本科植物的大麦PIP1基因的亲缘 关系最近，与拟南芥等双子叶植物的PIP1基因的亲缘关系较远。
实施例3 : LcPIPl基因植物表达载体构建 将pBIN437质粒用BamHI和Kpnl双酶切，回收载体；同时将LcPIPl基因连接到
pMD18-T载体上，命名为pT-LcPIPl，以BamHI和Kpnl双酶切pT-LcPIPl，回收约0. 9kb的小
片段，以T4DNAligase将载体与0. 9kb的目的片段连接，转化DH5 a并进行PCR和酶切鉴定
后得到表达载体pBPIPl (如图4所示)。此表达载体的启动子为35S，终止子为Tnos，筛选
标记基因为NPT II 。 实施例4 : 农杆菌介导法转化烟草 利用冻融法将质粒载体pBPIPl导入农杆菌EHA105中，采用叶盘法转化烟草，方法 如下 (1)烟草无菌苗的获得取烟草种子在95X的乙醇中浸泡lmin，用无菌水冲洗2-4 次，然后用10%的次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5-6次，将种子接种到MS培养基上或铺 有3-4层潮湿的滤纸上，待植株长到4-5片真叶时即可用于感染。 (2)叶盘法转化烟草取烟草叶片，无菌条件下用打孔器将其打成5mm直径的叶 片圆盘，放入MSl(MS+2mg/L 6-BA+0. 2mg/L NAA)培养基中预培养48小时。农杆菌菌株在 液体YEP培养基(含50mg/L Rif和50mg/L Kan)中培养至对数生长期生后，将烟草叶圆 片浸入其中2-3min。用灭菌的滤纸吸净多余的菌液，置于MS1培养基上，于黑暗处共培养 30-36h。然后叶片转置于诱导出芽的MS2选择培养基(MSl+100mg/L Kan+500mg/L Cef)上， 室温25°C ， 16h， 3000Lux光照条件下培养。待不定芽长到1厘米左右时，将芽转移至MS3培 养基(1/2MS+0. 2mg/L NAA+100mg/L Kan+250mg/L Cef)上诱导生根，等根长到一定程度时 移至蛭石中， 一个星期后将植株移入土壤中。
实施例5 :
7
转基因烟草植株的PCR、 Southern杂交及RT-PCR检测 对经卡那霉素抗性筛选的转基因烟草进行LcPIPl基因的PCR检测，基因组DNA的 提取方法如下 (1)取新鲜的烟草叶片约lOOmg，放入1. 5ml离心管中，液氮或石英砂研磨；
(2)加入提取缓冲液600 ill ，混匀，室温反应30min ;
(3) 4°C ， 13000rpm离心5min，取上清； (4)加入等体积的酚氯仿(酚氯仿=1 : 1)，轻轻颠倒3-5min ;
(5) 4°C ， 13000rpm离心5min，小心吸取上清；
(6)加入等体积的氯仿，轻轻颠倒3-5min ; (7) 4°C ， 13000rpm离心5min，水相以等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇醇沉，4°C 置10min以上。 (8)4°C， 13000rpm离心10min，弃上清，以70%乙醇洗涤沉淀并抽干；
(9)加入30-50 ii 1 TE溶解沉淀，力口 1 P 1 RNase A 37。C温浴30min ;
(10)取5-10 ii 1 DNA电泳检测。 提取缓冲液200mmol/L Tris-HCl， 250mmol/L NaCl， 25mmol/L EDTA， 0. 5% SDS， pH7. 5。 PCR反应程序为94。C 5min，94。C 40s，57。C 40s，72。C 70s， 30cycles，再72°C 7min。
Southern杂交(参见分子克隆) 为了证实PCR扩增结果的真实性和可靠性，进一步做了分子杂交检测。用BamHI 和Kpnl两种限制性内切酶酶切不同的转基因烟草基因组DNA。根据Roche公司的地高辛 标记试剂盒合成杂交用的探针，方法为加入1 P g模板DNA于0. 2ml离心管内，用ddH20补 充使终体积到16 y l，在沸水浴中加热10min使DNA变性并快速在冰上冷却，同时混匀Mix Dig-High Prime，加4iU到变性的DNA中，混匀并简短离心，放置37。C lh或0/N，加入2iU 0. 2M的EDTA(pH二8. 0)或65。C加热10min以终止反应，-2(TC冻存备用。杂交结果如图6 所示，转基因植株均出现了明显的杂交信号，而阴性对照株无杂交信号。这就进一步从DNA 水平上证明外源LcPIPl基因已导入并整合到烟草的基因组中。
RT-PCR检测 为了检测目的基因是否已经在转基因烟草中正常表达，在PCR和Southern杂交的 基础上，又对转基因植株进行了 RT-PCR检测。转基因烟草RNA的制备采用TaKaRa公司的 RNAiso Reagent试剂，方法同实施例l，RT(反转录)的方法同实施例1中cDNA第一链的合 成，PCR的反应程序同实施例5。结果如图7所示，转基因植株均能够扩增出与阳性质粒大 小一致的目的基因条带，证明在转录水平上转基因烟草中的外源LcPIPl基因已稳定表达， 没有出现沉默现象。
实施例6 : 转基因烟草植株耐旱生理功能检测
(1)离体叶片的失水速率分析 剪取四周龄烟草叶片，在滤纸上自然干燥。处理条件温度27t:，相对湿度40%， 时间4h，分别在Omin， 30min， 60min， 90min， 120min， 180min， 240min用电子天平称取叶片的 鲜重。实验重复3次，计算每段时间的失水重量和失水速率。结果表明转基因烟草叶片的失水速率慢于野生型，也说明转基因烟草具有比野生型较强的抗旱能力。 WO1] (2)整株植物的抗旱分析 将MS培养基上生长2周的烟草幼苗移到已称重的含有蛭石的营养钵中，在培 养室中培养2周，温度周期25t:(昼)/22C (夜)，光周期14h(光)/10h(夜)，光强为 120-130umo1 n^S、相对湿度50X。 2周时停止浇水，观察其生长情况，直到出现明显表型为 止。如图9所示，停止浇水1周后，转基因烟草生长良好，而非转基因烟草逐渐枯黄萎蔫。
(3)烟草叶片蒸腾速率的测定 用蒸腾仪在温度25°C，相对湿度50%，光强为120-130umol nft1的条件下测定野 生型和转基因烟草叶片的蒸腾速率(停止浇水1周的苗)，各测15株，计算其平均值及标准 误。结果如图IO所示，转基因烟草植株的蒸腾速率明显小于野生型。
0105]序列表
0106]〈110〉哈尔滨师范大学
0107]〈120〉羊草水孔蛋白及其编码基因与应用
0108]〈160>2
0109]〈210>1
0110] 0111 ]〈211>288 〈212>PRT
0112]〈213>羊草(Xeymus Chinensis)
0113]〈400>1
0114]Met Glu AspLysGluGluAspValArgLeuGlyAlaAsnLysTyrSer
0115]151015
0116]Glu Arg GinProlieGlyThrAlaAlaGinGlySerGluAspLysAsp
0117]202530
0118]Tyr Lys GluProProProAlaProLeuPheGluProGlyGluLeuLys
0119]354045
0120]Ser Trp SerPheTyrArgAlaGlylieAlaGluPheMetAlaThrPhe
0121]505560
0122]Leu Phe LeuTyrValThrlieLeuThrValMetGlyTyrSerAsnSer
0123]65707580
0124]Thr Ser LysCysAlaThrValGlylieGinGlylieAlaTrpSerPhe
0125]859095
0126]Gly Gly MetliePheAlaLeuValTyrCysThrAlaGlylieSerGly
0127]100105110
0128]Gly His lieAsnProAlaValThrPheGlyLeuPheLeuAlaArgLys
0129]115120125
0130]Leu Ser LeuThrArgAlaValPheTyrlielieMetGinCysLeuGly
0131]130135140
0132]Ala lie CysGlyAlaGlyValValLysGlyPheGinGinGlyLeuTyr
0133]145150155160
9
Met Gly AsnGlyGlyGlyAlaAsn ValValAlaProGlyTyr ThrLys165170175Gly Ser GlyLeuGlyAlaGlulie lieGlyThrPheValLeu ValTyr180185190Thr Val PheSerAlaThrAspAla LysArgAsnAlaArgAsp SerHis195200205Val Pro lieLeuAlaProLeuPro lieGlyPheAlaValPhe LeuVal210215220His Leu AlaThrlieProlieThr GlyThrGlylieAsnPro AlaArg225230235240Ser Leu GlyAlaAlalielieTyr AsnArgGluHisAlaTrp SerAsp245250255His Trp liePheTrpValGlyPro PhelieGlyAlaAlaLeu AlaAla260265270Val Tyr HisGinValVallieArg AlalieProPheLysThr LysSer275280285〈210>2〈211>1116〈212>DNA〈213>羊草(Xeymus Chinensis)〈220〉〈221>5， UTR〈222〉 (1)…(8)〈220〉〈221>CDS〈222〉 (9)…(875)〈220〉〈221>3， UTR〈222〉 (876)..(1116)〈400>2GCTCTAGAATGGAAGATAAA GAGGAGGACG TGCGCCTCGGGGCGMCAAG TACTCTGAGC60GTCAGCCCATCGGCACGGCG GCGCAAGGCT CCGAGGACAAGGACTACAAG GAGCCCCCGC120CGGCGCCGCTGTTCGAGCCC GGCGAGCTCA AGTCCTGGTCCTTCTACCGC GCCGGCATCG180CCGAGTTCATGGCCACCTTC CTCTTCCTCT ACGTCACCATCCTCACCGTC ATGGGCTACA240GCAACTCCACCTCCAAGTGC GCCACCGTCG GCATCCAGGGCATCGCCTGG TCCTTCGGCG300GCATGATCTTCGCCCTCGTC TACTGCACCG CCGGCATCTCCGGCGGGCAC ATCMCCCGG360CGGTGACCTTCGGGCTGTTC CTGGCGAGGA AGCTGTCGCTGACCAGGGCG GTGTTCTACA420TCATCATGCAGTGCCTGGGC GCCATCTGCG GCGCCGGCGTGGTCMGGGG TTCCAGCAGG480GCCTGTACATGGGCAACGGC GGCGGCGCCA ACGTCGTCGCGCCAGGCTAC ACCMGGGCT540
CCGGGCTGGGCGCCGAGATCATCGGCACCTTCGTCCTCGTCTACACCGTCTTCTCCGCCA600CCGACGCCAAGAGGAACGCCAGGGACTCCCACGTTCCCATCCTTGCCCCGCTGCCAATCG660GGTTCGCGGTGTTCCTGGTCCACCTGGCCACCATCCCCATCACCGGCACAGGCATCAACC720CGGCGAGGAGCCTTGGCGCTGCCATCATCTACAACAGGGAGCACGCCTGGTCAGACCACT780GGATCTTCTGGGTCGGCCCCTTCATCGGCGCCGCGCTGGCCGCCGTCTACCACCAGGTGG840TCATCAGAGCGATCCCATTCMGACCAAGTCCTGAGCCGCTGCTCTACAAAGAMGACGC■CMCCCGAAGAGCAAGCTGCGTCGTTCTGATGGGCCGGCTCTCTCTTCCCAATTCCCATC960CGTGTTACCGTGGAATTCCAATTTGTCTTCCAAGTTTGATGTACTCTGTATTCACCTGM1020CCCAGACTTGTATGTMTCTCGTCAGTACTCAGTTGGTGTGTGTGCTGCCGCCGTTGTGC1080AAATTAATCCAGTCAAGTTTATTCAAACAAGCTTGG1116
1权利要求
一种羊草水孔蛋白LcPIP1，其特征是羊草水孔蛋白基因LcPIP1的编码蛋白，是具有以下氨基酸序列的蛋白质(1)序列表中的SEQ ID No1；(2)序列表中SEQ ID No1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与SEQ ID No1蛋白质序列具有相同活性的、由SEQ IDNo1衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，其特征是所述的羊草水孔蛋白基因 LcPIPl是下列核苷酸序列之一 (1) 序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列；(2) 编码序列表中SEQ ID No :1蛋白质序列的DNA ;(3) 与序列表中SEQ ID No :2的DNA序列具有95X以上的同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列；(4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No :2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3. 根据权利要求l所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，其特征是所述的序列表中的SEQ ID No :1由288个氨基酸残基组成，所述的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加是指不 多于十个氨基酸残基的取代、缺失或添加。
4. 根据权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，其特征是所述的序列表中的SEQ ID No :2由1116个脱氧核苷酸组成，开放读码框为自5'端第9位至第875位脱氧核苷酸。
5. 根据权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl，其特征是所述的高严谨条件可为在 0. IXSSPE(或O. IXSSC)，O. 1% SDS的溶液中，在65。C下杂交并洗膜。
6. —种含有权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl基因的表达载体或细胞系。
7. —种含有权利要求2所述的羊草水孔蛋白LcPIPl基因的宿主菌。
8. —种羊草水孔蛋白LcPIPl基因在培育抗旱植物中的应用。
全文摘要
羊草水孔蛋白及其编码基因与应用，目前对于羊草的研究仅限于人畜的食用及成份分析等方面，而将其作为耐旱植物对其分子生物学方面的研究还少见报道。羊草水孔蛋白，是具有以下氨基酸序列的蛋白质(1)序列表中的SEQ IDNo1；(2)序列表中SEQ ID No1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与SEQ ID No1蛋白质序列具有相同活性的、由SEQ IDNo1衍生的蛋白质。将本发明的水孔蛋白的编码基因转入其它植物，可增强转基因植物的抗旱能力。本发明应用于植物基因工程领域。
文档编号A01H5/00GK101787074SQ200910071328
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者徐静, 徐香玲, 曲敏, 李新玲 申请人:哈尔滨师范大学