一种提高生物体中硒含量的方法
【专利摘要】本发明公开了蛋白OsPT2及其相关生物材料在提高生物体中硒含量的应用。其中的一个应用是培育生物体硒含量提高的转基因方法。该方法包括向受体材料中导入OsPT2基因，得到硒含量高于所述受体材料的转基因生物的步骤；所述OsPT2基因编码如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）在序列表中序列2同源或者所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由a）衍生的蛋白质。OsPT2基因可用于提高和改良生物体中的硒含量。
【专利说明】一种提高生物体中砸含量的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高生物体中硒含量的方法。
【背景技术】
[0002]硒是人和动物必需的微量元素，它以硒代半胱氨酸形式构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性位点而发挥其作用，具有抗氧化、提高免疫力和预防癌症等多种重要的生理功能。硒在调节维生素A、C、E和K的吸收与消耗、参与辅酶A和辅酶Q的合成、刺激免疫球蛋白及抗体的产生等方面也起着重要作用。此外，硒还具有维持男性生育功能、抵抗HIV病毒和延缓人体衰老等作用。一些地方性疾病如克山病、大骨节病、地氟病、克汀病、地方性癌等均与环境中硒水平低有关。硒与癌症间存在明显的负相关关系，硒水平明显影响癌基因与抗癌基因的表达，口腔癌、咽喉癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、胃肠道癌、肝癌、肺癌、食道癌等的发生均伴随血硒降低。长期食用硒缺乏食物会因硒营养不足而使机体抵抗力降低，消化系统功能受损，神经紊乱，影响视力、肾功能、生殖功能、性功能，诱发维生素、蛋白质及能量缺乏性营养不良、白内障、乳腺炎、肝炎、爱滋病、不妊症、克山病、大骨节病、高血压、溶血性贫血等20余种人类疾病。
[0003]正常情况下，人们主要从植物性食物，尤其谷物中获取硒(I )。由于植物性食物硒含量较低，人体平均每天获取的硒难以满足健康需求(2 )。叶面喷施硒肥虽然能提高作物籽粒硒含量和人体摄硒量，但同时也提高了农产品生产成本，甚至带来潜在的环境风险(3，4，
5)。此外，叶面喷施还受大风和降雨天气影响，对稻米籽粒硒含量的稳定影响较大。而通过遗传改良途径不仅能提高谷物籽粒中硒含量，而且还能降低硒肥施用量，是提高稻米籽粒硒含量的理想的途径(6， 7)。
[0004]正常情况下，硒在土壤溶液中主要以Se2' Se0, Se2O32' SeO广和SeO广形式存在
[5]0硒酸盐和亚硒酸盐是能够被植物吸收的主要硒形式。氧化还原电位和pH能显著影响硒在土壤中的存在形式。在氧化势高的条件下，Se042_是主要形式；在氧化势中等条件下，SeO广或HSeCV是主要存在形式(9)。研究表明，硫转运蛋白参与了植物中硒酸盐吸收(8，IO，11，12 )。高亲和硫转运蛋白At Su I tr I; 2通过筛选硒酸盐抗性突变体得以鉴定(13，14 )。与硒酸盐不同，植物吸收亚硒酸盐机制还没有完全研究清楚。过去研究表明，亚硒酸盐通过被动扩散进入植物根内(15)。呼吸抑制剂仅能抑制亚硒酸盐吸收20%和30%支持了这一假设(16，17)。然而，在pH4.0条件下羟胺和DNP分别抑制亚硒酸盐吸收72%和86% (18)。这种差异主要由PH对吸收液中亚硒酸盐形式的影响造成的(19)。亚硒酸是一种二元弱酸，pKal和pKa2分别为2.57和6.60。在不同pH条件下，亚硒酸盐以H2SeO3, SeO32-和HSe03_形式存在(19，20，21)。不同硒形式比例随pH变化很大(19，20，21)。水稻根系能通过水通道吸收H2SeO3形式的亚硒酸盐(Zhang et al.,2006)。
[0005]无机磷转运蛋白是植物中无机磷(phosphate)吸收及转运的直接参与者。在水稻基因组中存在13个PHTl家族的无机磷转运蛋白，0sPT2是这13个成员之一。研究表明，0sPT2在爪蟾卵母细胞系统中表现出对无机磷的吸收能力，同时0sPT2干涉的转基因水稻表现出无机磷含量的显著降低，表明OsPT2在水稻的磷元素吸收转运中发挥重要作用。(ThePlant Journal(2009)57，798 - 809do1:
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【发明内容】
[0030]本发明所要解决的技术问题是提供来源于水稻的蛋白质0sPT2或其同源蛋白及其相关生物材料的新用途。
[0031]本发明所提供的一种新用途是培育生物体砸含量提高的转基因植物或其他生物的方法。
[0032]本发明所提供的培育硒含量提高的转基因生物的方法，包括向受体生物中导入0sPT2基因，得到硒含量高于所述受体生物的转基因生物的步骤；所述0sPT2基因编码如下a)或b)的蛋白质::
[0033]a)由序列表中序列2 (SEQ ID N0.2)所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0034]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由`a)衍生的蛋白质。
[0035]上述方法中，所述受体生物可为受体种子植物，所述培育硒含量提高的转基因生物可为培育籽粒硒含量提高的转基因植物。[0036]其中，序列表中序列2由528个氨基酸残基组成。
[0037]本发明还保护提高种子植物硒含量的方法。
[0038]本发明所提供的提高种子植物硒含量的方法，包括提高目的种子植物中所述0sPT2基因表达水平，得到硒含量提高的转基因植物。
[0039]上述方法中，所述提高种子植物硒含量可为提高种子植物籽粒硒含量，所述硒含量提高的转基因植物可为籽粒硒含量提高的转基因植物。
[0040]上述方法中，提高目的种子植物 中所述0sPT2基因表达水平具体可为向目的种子植物中导入所述0sPT2基因。
[0041]上述方法中，所述转基因植物的所述0sPT2基因的表达水平高于所述受体种子植物。
[0042]所述0sPT2基因具体可为如下I)或2)或3)或4)所示的基因:
[0043]I)其编码序列是序列表中序列I (SEQ ID N0.1)的第46-1632位核苷酸的cDNA分子;
[0044]2)核苷酸序列是序列表中序列I的cDNA分子；
[0045]3 )在严格条件下与I)或2 )限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA ；
[0046]4)与I)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA。
[0047]其中，序列表中序列I由1929个核苷酸组成。
[0048]上述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0.1 X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0049]上述方法中，其中所述0sPT2基因可先进行如下修饰，再导入受体材料(如受体种子植物)中，以达到更好的表达效果:
[0050]I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述0sPT2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ；
[0051]2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
[0052]3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0053]4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
[0054]5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV )。
[0055]上述方法中，所述0sPT2基因通过含有所述0sPT2基因表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中。
[0056]本发明中所述0sPT2基因表达盒均可含有所述0sPT2基因和启动所述0sPT2基因转录的启动子。本发明中所述0sPT2基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ IDN0.2所示的0sPT2的DNA，该DNA不但可包括启动所述0sPT2基因转录的启动子，还可包括终止所述0sPT2基因转录的终止子。进一步，所述0sPT2基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于:花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999) PlantPhysioll20:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I (PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代 羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267);四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128 (CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:0dell等人(I985)Nature313:810 ；Rosenberg等人(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet, 262:141;Proudfoot (1991)Cell, 64:671; Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891 ；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res., 15:9627) ?
[0057]在本发明的实施例中，所述0sPT2基因表达盒中，启动所述0sPT2基因转录的启动子是水稻肌动蛋白启动子(Actin)，终止所述0sPT2基因转录的终止子是农杆菌章鱼碱合成酶终止子(Ocs-T )。
[0058]可用现有的植物表达载体构建含有所述0sPT2基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pGWB412、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0059]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述0sPT2基因通过含有所述0sPT2基因表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中。含有所述0sPT2基因表达盒的重组表达载体为 pCambia-0sPT2，pCambia-0sPT2 是将 pCambia2300Actinl 的 XbaI 和 PstI 位点间的片段替换为编码序列是序列表中序列I第46-1632位核苷酸所示的0sPT2基因得到0sPT2基因表达载体。/
[0060]所述0sPT2基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998, Method forPlant Molecular Biology VIIIj Academy Press, New York, pp.411-463;Geiserson andCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0061]上文中，所述转基因种子植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0062]上文中，所述种子植物具体可为被子植物；进一步，所述被子植物可为单子叶植物和双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、蔬菜等。
[0063]本发明所提供的另一种新用途是0sPT2或与0sPT2相关的生物材料在调控植物亚硒酸盐吸收能力中的应用；
[0064]所述0sPT2是如下a)或b)的蛋白质:
[0065]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0066]b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由a)衍生的蛋白质；
[0067]所述与0sPT2相关的生物材料，为下述BI)至B7)中的任一种:
[0068]BI)编码所述0sPT2的核酸分子；
[0069]B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0070]B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有BI)所述表达盒的重组载体；
[0071]B4)含有BI)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0072]B5)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0073]B6)降低所述0sPT2表达的核酸分子；
[0074]B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
[0075]上述应用中，所述调控硒酸盐吸收能力体现为下述至少任一种:
[0076]I)调控(提高或降低)植物根系亚硒酸盐吸收速率；
[0077]2)调控(提高或降低)植物根系和茎叶中亚硒酸盐含量；
[0078]3)调控(提高或降低)种子植物中籽粒中硒含量。
[0079]上文中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述应用中，BI)所述核酸分子为如下I)或2)或3)或4)所示的基因:
[0080]I)其编码序列是序列表中序列I的第46-1632位核苷酸的cDNA分子；
[0081]2)核苷酸序列是序列表中序列I的cDNA分子；
[0082]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA ；
[0083]4)与I)或2)限 定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述0sPT2的cDNA分子或基因组DNA;
[0084]上文中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产喊菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述转基因植物细胞系为非植物繁殖材料。
[0085]这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0086]B6)所述降低所述0sPT2表达的核酸分子具体可为SEQ正向-X-SEQi^
[0087](I)
[0088]所述SEQ 正向选自 SEQ ID N0.1 ；
[0089]所述SEQ的序列与所述序列反向互补；
[0090]所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ?向及所述SEQfi^1均不互补。在本发明的一个【具体实施方式】中，所述核苷酸序列为SEQ ID N0.1的第147-451位核苷酸。在本发明的一个实施方式中，SEQ1^1-X-SEQfi^1 (共809bp)，序列是SEQ ID N0.1的第147-451位核苷酸(共305bp)，X的序列是序列4 (共109bp)，是马铃薯GA20氧化酶第一个内含子的序列，SEQ_的序列(共305bp)与SEQ正向的序列反向互补。
[0091]编码所述0sPT2的核酸分子具体可为序列表中序列I的cDNA分子。
[0092]上述应用中,所述植物可为单子叶植物或双子叶植物,如玉米、水稻、小麦。
[0093]本发明的实验证明，0sPT2基因表达量提高的转基因水稻的根系亚硒酸盐吸收速率极显著高于野生型水稻，根系和茎叶中亚硒酸盐含量显著高于野生型水稻，籽粒中硒含量显著高于野生型水稻；0sPT2基因表达量降低的转基因水稻的根系亚硒酸盐吸收速率显著低于野生型水稻，根系和茎叶中亚硒酸盐含量显著低于野生型水稻，籽粒中硒含量显著低于野生型水稻。OsPT2基因可用于提高和改良种子植物籽粒中的硒含量。
[0094]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0095]图1 为 pCambia2300Actinl 的物理图谱。
【具体实施方式】
[0096]以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0097]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0098]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0099]下述实施例中的水稻中花11号(又称为中花11号水稻XTong H, Jin Y, Liu W, LiF，Fang J1Yin Y, Qian Q, Zhu L, Chu C(2009)DWARF AND LOff-TILLERING, a new member ofGRAS family, plays positive roles in brassinosteroid signaling in rice.PlantJ.58:803-816)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0100]下述实施例中的双兀载体pCambia2300Actinl (Lin A'Wang Y', Tang J', XueP, Li C,Liu L, Hu B, Yang F,Loake GJ,Chu C(2012)Nitric oxide and proteins-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide induced leaf cell death inrice, Plant Physiol.158·:451-464)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。pCambia2300Actin的物理图谱如图1所示。
[0101]下述实施例中的硒含量测定方法如下:
[0102]所用玻璃器皿预先浸泡在10%HC1溶液中以免硒污染。将烘干和混匀样品(IOOmg)称重，然后放进100ml消化管中。加入5!111混合酸(順03:!1(:104=4:1)。在25°C条件下静置一昼夜后在150°C条件下消解至澄清。冷却后，将消解液用去离子水定容至25ml，然后用ICP-MS测定样品中硒含量。所有试剂均为优级纯。与被测样品同时消化茶叶标样(GBW07605 (GSV-4) (0.072mg kg4Se)和空白。硒平均回收率在89和93%之间。
[0103]实施例1、0sPT2基因过表达载体和0sPT2基因干扰载体的构建
[0104]1、0sPT2基因过表达载体pCambia-0sPT2的构建
[0105]提取水稻中花11号三叶期幼苗总RNA，采用RT-PCR方法扩增到编码0sPT2的726bp全长cDNA。其中，
[0106]I)植物总RNA的提取:选取IOOmg三叶期水稻中花11号的幼苗为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含Iml Trizol试剂(Invitrogen)的1.5ml离心管中，充分混匀；25°C放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿,剧烈振摇15秒，25°C温育2_3分钟；12，OOOrpm,4°C,离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加
0.5ml异丙醇，25°C放置10分钟使RNA沉淀;12，OOOrpm，4°C，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用lml75%乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50 μ I DEPC_ddH20重悬沉淀，60°C水浴10分钟，以溶解RNA沉淀获得RNA溶液。将此RNA溶液分装后_70°C保存，备做反转录的模板。
[0107]2) RT-PCR:取I μ I上述RNA溶液，用DEPC_ddH20稀释100倍，用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒(Promega)说明书，根据RNA的定量结果，取含有2 μ gRNA的上述RNA溶液，加l.0yg Oligo dT引物，用DEPC_ddH20补充至15 μ 1，混匀后70°C变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25 μ I反转录混合物(5μ I M-MLV5 X ReactionBuffer,6 μ I dNTP Mixture (2.5mM), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase,0.5 μ I RNaseInhibitor, 12.5μ I DEPC_ddH20)。混匀后，42°C水浴I小时完成反转录过程；75°C水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。
[0108]取I μ I上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应:0.2 μ I LATaq( 5U/μ 1),10 μ 12 X GC buffer, 1.8μ I dNTPs, 0.5 μ 15'端引物(10 μ Μ)，0.5 μ 13'端引物(10 μ Μ)，加ddH20终体积20 μ I。
[0109]其中，5'端引物:5’ -TCTAGAGCTTATAACTTTGCAGCTTGAGG-3 ’(下划线序列为 XbaI位点)，3;端引物:5’ -CTGCAGGGGAAAGTTCACAAAATCTCACA-3，(下划线序列为 PstI 位点)为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物。
[0110]回收PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列3。该PCR产物为0sPT2基因，其编码序列为序列表中序列I自5’末端第46-1632位核苷酸，编码氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白质0sPT2。
[0111]将该PCR产物用XbaI和PstI酶切后，将该片段克隆入质粒载体
[0112]pCambia2300Actinl 的 XbaI 和 PstI 位点处，得到重组载体 pCambia_0sPT2。
[0113]pCambia-0sPT2 是将 pCambia2300Actinl 的 XbaI 和 PstI 位点间的片段替换为序列表中序列I第10-1835位核苷酸(即序列3)所示的0sPT2基因得到0sPT2基因表达载体。
[0114]2、0sPT2 基因干扰载体 pCambia-1n0sPT2 的构建
[0115]将0sPT2 基因干扰片段 SEQ 正向-X-SEQ 反向(共 809bp)插入 pCambia2300Actinl的 SalI 和 PstI 位点，得到重组载体 pCambia_in0sPT2。pCambia_in0sPT2 是将pCambia2300Actinl的SalI和PstI位点间的片段替换为0sPT2基因干扰片段得到0sPT2基因干扰载体。其中，序列是SEQ ID N0.1的第147-451位核苷酸(共305bp)。X的序列是序列4(共109bp)，是马铃薯GA20氧化酶第一个内含子的序列。SEQg的序列(共305bp)与SEQtt的序列反向互补。
[0116]实施例2、利用0sPT2蛋白及其相关生物材料调控水稻对亚硒酸盐的吸收能力及培育籽粒硒含量提高或降低的转基因水稻
[0117]1、培育转基因水稻
[0118]按照文献(LiuX, Bai X，Wang X, Chu C.2006.0sffRKY71, a rice transcriptionfactor,is involved in rice defense response.Journal of Plant Physiology164(8):969 - 979)利用农杆菌介导的转化方法，将实施例1构建的0sPT2基因过表达载体pCambia-0sPT2转入水稻中花11号得到转pCambia_0sPT2水稻，将实施例1构建的0sPT2基因干扰载体pCambia-1n0sPT2转入水稻中花11号得到转pCambia_in0sPT2水稻，将pCambia2300Actinl转入水稻中花11号得到转pCambia2300Actinl水稻，具体方法如下:[0119]参照电激仪(EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司)操作指南，将pCambia_0sPT2、pCambia_in0sPT2 和 pCambia2300Actinl 分别用电击法单独转化农杆菌EHA105 (Biovector C0.，LTD公司目录号Biovec-1I )，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到转入 pCambia-0sPT2 的重组菌，命名为 EHA105/pCambia-0sPT2，转入
[0120]pCambia-1n0sPT2 的重组菌，命名为 EHA105/pCambia_in0sPT2，转入
[0121]pCambia2300Actinl 的重组菌，命名为 EHA105/pCambia2300Actinl。
[0122]将EHA105/pCambia-0sPT2、EHA105/pCambia_in0sPT2 和
[0123]EHA105/pCambia2300Actinl分别单独导入水稻中花11号(以下简称野生型水稻)的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗漆4-5遍,无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代(2周/代);取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(1)，上，在分化培养箱(每天12小时光照，12小时黑暗，白天28°C，夜晚25°C)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得15株TO
代转pCambia-0sPT2水稻(株系名称分别为Οχ-l, 0x_2、0x_3、......、0x15)、12株TO代转
pCambia-1n0sPT2 水稻(株系名称分别为 R1-l、Ri_2、R1-3、R1-4、R1-5、......、Ri_12)和 10
株TO代转pCambia2300Actinl水稻(株系名称分别为空1、空2、......、空10)。
[0124]上述方法中，所用培养基如表1。
[0125]表1、培养基
【权利要求】
1.培育硒含量提高的转基因生物的方法，包括向受体生物中导入0SPT2基因，得到硒含量高于所述受体生物的转基因生物的步骤；所述OsPT2基因编码如下a)或b)的蛋白质: a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列同源或氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述OsPT2基因为如下I)或2)或3)或4)所不的基因: 1)其编码序列是序列表中序列I的第46-1632位核苷酸的cDNA分子； 2)核苷酸序列是序列表中序列I的cDNA分子； 3)在 严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA ； 4)与I)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述OsPT2基因通过含有所述OsPT2基因表达盒的重组表达载体导入所述受体生物中，所述OsPT2基因表达盒中，启动所述OsPT2基因转录的启动子是水稻肌动蛋白启动子，终止所述OsPT2基因转录的终止子是农杆菌章鱼碱合成酶终止子。
4.提高种子植物籽粒硒含量的方法，包括提高目的种子植物中OsPT2基因表达水平，得到籽粒硒含量提高的转基因植物；所述OsPT2基因编码如下a)或b)的蛋白质: a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由a)衍生的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述受体种子植物为水稻、小麦、玉米、大豆、高粱或蔬菜,所述目的种子植物为水稻、小麦、玉米、大豆、高粱或蔬菜。
6.0sPT2或与OsPT2相关的生物材料在调控植物亚硒酸盐吸收能力中的应用； 所述OsPT2是如下a)或b)的蛋白质: a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物亚硒酸盐吸收能力相关的由a)衍生的蛋白质； 所述与OsPT2相关的生物材料，为下述BI)至B7)中的任一种: BI)编码所述OsPT2的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有BI)所述表达盒的重组载体； B4)含有BI)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物； B5)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； B6)降低所述OsPT2表达的核酸分子； B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:B1)所述核酸分子为如下I)或2)或3)或4)所示的基因: 1)其编码序列是序列表中序列I的第46-1632位核苷酸的cDNA分子； 2)核苷酸序列是序列表中序列I的cDNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述OsPT2的cDNA分子或基因组DNA ； 4)与I)或2)限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且编码所述OsPT2的cDNA分子或基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:编码所述OsPT2的核酸分子是序列表中序列I的cDNA分子。
9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于:所述调控硒酸盐吸收能力体现为下述至少任一种: 1)调控植物根系亚硒酸盐吸收速率； 2)调控植物根系和茎叶中亚硒酸盐含量； 3)调控种子植物中籽粒中硒含量。
10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为水稻。
【文档编号】C12N15/82GK103571870SQ201310536167
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月2日 优先权日:2013年11月2日
【发明者】储成才, 张联合, 胡斌 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所