盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用。所述的盐穗木金属硫蛋白基因具有如序列表SEQ?I?D?NO.1所示的碱基序列，全长为234bp，其编码由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中78个氨基酸组成的蛋白质。本发明还公开了含有该基因的重组表达载体和表达转化体，以及盐穗木金属硫蛋白的制备方法和应用。本发明从新疆盐碱植物盐穗木体内克隆获得新的金属硫蛋白基因，通过基因工程表达转化体生产获得的重组金属硫蛋白，含有14个半胱氨酸，不形成二硫键，丰富的巯基能螯合锌、铜、镉等重金属、清除自由基、抵抗电离辐射或紫外线照射，具有广泛的应用领域。
【专利说明】盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白与应用
发明领域
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】。具体的说，本发明涉及一种盐穗木金属硫蛋白及其基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体，以及一种重组盐穗木金属硫蛋白及其制备及应用【技术领域】。【背景技术】
[0002]金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。1957年Margoshes和Valles在研究镉的生物学作用时，从蓄积镉的马肾中首次分离出该物质。MT具有以下几个特征:分子量低，一般为6~7kD;能螯合金属离子，蛋白通过硫酯键与金属结合后，具有特殊的光吸收特征；半胱氨酸含量高，约占氨基酸残基总数的23 %~33 %，但不形成二硫键，分子中缺乏芳香族氨基酸和组氨酸；半胱氨酸残基在氨基酸序列中具有较为保守的排列方式。金属硫蛋白丰富的巯基含量及重金属结合能力决定了其功能的多样性。
[0003]近年来,对MT的研究和应用已经涉及到医药、农业、食品保健及化妆品添加剂、生物工程、环境保护等诸多领域，前景十分广阔。目前的研究证实了金属硫蛋白具有重金属解毒功能、清除自由基、抗辐射和紫外线照射、参与体内微量元素的代谢、防止细胞癌变以及环保作用。随着对金属硫蛋白结构、功能等研究的深入，其用途日益扩大，对其需求量也越来越大。目前国内生产MT的厂家，主要从兔肝中提取，由于MT原料需求特别，且生产工艺复杂，导致目前MT产量不大且价格昂贵。所以迄今为止一直缺乏一种高产量、低成本、安全性高、适宜于规模化生产MT的技术和方法。
[0004]综上所述，克隆金属硫蛋白基因，利用基因工程方法生产金属硫蛋白是降低生产成本的一条有效途径，及对其在医药、食品保健及化妆品等领域的应用具有重要的意义。
[0005]盐穗木(Halostachys caspica)为藜科盐穗木属，是生长在荒漠、半荒漠盐碱地上的重要盐生、旱生稀盐多汁半灌木植物，对盐分适应性极强，是盐土荒漠主要植物之一。在高盐和重金属胁迫下，其体内的金属硫蛋白基因表达水平呈明显上升趋势。目前还没有盐穗木金属硫蛋白及其基因的报道。
【发明内容】
[0006]针对天然金属硫蛋白含量少，传统生产工艺复杂、提取得率低的现状，本发明提供一种新的盐穗木金属硫蛋白及其基因，含有该基因的重组表达载体、转化体，以及重组盐穗木金属硫蛋白及其制备方法和应用。
[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一:提供一种盐穗木金属硫蛋白基因，所述的盐糖木金属硫蛋白基因具有如序列表SEQ ID N0.1所不的喊基序列，全长为234bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列中78个氨基酸组成的蛋白质，富含半胱氨酸。[0008]本发明技术方案之二:提供一种盐穗木金属硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQID N0.2所示，来源于新疆盐生植物盐穗木的金属硫蛋白。
[0009]进一步，本发明提供盐穗木金属硫蛋白基因的获得方法，通过提取盐处理的盐穗木总RNA，反转录cDNA，PCR扩增获得，其具体包括如下步骤:
[0010](I)根据盐穗木盐抑制差减文库中Hc6fl2的EST (GenBank登录号HS586469.1)序列的反向互补序列，设计引物用于扩增盐穗木金属硫蛋白基因的开放读码框；引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。
[0011](2)取300mM NaCl处理的盐穗木同化枝，应用RNAsimple Total RNA Kit提取总RNA ；以Oligo (dT)为引物，按TaKaRa M-MLV操作说明合成cDNA的第一链，以该cDNA第一链产物为模板进行RT-PCR反应，反应程序:94°C 5min，94°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，30个循环；将PCR产物，连接到克隆载体PMD18-T上，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性单菌落进行菌液PCR和双酶切鉴定并测序，得到如序列表中SEQ I D N0.1所示的带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的基因全长序列。 [0012]根据本发明，所述的盐穗木金属硫蛋白基因全长为234bp，起始密码子为ATGj*止密码子为TGA ;该序列无内含子，具有完整的开放阅读框，编码78个氨基酸；编码产物，SP本发明盐穗木金属硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQ I D N0.2所示；分子量为7.7kD，等电点为4.78 ;含14个半胱氨酸和15个甘氨酸。
[0013]本发明盐穗木金属硫蛋白基因也可以是编码由序列表中SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。而本发明盐穗木金属硫蛋白不仅限于序列表中SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列，还可以是SEQ I D N0.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的金属硫蛋白活性的由序列2衍生的蛋白质的核苷酸序列。
[0014]本发明技术方案之三:提供一种重组表达载体，包含上述的本发明的盐穗木金属硫蛋白基因的核苷酸序列；该重组表达载体的载体骨架优选原核表达载体，更优选pET_32a(+)。
[0015]本发明技术方案之四:提供一种重组表达转化体，包含上述的任何一种本发明的核苷酸序列或重组表达载体；该重组表达转化体优选细菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0016]本发明技术方案之五:提供一种重组盐穗木金属硫蛋白的制备方法，培养诱导上述本发明的重组转化体，获得重组的盐穗木金属硫蛋白:具体通过将提取的质粒pET32a-HcMT5 u L转化感受态细胞E.coli BL21，氨苄青霉素筛选获得阳性克隆；将含重组质粒的阳性克隆在37°C培养过夜，再以1%比例接种，37°C培养2~3h，当菌液的吸光度值A600达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.5M，于37°C诱导6h ;取培养液1.5mL, 12000rpm离心3min,收集沉淀，沉淀用pH7.4的50 y L PBS重悬，然后加入等体积的SDS缓冲液振荡后，置沸水浴中5min, 12000rpm离心IOmin,采用SDS-PAGE电泳检测结果,证实获得纯化的重组盐糖木金属硫蛋白。
[0017]本发明的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)重组表达转化体经IPTG诱导后表达出约25kD的目的融合蛋白，证实了本发明的盐穗木金属硫蛋白基因是一个具有表达功能的基因。[0018]本发明技术方案之六:提供上述方法所制备而得的重组盐穗木金属硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。获得的重组盐穗木金属硫蛋白属于I I型金属硫蛋白，其所编码的盐穗木金属硫蛋白成熟肽为78个氨基酸，分子量为7.7kD，等电点为4.78，含14个半胱氨酸和15个甘氨酸。
[0019]具体的，制备的重组盐穗木金属硫蛋白的氨基酸序列:
[0020]MSCCGGNCGC GAGCKCGSGC GGCKMFPDFG ENTSNPTVL I SGVAPK I SYAEGSEMGVAVENDGCKCGPNC QCNPCTCK
[0021]本发明技术方案之七:提供所述的重组盐穗木金属硫蛋白在制备重金属螯合解毒剂、食品保健营养素、化妆品添加剂中的应用。[0022]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果:
[0023](I)本发明提供一种盐穗木金属硫蛋白基因及其重组蛋白，源于新疆盐生植物盐穗木，根据盐穗木盐抑制差减文库中Hc6fl2的EST序列的反向互补序列，设计引物用于扩增盐穗木金属硫蛋白基因的开放读码框；引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点，提取总RNA,将PCR产物，连接到克隆载体pMD18-T上，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性单菌落进行菌液PCR和双酶切鉴定并测序，得到如序列表中SEQ I D N0.1所示的带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的基因全长序列；所述的盐穗木金属硫蛋白基因全长为234bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA ;该序列无内含子，具有完整的开放阅读框，编码78个氨基酸；获得编码产物，即本发明盐穗木金属硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQI DN0.2所示；分子量为7.7kD，等电点为4.78 ;含14个半胱氨酸和15个甘氨酸。
[0024](2)本发明提供的重组盐穗木金属硫蛋白基因转化体能耐受和富集重金属，重组盐穗木金属硫蛋白能清除羟自由基，具有明显的量效关系，并能有效地清除氧自由基。重组盐穗木金属硫蛋白在制备重金属螯合解毒剂、化妆品添加剂、食品保健营养素等方面中具有广泛的应用前景；针对天然金属硫蛋白含量少，传统生产工艺复杂、提取得率低的现状，本发明提供的重组金属硫蛋白体现出广阔的应用领域和深远的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1所示为盐穗木总RNA的提取图。
[0026]图2所示为盐穗木HcMT基因的克隆图。图中，M是标准核酸分子量MarkerDLlOOOO ；泳道I是大约234bp大小的基因片段。
[0027]图3所示为重组盐穗木金属硫蛋白的表达与纯化图。图中，M是标准蛋白质分子量marker ;泳道I是含有质粒pET32a_HcMT没有诱导的重组转化体；泳道2是0.3mM IPTG诱导的含有质粒pET32a-HcMT重组转化体表达产物；泳道3是纯化后的穿过液；泳道4是纯化的重组盐穗木金属硫蛋白。
[0028]图4所示为重组转化体对重金属的耐受图。图中，A为含有盐穗木金属硫蛋白基因的重组转化体能耐受Cu的胁迫情况图，B为含有盐穗木金属硫蛋白基因的重组转化体能耐受Zn的胁迫情况图。
[0029]图5所示为重组盐穗木金属硫蛋白清除羟自由基的效果图。
[0030]图6所示为重组盐穗木金属硫蛋白清除氧自由基的效果图。【具体实施方式】
[0031] 下面，用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。
[0032]本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有:
[0033]主要试剂:本发明中选用的所有材料、试剂都为本领域熟知选用的。包括Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA Marker、蛋白质Marker、蛋白胨、酵母浸出粉、丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、异丙基-P-D-硫代半乳糖苷、Trizol试剂、Oligo dT-Adaptor引物、RNase 抑制剂、RNase M-MLV (RNase H_)、TIANGEN 公司的 RNAsimple Total RNA Kit、Oligo (dT)、TaKaRa M-MLV、大肠杆菌 DH5a 等。
[0034]主要仪器:PCR仪、高压灭菌锅、气浴恒温振荡器、电子天平、微波炉、超纯水仪、超净工作台、恒温培养箱、热空气消毒柜、台式冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。
[0035]本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知选用的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0036]实施例一:盐糖木金属硫蛋白基因的克隆
[0037]1.盐穗木总RNA的提取
[0038]操作前实验台用紫外灯照射30min后，称取300mM NaCl预处理的0.1g盐穗木同化枝，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨,粉末移入装有ImLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡15s，15~30°C室温放置3~5min，4°C、12000r/min离心20min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.2mL抽提蛋白质,震荡15s,室温放置3~5min,4°C、12000rpm离心lOmin，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL, 15~30°C室温放置lOmin, 4°C、12000rpm离心lOmin。弃上清，沉淀部分加入70%乙醇溶液(无RNA酶水配置)lmL，洗涤，4°C>7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见附图1，其余_80°C冰箱保存。
[0039]2.反转录合成cDNA
[0040]EP管中配制下列模板RNA/引物混合液:10 ii L总RNA, 10 U L OligodT-Adaptor弓丨物，31.5 ii L无RNase的水，70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5 ii L上述RNA/引物变性溶液，20 u L5 XM-MLV缓冲液，20 u L dNTP, 2.5u L RNase 抑制剂，6 u L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C 保温 Ih,70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上。
[0041]3.PCR扩增盐穗木金属硫蛋白基因(HcMT)
[0042]以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶EcoRI和XhoI位点，PCR扩增盐穗木金属硫蛋白基因(HcMT)。
[0043]上游引物Fl:CCGGAATTCATGTCTTGCTGTGGTGG
[0044]下游引物Rl:CCGCTCGAGTCATTTGCAGGTGCAAGGG
[0045]PCR 反应体系:13.9 ii L dd H2O, 2 ii LlO X Taq 缓冲液，1.6 ii L dNTPs, 0.6 U LMg2+,
0.4u L Primer (Fl) ,0.4u L Primer (F2), I U L cDNAoPCR反应程序:94°C预变性5min，94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 30个循环。最后72°C温育IOmin0
[0046]4.PCR产物的电泳检测及序列分析
[0047]取5 ii LPCR扩增产物加6 X Loading Buffer，在1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果参见附图2，M是标准核酸分子量Marker DL10000 ;泳道I是大约234bp大小的基因片段。采用PCR产物回收试剂盒TIANquick Mini Purification Kit回收PCR产物，连接T载体，进行测序分析结果证明约234bp大小的基因片段是盐穗木金属硫蛋白基因(HcMT)的开放阅读框序列。
[0048]5.原核表达载体的构建
[0049]将回收的PCR产物HcMT基因与表达载体pET32a分别进行双酶切，轻弹管壁，混匀并离心，37°C酶切6小时。
[0050]在一微量离心管中分别依次加入下列试剂:
[0051]
【权利要求】
1.一种盐穗木金属硫蛋白基因，其特征在于，所述的盐穗木金属硫蛋白基因具有如序列表SEQ ID N0.1所不的喊基序列，其编码氣基酸序列如表SEQ IDN0.2所不。
2.一种盐穗木金属硫蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ I D N0.2所示。
3.—种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的盐穗木金属硫蛋白基因的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体的载体骨架优选pET-32a(+)原核表达载体。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求3~4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，其为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
7.—种重组盐穗木金属硫蛋白的制备方法，培养诱导权利要求5所述的重组表达转化体，获得重组的盐穗木金属硫蛋白，其特征在于，具体通过将提取的质粒pET32a-HcMT5 u L转化感受态细胞E.coli BL21，氨苄青霉素筛选获得阳性克隆；将含重组质粒的阳性克隆在37 °C培养过夜，再以I %比例接种，37 °C培养2~3h，当菌液的吸光度值怂㈨达到0.6时，加A IPTG至终浓度0.5M，于37°C诱导6h ;取培养液1.5mL, 12000rpm离心3min,收集沉淀，沉淀用PH7.4的50 ii L PBS重悬，然后加入等体积的SDS缓冲液振荡后，置沸水浴中5min，12000rpm离心IOmin,采用SDS-PAGE电泳检测结果,证实获得纯化的重组盐穗木金属硫蛋白。
8.—种如权利要求1-3 任一项所述的重组盐穗木金属硫蛋白在制备重金属螯合解毒剂中的应用。
9.一种如权利要求1-3任一项所述的重组盐穗木金属硫蛋白在制备食品保健营养素中的应用。
10.一种权利要求1-3任一项所述的重组盐穗木金属硫蛋白在制备化妆品添加剂中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103614386SQ201310566742
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】刘忠渊, 哈斯亚提汗·阿布都拉, 孟红恩, 张富春 申请人:新疆大学