一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量pcr试剂盒及检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、蟑螂浓核病毒DNA的提取以及有效性验证及结果判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：5’-CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’，反向引物的序列为：5’-GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’，扩增产物为250bp。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性和稳定性，适用于该病毒的定性和定量的检测。
【专利说明】—种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及昆虫病毒生物农药检测【技术领域】，具体涉及一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对黑胸大蠊浓核病毒进行定性、定量检测，还涉及一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法，方法简单，易行。【背景技术】
[0002]蟑螂学名蜚蠊，属于昆虫纲(Insecta)、直翅目(Blattaria)、蜚蠊科(Blattidae)0蟑螂是一种非常古老的昆虫，早在3亿年前就已出现，素有活化石之称。同时蟑螂又是危害人类健康的重要卫生害虫之一，其危害不亚于蚊虫、苍蝇及老鼠的一类重要卫生害虫，已知蟑螂体内外能携带霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等多种细菌和钩虫、蛔虫、鞭虫等十种寄生虫卵，可在体内贮存多天，并不断排出体外，污染周围环境。多年来防治蟑螂的主要方法是使用化学农药，造成了蟑螂抗药性增强，且一年多次用药，造成环境污染，现在人民生活水平逐步提高，在家庭灭蟑上都希望采用生物农药，而应用微生物防治蟑螂已有很多报道，其中从自然罹病蟑螂体内分离到的黑胸大蠊浓核病毒对蟑螂有非常好的感染性，死亡率高达99%。
[0003]黑胸大爐浓核病毒(Periplanetafuliginosa densonucleosis virus, PfDNV)是武汉大学胡远扬教授等人在国内首先发现并报道，是在国内外第I个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。该病毒与其他细小病毒一样，病毒粒子无包膜，呈球状二十面体对称，直径22nm基因组为单链线状DNA分子(ssDNA)，沉降系数为102s，浮力密度为1.42g/ml,可以通过差速离心和密度梯度离心的方法将其分离提纯。病毒粒子的SDS-PAGE显示由5个蛋白组成，分子量分别为52KD，56KD，79KD，82KD，105KD。PfDNV基因组全长为5454bp(PfDNV基因组序列已提交Genbank，编号为:AF192260.1)。基因组正链有4个大的阅读框(0RF)，负链含有3个大的阅读框，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。ICTV第九次会议正式将其独立列为一个属:Pefudensovirus。黑胸大蠊浓核病毒可引起蟑螂食欲减退，行动迟缓，后体翻仰卧不能自正，直至不动而死去。死后虫尸外观体形体色不变，体软腐，压之流出乳白色脓液，无臭味；此病毒最显著的病症是嗉囊特别膨胀，呈白色鱼泡状的气囊，气囊一般伸达第2-4腹节，有的甚至占住整个血腔，将中、后肠挤压至尾端一侧，囊内空而无物，破之气消瘪缩；其次是中肠稍肿胀，黑褐色，破之，流出黑褐色液体；后肠黑色，滞留有未排出的粪便。目前应用黑胸大蠊浓核病毒制成的杀蟑产品有拜乐生物杀蟑饵剂、方便贴、拜乐生物杀蟑饵盒等产品。而产品的不断推出，需要有更快更简单的方法对其有效成分黑胸大蠊浓核病毒进行定性定量检测，才能保证产品的质量。近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在生物农药、医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用(杨和平、孟小林、徐进平等.荧光定量PCR技术检测样品中SeMNPV有效含量[J].中国病毒学，2006,21 (5):494-498.乔鲁芹，曲良建，王玉珠等.美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].昆虫病毒，2010，53 (7):824—830.Petersen Ej Edvinsson B, Lundgren B，et al.Diagnosis ofpulmonary infection with Toxoplasma gondii in immunocompromised HIV-positivepatients by real-1me PCR[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2006，25 (6):401-4
04.;Goldschmidt P，Rosne H，Saint-jean C，et al.Effects of topical anaesthetimsand fluorescein Oil the real-time PCR used for the diagnosis of Herpesvirusesand Acanthamoeba keratitis[J].Br J ophthalmol，2006，90(II):1354-1356.;Regis Sj Grossij Laldi S，et al.Diagnosis of Pelizaeus-Merzbacher disease !detectionof proteolipid protein gene copy numher by real-time PCR[J].Neurogenetics, 2005,6(2):73-78.;Lobetti R G，Tasker S.Diagnosis of feline haemoplasma infectionusing a real-time PCR assay[J].J S Afr Vet Assoc，2004，75 (2):94-99.;Ordinaire I，Simon A，Frealle E，et al.Real-time quantitative PCR for toxoplasmosisdiagnosis[J].Ann BiolClinj 2005, 63(I):67-73.;Ovarnstrom Y，James Cj XayavongMjet al.Comparison of real-time PCR protocols for differential laboratorydiagnosis of amebiasis[J].J Clin Microbiol,2005, 43(11):5491-5497.;Knorr Lj FoxJ Dj Tilley P A，et al.Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetellapertussis infection[J].BMC Infect Disj 2006(6):62-64.;Vanden B Rj Kuijper EJj Vancopdenraer C L，et al.Rapid diagnosis of toxinogenic Clostridium difficilein faeeal samples with internally controlled real-time PCR[J].Ciin Microbiol Infect, 2006, 12(2):184-186.;Machida U，Kami M，FukuI T，et al.Real-time automatedPCR for early diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection after bonemarrow transplantation[J].J Clin Microbiol, 2000, 38(7):2536-2542.)
[0004] 申请人:提供的黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，旨在对黑胸大蠊浓核病毒进行定性和定量检测，为生产及市场提供简单、方便的检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对黑胸大蠊浓核病毒进行定量检测。一次可检测48-96个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
[0006]本发明的另一个目的是在于提供了一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR检测方法，方法易行，操作简便，具有灵敏度高、检测时间短和可定量分析的特点，可用于蟑螂体内的病毒的定量分析。
[0007]本发明的最后一个目的是在于提供了一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒在蟑螂病毒杀蟑饵剂检测中的应用，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需3-4个小时就能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。[0008]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
[0009]一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其组分如下:
[0010]I) DEPC 水；2) SYBR Green I Master ;3)引物:正向引物
[0011]5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’ ；反向引物 5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；4)标准阳性模板:是含有黑胸大蠊浓核病毒基因238个核苷酸片段(其序列为SEQ ID N0.3所示)的pBluesript质粒。
[0012]在本发明的优选方案中，PCR反应液中由:DEPC水8μ L ;2XSYBR Green IMaster 10 μ L ;正向引物 IOmM, 0.5 μ L ;反向引物 IOmM, 0.5 μ L。
[0013]所述的标准阳性模板是黑胸大蠊浓核病毒基因238个核苷酸片段构成的pBluesript构成的。且该载体可在大肠杆菌E.coli DH5 a中增殖。该质粒转化大肠杆菌E.coli DH5 a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至I X IO9拷贝/微升，-20°C保存。
[0014]一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR检测方法，其步骤如下:
[0015]A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；
[0016]定量标准质粒为5.4X1010拷贝/μ L，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0X ΙΟ9、1.0Χ I O8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ ΙΟ6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4、1.0Χ 103、1.0Χ102的稀释液，稀释液在_20°C条件下保存备用；
[0017]B)提取病毒DNA:用商品化试剂盒或用常规DNA裂解液提取DNA ；
[0018]C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含2X SYBR Green I Master、引物和DEPC水的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；
[0019]20μ L 的 PCR 反应体系含有成分如下:DEPC 水，8μ L ;2XSYBR Green I Master,10 μ L ；10mM 正向引物，0.5 μ L ；10mM 反向引物，0.5 μ L ;模板，IyL;
[0020]正向引物5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3 ’ ；反向引物5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；
[0021]反应循环程序为:95°C预变性5min，l个循环；95°C变性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；
[0022]D)建立检测标准曲线，通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
[0023]一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒在蟑螂病毒杀蟑饵剂检测中的应用，其应用过程是:
[0024]取商品化的蟑螂病毒杀蟑饵剂，应用本发明的黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒对其进行定性定量检测，步骤如下:
[0025]1、称取商品化的杀蟑饵剂Ig溶解至IOmL蒸馏水中，重复6次；
[0026]2、5000r/分，离心10分钟后，取上清液；
[0027]3、第2步收集的上清液，在30000r/分下离心I小时，取沉淀；
[0028]4、沉淀用水稀释后DNA ；
[0029]5、提取的DNA用本发明提供的黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR，检测病毒数量，检测其产品质量是否符合要求。
[0030]本发明与现有技术相比具有以下优点和效果:
[0031]1、定量准确；
[0032]2、检测速度快，仅1.5小时，加上DNA提取的制备，共仅需3 — 4小时；
[0033]3、方法易行，操作简便；
[0034]4、可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98%。
[0035]5.在本发明中提供的黑胸大蠊病毒快速定量检测黑胸大蠊病毒荧光定量PCR试剂盒可对黑胸大蠊病毒进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的PCR定性和电镜计数定量检测方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为黑胸大蠊浓核病毒中的特异性片段电泳图。
[0037]图2为黑胸大蠊浓核病毒的荧光定量PCR的扩增曲线示意图。
[0038]图3为黑胸大蠊浓核病毒的荧光定量PCR的熔解曲线示意图。
[0039]图4为黑胸大蠊浓核病毒的荧光定量PCR的扩增标准曲线图。
[0040]图5为利用本发明试剂盒检测商品化杀蟑饵剂的荧光定量PCR的扩增标准曲线图。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
[0042]实施例1:
[0043]本发明实施例中黑胸大蠊浓核病毒荧光定量PCR试剂盒所需试验材料及仪器:
[0044]1、黑胸大蠊浓核病毒:武汉武大绿洲生物技术有限公司提供
[0045]2、实验试剂:K0D 聚合酶、dNTP 及 MgS04(购于 Τ0Υ0Β0 公司)，LightCycler 480SYBRGreen I Master、DEPC 处理水(购自 Roche 公司)。
[0046]3、实验仪器:
[0047]离心机(Thermo)、普通PCR仪(东胜国际贸易有限公司)、实时荧光定量PCR仪(LightCycler480 II Roche公司)、紫外分光光度计(岛津)、冰箱(青岛海尔股份有限公司)实施例2:
[0048]一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒标准曲线的建立，步骤如下:
[0049]1、标准质粒的构建:将SEQ ID N0.3所示核苷酸序列(此序列在NCBI上进行比对后为唯一 DNA序列)利用常规基因克隆技术克隆至载体pBluescript ；pBluescript II SK(+ )购自 Stratagen 公司。
[0050]2、特异性引物的设计:以步骤I中选取的高度保守序列为基准，设计一对特异性引物；设计原则为:每条引物的长度为18-25个碱基，特异性引物中的GC含量要求在40-60%，理论Tm值>50°C ;扩增产物的长度在100_300bp ;选用的特异性引物要求设计在蟑螂浓核病毒基因中的保守区，只对蟑螂浓核病毒特异，和其他物种无交叉反应；所述特异性引物包含有正向引物和反向引物:
[0051]正向引物的序列为:5’-CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’，
[0052]反向引物的序列为:5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3，。
[0053]3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤:
[0054](I)模板的制备
[0055]将步骤I中构建的标准质粒10倍系列梯度稀释，以稀释液为模板；具体如下:定量标准质粒为5.4X101(I拷贝/y L，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0X109、1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0XlO3 的稀释液，稀释液在-20°c条件下保存备用；
[0056](2)实时荧光定量PCR反应体系:
[0057]20 μ L 的 PCR 反应体系含有成分如下:DEPC /Κ,8μ L ；2XSYBR Green I Master,10 μ L ；10mM 正向引物，0.5 μ L ；10mM 反向引物，0.5 μ L ;模板，IyL;
[0058](3)循环反应:
[0059]根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条 件后进行扩增，反应循环程序为:95°C预变性5min，I个循环；95°C变性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40个循环后反应结束，得到反应产物，扩增出的特异性片段为图1所示，250bp ；
[0060](4)建立检测标准曲线:荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为X轴，CT值为y轴的标准曲线(如图4所示)；
[0061]Log 浓度(X)与 Cp 的关系为:Cp=-3.3029X+36.058，相关系数(R2)达到 0.9987，斜率为-3.3029 ；
[0062]对图所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的灵敏性和特异性。(见图2、图3)
[0063]4.重复性验证
[0064](I)将质粒标准品稀释成3个浓度，模板DNA含量分别为1.0 X 108、1.0 X 107、
1.0 X IO6拷贝/ μ L，对每个浓度的样品经荧光定量PCR进行定量分析，分别重复3次检测，批内和批间重复性通过计算CT值的标准差(SD)和变异系数(CV)进行评价。
CT值浓度 SDCV%
19.11 3.52E6 0.075 0.39
19,18 3.38E6
[0065]..............................................................................1-
?α 03 3 72E6
?Ακ mJfI 1MF ft M
1SJ7 I 2.58E7 0.187LW
15.65 I 3-16E7
【权利要求】
1.一种黑胸大蠊浓核病毒实时荧光定量PCR试剂盒，包括序列为SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示的引物。
2.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒由:DEPC水；2) SYBR Green I Master ;3)引物:正向引物 5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3，;反向引物5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；4)标准阳性模板:含有黑胸大蠊浓核病毒靶基因的pBluesript质粒组成。
3.权利要求1所述试剂盒的检测方法，步骤如下: A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量； B)提取病毒DNA:用商品化试剂盒或用常规DNA裂解液提取DNA ； C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含2 X SYBR Green 1 Master、引物和DEPC水的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测； 20μ? 的 PCR 反应体系含有成分如下:DEPC 水，8PL;2XSYBR Green I Master, ΙΟμ? ；IOmM正向引物，0.5μ? ;10mM反向引物，0.5μ? ;模板，WL ； 正向引物 5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’ ；反向引物 5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ； 反应循环程序为:95°C预变性5min，l个循环；95°C变性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40个循环后反应结束，得到反应产物； D)建立检测标准曲线，通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
4.权利要求1或2所述的荧光定量PCR试剂盒在蟑螂病毒杀蟑饵剂检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK103589807SQ201310614019
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】陈娇, 尹宜农 申请人:武汉武大绿洲生物技术有限公司