用于调节载脂蛋白(a)表达的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本文公开用于减少apo(a)以治疗、预防或改善与apo(a)或Lp(a)相关的疾病、病症或病状的反义化合物和方法。与apo(a)或Lp(a)相关的某些疾病、病症或病状包括炎症性、心血管性和/或代谢性疾病、病症或病状。本文公开的反义化合物可用于治疗有需要的个体的此类疾病、病症或病状。
【专利说明】用于调节载脂蛋白（a)表达的方法和组合物
[0001] 序列表
[0002] 本申请连同序列表以电子格式一同提交。序列表以2013年5月22日建立的大小 为约396Kb的题为BI0L0177W0SEQ.txt的文档来提供。电子格式的序列表中的信息以引用 的方式整体并入本文。
【技术领域】
[0003] 本文所描述的实施方案提供用于减少动物的载脂蛋白（a)mRNA和蛋白质的表达 的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物以及组合物适用于治疗、预防或改善心血管和 /或代谢疾病、病症或病状。
[0004] 背景
[0005] 脂蛋白是球状、胶束样颗粒，其由蛋白质、磷脂和胆固醇的两亲性涂层环绕的酰基 甘油和胆固醇酯的非极性芯组成。脂蛋白已基于功能和物理性质而分类为五种类别：乳糜 微粒、极低密度脂蛋白（VLDL)、中间密度脂蛋白（IDL)、低密度脂蛋白（LDL)和高密度脂蛋 白（HDL)。乳糜微粒将膳食脂肪从肠道运输至组织。VLDUIDL和LDL都将三酰甘油和胆固 醇从肝脏运输至组织。HDL将内源性胆固醇从组织运输至肝脏
[0006] 脂蛋白颗粒经历连续代谢处理并且具有可变的性质和组成。脂蛋白密度不随着增 加粒径而增加，因为它们的外涂层的密度小于内芯的密度。脂蛋白的蛋白组分被称为载脂 蛋白。至少9种载脂蛋白以显著量分布于各种人脂蛋白中。
[0007] 脂蛋白（a)[Lp(a)]颗粒在近50年前被识别，并且由非常独特的LDL颗粒组成， 其中一种载脂蛋白B(apoB)蛋白质通过二硫键连接到单一载脂蛋白（a)[apo(a)]蛋白 质。apo(a)蛋白与尤其在圈形区IV2型重复结构域内的纤溶酶原具有高度同源性。循环 Lp(a)的水平与分子中存在的圈形区IV2型可变重复序列的数量成反比，因为两种等位基 因共表达于个体中，可以显示杂合血楽同种型概况（Kraft等人，EurJHumGenet, 1996; 4(2) :74-87)。据认为，apo(a)中的此圈形区重复结构域可以负责其促血栓形成和抗纤维 蛋白溶解性质，从而可能增强动脉粥样硬化进展。
[0008]Apo(a)由IL-6来转录调节，并且在用IL-6抑制剂（托珠单抗）治疗的类风湿关节 炎患者的研究中，血浆水平在3个月的治疗后降低了 30% (Schultz等人，PLoSOne2010; 5:el4328)。
[0009]Apo(a)已被证明优先结合氧化的磷脂，并且增强了血管炎症（Bergmark等人，J LipidRes2008 ;49:2230 - 2239;Tsimikas等人，Circulation.2009;119(13):1711-1719)。
[0010] 此外，研究表明，Lp(a)颗粒还可以刺激血管内皮通透性、诱导纤溶酶原激活物抑 制剂1型的表达并且激活巨噬细胞白介素 _8分泌（KoschinskyandMarcovina,CurrOpin Lipidol2004;15:167 - 174)。重要的是，最近的遗传关联研究发现，Lp(a)是心肌梗死、中 风、周围血管疾病和腹主动脉瘤的独立危险因素（Rifai等人，ClinChem2004 ;50:1364 -71;Erqou等人，JAMA2009 ;302:412 - 23;Kamstrup等人，Circulation2008 ; 117:176 - 84)。另外，在最近的早发冠状动脉疾病（PROCA畑IS)的研究中，Clarke等人（Clarke等 人，肥JM (2009) 361 ;2518-2528)描述冠状动脉也脏疾病与血浆Lp (a)浓度之间的强大和独 立的关联。此外，Sol化izzi等人提出增加的血清Lp(a)可能与阿尔茨海默氏病（AD)的危 险增加相关（Solfrizzi 等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002,72:732-736。目前， 在临床环境中，用于治疗也血管疾病的间接apo(a)抑制剂的实例包括阿司匹林、缓释烟酸 (Niaspan)、米泊美生（Mipomersen)、安塞曲匹（Anacetrapib)、伊罗替罗巧pirotirome)和 洛美他派江〇111^3口1(16)，其分别降低血浆14)(3)水平18%、39%、32%、36%、43%和17%。 此外，Lp (a)单采已用于临床中，W减少含有apo (a)的Lp (a)颗粒。
[0011] 迄今为止，通过直接祀向apo(a)水平来治疗也血管疾病的治疗策略还很有 限。已经开发核酶核巧酸（美国专利5, 877, 022)和反义寡核巧酸（WO 2005/000201 ;W0 2003/014397;美国专利 8, 138, 328 ;Merki 等人，J Am Coll Cardiol 2011 ;57:1611-1621)，但是没有直接祀向apo (a)的化合物目前在临床中使用。
[0012] 因此，仍然存在对于新药的明显的未满足的医疗需求，该些新药可W有效地并 且选择性地降低由于血浆Lp(a)水平长期升高而使得也血管事件的危险增加的患者的 apo (a)水平。
【发明内容】
[0013] 本文提供用于调节apo (a)mRNA和蛋白质的表达的组合物和方法。在某些实施方 案中，apo (a)特异性抑制剂降低了 apo (a)mRNA和蛋白质的表达。
[0014] 在某些实施方案中，所述组合物是apo(a)特异性抑制剂。在某些实施方案中， apo(a)特异性抑制剂是核酸、蛋白质或小分子。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂 是祀向apo(a)的反义寡核巧酸。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是修饰的寡核 巧酸，其由12至30个连接核巧组成并且包括核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO: 1的核碱基3901至3920的等长部分互补的至少8个连续核碱基部分，其中所述修饰的 寡核巧酸的核碱基序列与SEQ ID NO: 1至少80%互补。在某些实施方案中，apo(a)特异性 抑制剂是修饰的寡核巧酸，其由12至30个连接核巧组成并且具有核碱基序列，所述核碱基 序列包含SEQ ID NO: 1-130、133、134的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少 11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至 少19个或20个连续核碱基。在某些实施方案中，apo (a)特异性抑制剂是修饰的寡核巧酸， 其由20个连接核巧组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含任何SEQ ID NO:58的 至少8个连续核碱基，其中所述修饰的寡核巧酸包含；(a)间隔段，其由10个连接的脱氧核 巧组成；化)5'翼段，其由5个连接的核巧组成；(C) 3'翼段，其由5个连接的核巧组成；并 且其中间隔段位于5'翼段与3'翼段之间，其中各翼段的各核巧包含2'-0-甲氧基己基糖， 其中各核巧间键为硫代磯酸醋键且其中各胞嚼巧残基为5-甲基胞嚼巧。
[0015] 某些实施方案提供了包含本文所述的化合物，或其盐，W及药学上可接受的载体 或稀释剂的组合物。
[0016] 在某些实施方案中，apo(a)表达的调节在细胞或组织中发生。在某些实施方案中， 调节在动物的细胞或组织中发生。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，调节 是apo(a)mRNA水平的降低。在某些实施方案中，调节是apo(a)蛋白质水平的降低。在某 些实施方案中，ap〇(a)mRNA和蛋白质水平都降低。所述降低可W时间依赖性方式或W剂量 依赖性方式发生。
[0017] 某些实施方案提供用于治疗的组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、 延缓、减缓进展和/或改善与apo (a)相关疾病、病症和病状的组合物和方法。某些实施方 案提供用于预防、治疗、延缓、减缓进展和/或改善与Lp (a)相关疾病、病症和病状的组合物 和方法。在某些实施方案中，所述疾病、病症和病状是炎症、也血管和/或代谢性疾病、病症 和病状。在某些实施方案中，用于治疗的组合物和方法包括向有需要的个体施用apo(a)特 异性抑制剂。在某些实施方案中，apo(a)特异性抑制剂是核酸。在某些实施方案中，所述 核酸是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为修饰的寡核巧酸。
[001引详述
[0019] 应理解，W上概述和W下详述都仅为示例性和解释性的，并且不限制要求保护的 本发明。在本文中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。除非另外说明，否则 本文所用的"或"的使用意谓"和/或"。除非另外说明，否则本文所用的"和"的使用意谓 "和/或"。此外，术语"包括（including)" W及其它形式，如"包括（includes)"及"包括 (included)"的使用不具限制性。并且，除非另外特别说明，否则如"元件"或"组件"的术 语涵盖包括一个单位的元件和组件W及包括超过一个亚单位的元件和组件。
[0020] 本文所用的章节标题仅出于组织目的且不应解释为限制所述标的物。本公开中引 用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、公开的专利申请、文章、书籍、论 文和GENBANK登录号和可通过数据库如国家生物技术信息中也（NCBI)获得的相关序列信 息和在本公开通篇所涉及的其它数据针对本文中所论述的文件部分W及其全部内容W引 用的方式在此明确并入。
[00川定义
[0022] 除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物 化学所用的命名及本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的工序及技术为 本领域中熟知且常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。
[0023] 除非另外指示，否则W下术语具有W下含义：
[0024] "2' -0-甲氧基己基"（又为2' -M0E、M犯、2' -〇(邸2)2-〇邸3和2' -0-(2-甲氧基己 基））是指巧喃糖环的2'位上的0-甲氧基-己基修饰。2'-0-甲氧基己基修饰的糖为修饰 的糖。
[00巧]"2' -脱氧核糖核巧"是指包含2' -H巧喃糖部分的核巧，如在天然存在的脱氧核糖 核巧值NA)中发现。
[002引"2' -M犯核巧"（又为2' -0-甲氧基己基核巧）意谓包含2' -M犯修饰的糖部分的 核巧。"2' -0-甲氧基己基核巧酸"意谓包含2' -0-甲氧基己基修饰的糖部分的核巧酸。
[0027] "3' -氣-HNA"(也称为"F-HNA"或"3' -F-HNA")意谓具有W下结构的核巧的糖部 分：
[0028]
【权利要求】
1. 一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷组 成并且包括核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO: 1的核碱基3901至3920的等 长部分互补的至少8个连续核碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO: 1至少80%互补。
2. 如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由15至30个、18至24个、 19至22个、13至25个、14至25个、15至25个、16或20个连接核苷组成。
3. 如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含核碱基序列，所述核碱 基序列包含与SEQ ID NO: 1的等长部分互补的至少10个、至少12个、至少14个、至少16 个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的部分。
4. 一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷组 成并且包括核碱基序列，所述核碱基序列包含与SEQ ID NO: 1的核碱基3900至3923的等 长部分互补的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少15个或至少16个连续核 碱基的部分，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO: 1至少80%互补。
5. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与 SEQ ID NO: 1至少85%、至少90%、至少95%或100%互补。
6. -种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷组 成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:58的核碱基序列的至少8个、至 少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、 至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
7. -种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷 组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO: 12-130、133、134的任何核碱基 序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少 15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
8. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链的。
9. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷间键是修饰的核苷间 键。
10. 如权利要求9所述的化合物，其中每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
11. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个 修饰的糖。
12. 如权利要求11所述的化合物，其中至少一个修饰的糖是双环糖。
13. 如权利要求11所述的化合物，其中至少一个修饰的糖包含2'-0-甲氧基乙基、限制 性乙基、3' -氟-HNA或4' _(CH2)n-〇-2'桥，其中η为1或2。
14. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
15. 如权利要求14所述的化合物，其中所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
16. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由12-30个连 接核苷组成，并且包括： 间隔段，其由连接的脱氧核苷组成； 5'翼段，其由连接的核苷组成； 3'翼段，其由连接的核苷组成； 其中所述间隔段位于所述5'翼段与所述3'翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷都 包含修饰的糖。
17. 如权利要求16所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成并 且包括： 间隔段，其由10个连接的脱氧核苷组成； 5'翼段，其由5个连接的核苷组成； 3'翼段，其由5个连接的核苷组成； 其中所述间隔段位于所述5'翼段与所述3'翼段之间，其中各翼段的各核苷包含 2'-0-甲氧基乙基糖，其中各核苷间键为硫代磷酸酯键并且其中各胞嘧啶残基为5-甲基胞 嘧啶。
18. 如权利要求16所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
19. 一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由20个连接核苷组成 并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与任何SEQ ID N0:58的等长部分互补的至少8 个连续核碱基，其中所述修饰的寡核苷酸包含： 间隔段，其由10个连接的脱氧核苷组成； 5'翼段，其由5个连接的核苷组成； 3'翼段，其由5个连接的核苷组成； 其中所述间隔段位于所述5'翼段与所述3'翼段之间，其中各翼段的各核苷包含 2'-0-甲氧基乙基糖，其中各核苷间键为硫代磷酸酯键并且其中各胞嘧啶残基为5-甲基胞 嘧啶。
20. -种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其盐，以及药学上 可接受的载体或稀释剂。
21. -种包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物的组合物，其用于治疗。
22. 如权利要求21所述的化合物，其用于治疗、预防与apo (a)升高和/或Lp (a)升高 相关的疾病或延缓其进展。
23. 如权利要求21所述的化合物，其中所述疾病是炎症性、心血管或代谢性疾病、病症 或病状。
【文档编号】C12P19/34GK104302654SQ201380025618
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2012年5月24日
【发明者】罗桑尼·M·克鲁克, 马克·J·格雷厄姆, S·M·弗赖尔 申请人:Isis制药公司