干细胞微粒的制作方法

干细胞微粒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及干细胞微粒、其用途和产生，具体来说是神经干细胞微粒和其在疗法中的用途。所述干细胞微粒典型地是一种外来体或微泡并且可以来源于神经干细胞系。所述神经干细胞系可以是一种条件永生化干细胞系，例如CTX0E03(以登记No.04091601保藏于ECACC)。
【专利说明】干细胞微粒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞微粒、其用途和产生，具体来说是神经干细胞微粒和其在疗法 中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 干细胞具有自我更新和分化成功能上不同的细胞类型的能力。其有潜力成为 不断发展的再生医学领域、尤其是需要组织替换、再生或修复的再生疗法中的有效工具 (Banerjee等人2011)。然而，在疗法中使用干细胞存在缺点：需要具有功能和表型稳定性 的干细胞的一致和大量供应以及由细胞产生、贮存、运输和处理所引起的相关高成本和时 间延迟；对避免接受者排斥干细胞的免疫学相容性具有一定要求；和存在与肿瘤或异位组 织形成的潜在安全风险有关的复杂调节问题。此外，尽管干细胞移植具有治疗功效，但没有 令人信服的证据证明所移植干细胞的直接长期作用（例如通过移植和分化成修复和替换 细胞）。
[0004] 神经干细胞（NSC)是产生神经元、星形细胞和少突胶质细胞的具有自我更新能力 的多能干细胞（Kornblum，2007)。已有大量文件证明神经干细胞的医疗潜力。受损中枢 神经系统（CNS)组织具有极有限的再生能力以使得神经功能的损失经常是慢性和进行性 的。神经干细胞（NSC)已显示了在神经损伤或疾病的基于干细胞的疗法中有前途的结果 (Einstein等人2008)。已显不在将神经干细胞（NSC)植入中风后动物的脑中后在运动和 认知测试中有显著恢复（Stroemer等人2009)。还未完全了解NSC如何能够在受损组织 中恢复功能，但现在逐渐认识到NSC具有多模式修复性质，包括位点适当性细胞分化、促血 管生成和神经营养活性以及免疫调节，从而通过天然免疫系统和其它宿主细胞促进组织修 复（Miljan和Sinden, 2009, Horie等人，2011)。很可能这些作用中有许多取决于从所植 入的神经干细胞到宿主环境的瞬时信号传导，例如当植入缺血性肌肉组织损伤中时NSC瞬 时表达指导并扩大天然促血管生成和调节免疫反应以促进治愈和修复的促炎症性标记物 (Hicks等人，未公布数据）。在慢性中风脑中，NSC也具有相当大的神经营养性作用。举 例来说，其促进具有宿主脑源性双皮质素抗体（doublecortin)阳性神经母细胞的中风损 坏的纹状体脑组织的再增殖（Hassani, 0' Reilly, Pearse, Stroemer 等人，PLoS One. 2012 ; 7(11))。
[0005] 此夕卜，根据在慢性中风动物模型中的大量NSC恢复作用，ReNeuron Limited(Surrey，UK)正在进行使用神经干细胞的临床试验，以检验使用其"CTX0E03"条 件永生化皮层源性神经干细胞对残疾中风患者的治疗（Clinicaltrials. gov标识符： NCT01151124)。
[0006] 间质干细胞（MSC)是谱系限制性干细胞，其仅具有分化成间质细胞类型（即脂肪 细胞、软骨细胞和骨细胞谱系）的潜力（Pittenger等人1999 ;Ding等人2011)。MSC(也被 称为间质基质细胞和间质祖细胞）来源于各种来源，包括骨髓、血液、脂肪和其它体细胞组 织。然而，MSC的治疗潜力更加指向应用其作为未分化细胞的促血管生成和免疫调节性质。 人类MSC的产生因这些细胞无法大量稳定扩增超过约15-20次群体倍增受到限制。
[0007] 间质干细胞条件培养基（MSC-CM)具有类似于MSC自身的治疗功效，表明了基于 MSC的疗法的旁分泌机制（Timmers等人2007)。TO-A-2009/105044公开由MSC分泌的称 为外来体的粒子包含MSC的至少一种生物学性质并且提出在疗法中使用这些MSC粒子，而 Th6ry等人2011提供了对外来体和其它类似分泌囊泡的综述。尽管通过使用间质干细胞 源性外来体克服了直接使用干细胞作为治疗剂的一些缺点（例如贮存、运输和处理），但提 供功能上和表型上稳定的干细胞的一致且大量供应以产生外来体仍是个问题。对于治疗用 途，外来体优选地需要大规模地产生。在缺乏干细胞系的情况下，需要通过从干细胞来源重 复得到而补充细胞，其带来了用于测试和检验每一个新的批次的续生成本。此外，可以通过 MSC治疗的疾病和病症可能是有限的。
[0008] 仍需要改良的基于干细胞的疗法。 发明概要
[0009] 本发明是基于神经干细胞含有治疗上有用的微粒的惊人发现。
[0010] 还发现可以通过向培养基中添加组分、通过在低氧条件下培养干细胞或通过与其 它细胞类型共培养，从而提供改良的产生干细胞微粒的方法来改变干细胞的微粒产生。
[0011] 本发明的第一方面提供了一种神经干细胞微粒。该微粒可以是外来体、微泡、膜粒 子、膜泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来泡（exovesicle)。典型地，微粒 是外来体。微粒可以来源于已培养在允许干细胞分化的环境中的神经干细胞。微粒可以从 部分分化的神经干细胞分离。在一个实施方案中，允许干细胞分化的环境是多隔室生物反 应器，典型地其中细胞被培养超过七天。微粒可以来源于神经干细胞系。在一些实施方案 中，神经干细胞系可以是"CTX0E03"细胞系、"STR0C05"细胞系、"HPC0A07"细胞系或Miljan 等人Stem Cells Dev. 2009中公开的神经干细胞系。在一些实施方案中，微粒来源于在培 养时不需要维持血清的干细胞系。微粒可具有如通过电子显微镜术所测定的介于30nm和 IOOOnm之间或介于30nm和200nm之间或介于30nm和IOOnm之间的尺寸；和/或I. 1-1. 2g/ ml的蔗糖密度。微粒可包含RNA。RNA可以是mRNA、miRNA和/或任何其它小RNA。微粒可 包含 hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的一种、两种、三种或 四种。微粒可包含一种或多种脂质，典型地选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱。微粒可包含一种或多种四跨膜蛋白，典型地为⑶63、⑶81、⑶9、 CD53、CD82 和 / 或 CD37。微粒可包含 TSG101、Alix、CD109、thy-Ι 和 CD133 中的一种或多 种。微粒可包含表19或表21中所出现的蛋白质中的至少10种。微粒可包含神经干细胞 或神经干细胞条件培养基的至少一种生物活性。至少一种生物活性可以是组织再生活性。 本发明的微粒典型地经过分离或纯化。
[0012] 本发明的第二方面提供了一种用于疗法中的神经干细胞微粒。该疗法可以是需要 组织替换、再生或修复的再生疗法，例如其中该疗法需要血管生成、神经发生和/或神经保 护。疗法可以用于神经疾病、病症或缺损。疗法可以改善功能和/或认知恢复。疗法可以 是对中风、外周动脉疾病、神经病或需要组织再生、血管再生或局部消炎作用的任何其它疾 病或病症的疗法，这些疾病或病症包括：
[0013] (i)神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病（Parkinson's disease)、阿尔茨海默 氏病（Alzheimer's disease)、中风或 ALS ;
[0014] (ii)溶酶体贮积症；
[0015] (iii)心血管病症，例如心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃 疡、伤口愈合；
[0016] (iv)肺部疾病，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合症、慢性阻塞性肺病、特发性 肺动脉高血压、囊性纤维化和哮喘；
[0017] (V)新陈代谢或炎症性病症，例如糖尿病（I或II)、类风湿性关节炎、骨关节炎、狼 疮、克罗恩氏病（Crohn's disease)、炎症性肠病或移植物抗宿主病（Graft versus Host Disease)；
[0018] (vi)精神病症，例如抑郁症、躁郁症、精神分裂症或自闭症候群病症（例如自闭 症、亚斯伯格综合症（Asperger's syndrome)或瑞特综合症（Rett Syndrome));
[0019] (Vii)视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病（Stargardt disease)、糖尿病性视网膜病、色素性视网膜炎；和
[0020] (Viii)脱髓鞘疾病，例如多发性硬化症、大脑性麻痹、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、 横贯性脊髓炎、德维克病（Devic's disease)、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、白质脑 病、格巴二氏综合症（Guillain-Barre syndrome)、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯 氏症（Charcot-Marie-Tooth disease) 〇
[0021] 在一个实施方案中，微粒是外来体且疗法是对需要组织替换、再生或修复的疾病 或病症的疗法。在另一个实施方案中，微粒是微泡且疗法是对需要血管生成的疾病或神经 疾病、病症或缺损的疗法。
[0022] 疗法也可以是在随后、同时或同步接受微粒所来源的干细胞的宿主中诱导耐受 性、典型地为免疫耐受性的预防疗法。在施用干细胞疗法之前或同时向患者施用一次或多 次剂量的本发明的微粒可用于降低干细胞疗法的不利免疫反应（即"排斥"）的风险。
[0023] 本发明的第三方面提供了神经干细胞微粒在制造用于治疗疾病的药剂中的用途。
[0024] 本发明的第四方面提供了一种产生干细胞微粒、典型地为神经干细胞微粒的方 法。该方法可包括在允许干细胞分化的环境中培养干细胞并收集由这些细胞产生的微粒。 可以从部分分化的神经干细胞分离微粒。可以在允许有效除去新陈代谢废物的条件下培养 干细胞。在一个实施方案中，允许干细胞分化的环境是在多隔室生物反应器中培养，典型地 持续长时间（例如超过七天）。该方法可以包含从干细胞条件培养基分离微粒。干细胞条 件培养基可以包含一种或多种刺激干细胞将微粒释放到培养基中的添加剂组分或药剂。该 一种或多种组分可以选自转化生长因子(TGF-β)、干扰素 -Y (IFN-Y)和/或肿瘤坏 死因子-α (TNF-α)。可以从干细胞条件培养基分离微粒，其中在低氧条件下培养干细胞。 可以从干细胞条件培养基分离由与不同细胞类型、典型地为内皮细胞共培养的干细胞所产 生的微粒，以便形成NSC小生境环境。
[0025] 本发明的第五方面提供了一种通过根据本发明的第四方面的方法可获得的微粒。
[0026] 本发明的第六方面提供了一种组合物，其包含神经干细胞微粒和药学上可接受的 赋形剂、载剂或稀释剂。
[0027] 本发明的第七方面提供了一种筛选改变干细胞的微粒产生的药剂的方法，其包括 使干细胞与候选药剂接触并观察所接触的干细胞的微粒产率与对照相比是增加还是降低。
[0028] 本发明的第八方面提供了一种用于用以产生干细胞微粒的方法中的试剂盒，其包 含：(a)适于培养干细胞的培养基；(b)干细胞；（c)任选地本发明的第四方面的一种或多 种组分；（d)任选地适合用作对照的干细胞微粒；（e)任选地适于特异性检测所产生微粒的 检测剂；和（f)关于使用该试剂盒产生干细胞微粒的说明书。
[0029] 本发明的第九方面提供了 一种组合物，其包含hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、 hsa-miR-4488和hsa-miR-4532中的两种、三种或全部四种。这种组合物任选地是药物组合 物，其包含药学上可接受的载剂、稀释剂、媒剂和/或赋形剂。该药物组合物适合用于疗法 中，典型地用于与如上文所述的本发明的微粒相同的疗法中。
[0030] 附图简述
[0031] 图1描绘了产生微粒的CTX0E03条件永生化神经干细胞的电子显微图。图A-E 示出了含有直径介于30nm和50nm之间的外来体的细胞内多泡体（multivesicular body; MVB)且图F示出了通过在细胞膜处出芽的方法由神经干细胞释放的直径>100nm的微泡。
[0032] 图2是用于鉴别、表征微粒和由干细胞产生微粒的方案概述。
[0033] 图3示出了对CTX0E03条件和非条件培养基进行的人类血管生成ELISA条光学密 度读数。
[0034] 图4A示出了与正常培养条件（3天T175)相比从15ml含有由Integra系统纯化 的微粒的培养基提取的蛋白质的量（通过BCA分析测量）。图4B示出了（i)Integra培养 的CTX0E03外来体（上左图）和微泡（上右图）中的⑶63和（ii) Integra培养的CTX0E03 外来体（下左图）和微泡（下右图）中的⑶81的FACS检测（以2ug/ml，1:250)。
[0035] 图5示出了与正常培养条件（3天T175)相比从15ml含有通过从Integra系统过 滤而纯化的微粒的培养基提取的在260/280nm下测量的分离的总RNA的量。
[0036] 图6A示出了伤口闭合/划痕分析的结果，其表示在CTX0E03条件培养基中培养 或在添加经纯化的CTX0E03外来体后的正常人类皮肤纤维母细胞（NHDF)的迁移活性。图 6B示出了 72小时后的划痕分析的结果，比较10 μ g CTX0E03外来体与基础条件（无外来 体）的作用。图6Ctj^出了基础条件、2yg/ml外来体、6yg/ml外来体、20yg/ml外来体 和LSGS (低血清生长补充剂）阳性对照的愈合区域％。图6C的上图示出了从在Integra Celline系统中培养2周的CTX0E03细胞分离的外来体且图6C的下图示出了从在Integra Celline系统中培养6周的CTX0E03细胞分离的外来体。图6D在体内注射伤口愈合分析中 将CTX0E03细胞与阴性对照（生理盐水）进行了比较。
[0037] 图7示出了在3周时间点从标准CTX0E03 (T175)培养物相对于Integra CELLine 系统获得的每个培养基的经纯化外来体的数量。
[0038] 图8A示出了从CTX0E03Integra CELLine培养系统的两个不同烧瓶在1周、2周 和3周后所收获的外来体的浓度。图8B示出了在CTX0E03细胞的6周连续培养期间从单 个Integra CELLine烧瓶收获的外来体的浓度。
[0039] 图9示出了与标准（"对照"）CTX0E03(T175)培养物相比在Integra CELLine系 统中培养3周的CTX0E03细胞中所测量的多种mRNA标记物的表达水平的变化倍数。
[0040] 图10示出了从在Integra生物反应器培养物中培养3周的CTX0E03细胞获得的 外来体和从标准CTX0E03(T175)培养物获得的微粒中多种miRNA的上调和下调倍数，其是 针对标准（T175)培养物中的CTX0E03细胞中的基线表达水平而进行评估。
[0041] 图11描绘了由来自在标准（T175)条件下培养的CTX0E03细胞（"CTX"）、微泡 ("1^"）和外来体（1乂0"）的11^1?嫩的深度测序的获得的1^1?嫩谱。图11&和1113示出 了两种培养物的结果。
[0042] 图12示出了 hNSC微泡对HUVEC的血管生成的作用。图12A是照片，示出了与基 本HUVEC相比添加微泡时（右图）所观察到的管形成的显著增加。图12B和12C示出了在 多种浓度（〇. 05 μ g、0. 1 μ g、0. 3 μ g-图12B ;和0. 6 μ g/ml-图12C)下由hNSC微泡提供的 总管长的增加。
[0043] 图13示出了 hNSC微泡对PC-12细胞中的轴突长出的作用。
[0044] 图14是电泳图，示出了如通过Agilent RNA生物分析器所测定的CTX0E03细胞、 外来体和微泡中的总RNA含量谱。
[0045] 图15是完全覆盖外显子的编码基因和位于内含子或基因间序列中的非编码转录 物的百分比的示意图（通过针对GENC0DE序列数据集运行NGS BAM文件而产生）。
[0046] 图16描绘了与CTX0E03产生者细胞相比外来体和MV中的热门优先穿梭的新颖 miRNA。
[0047] 图17示出了试图测定在Integra CELLine系统中培养1、2、3、4、5和6周的 CTX0E03外来体（图17A)和微泡（图17B)的粒径和浓度的NanoSight分析结果。
[0048] 图18示出了比较来自CTX0E03外来体和微泡的蛋白质组数据（18A和18B)和将 神经干细胞外来体与间质干细胞外来体进行比较（18C和18D)的文氏图（Venn diagram)。 图18A说明了从第2周Integra培养系统分离的CTX0E03外来体和微泡内的独特蛋白质 数目。图18B比较了与CTX0E03外来体和微泡内所鉴别的蛋白质相关的生物过程。图18C 将CTX0E03神经干细胞外来体蛋白质组与间质干细胞外来体蛋白质组进行了比较，并且图 18D比较了与MSC源性外来体与神经干细胞源性外来体中所鉴别的蛋白质相关的生物过 程。
[0049] 图19示出了发现与NSC源性外来体和非间质干细胞外来体相关的30种生物过 程。
[0050] 发明详述
[0051] 本
【发明者】已惊人地鉴别出神经干细胞中的微粒。这些微粒保留其所来源的神经干 细胞的一些功能并且典型地在治疗上适用于与神经干细胞相同的治疗。微粒优于相应干细 胞，因为其较小并且较不复杂，从而更易产生、维持、贮存和运输，并且具有避免与干细胞相 关的一些调节问题的潜力。微粒可以通过从条件培养基分离而连续产生，例如在例如多隔 室生物反应器的生物反应器中，其允许大规模生产和提供"现成"疗法。该多隔室生物反应 器典型地是两隔室生物反应器。
[0052] 另外发现，令人惊讶的是，在允许干细胞开始分化的环境中培养干细胞（任何类 型，不限于神经干细胞）显著增加所产生微粒的产量。
[0053]
【发明者】已意外地观察到，在多隔室生物反应器中培养干细胞（任何类型，不限于 神经干细胞）导致干细胞部分分化成更加分化形式的干细胞。培养中的这种分化不需要添 加诱导分化的药剂。这种分化典型地需要至少一周、至少两周或至少三周的培养期。通过所 培养的干细胞产生的微粒反映在多隔室生物反应器中孵育时所出现的干细胞变化。因此， 通过在多隔室生物反应器中培养干细胞，可以诱导细胞分化。因此，来自部分分化的干细胞 的微粒可以通过从在多隔室生物反应器中培养典型地至少一周、至少两周、至少三周、至少 四周、至少五周或至少六周的干细胞收获微粒而产生。任选地，NSC已经培养了至多十周。 在一个实施方案中，本发明提供了一种通过从部分分化的神经干细胞分离微粒来产生微粒 的方法。
[0054]
【发明者】还发现可以诱导微粒从干细胞分泌。也不限于神经干细胞并且可以用于从 任何干细胞产生微粒的这一发现允许从干细胞培养获得改良的微粒产量。已经鉴别出在不 同程度上增强微粒分泌的若干种药剂，其具有能够控制分泌的微粒的量的其它优点。在低 氧条件下培养干细胞也会改良微粒产生。此外，已经发现将干细胞与不同细胞类型、尤其是 内皮细胞类型共培养可以有利地改变由干细胞产生的微粒。
[0055] 在另一个实施方案中，本发明提供了由无血清干细胞产生的微粒、典型地为外来 体。血清是成功培养许多细胞系所需的，但其含有许多污染物，包括其自身外来体。如下文 所述，
【发明者】已经从成功培养不需要血清的干细胞产生微粒。
[0056] 神经干细朐微粒
[0057] 在一个方面，本发明提供了从神经干细胞可获得的微粒。神经干细胞微粒是一种 由神经干细胞产生的微粒。典型地，微粒由神经干细胞分泌。更加典型地，微粒是外来体或 微泡。来自其它细胞（例如间质干细胞）的微粒在本领域中是已知的。
[0058] "微粒"是由细胞释放的直径为30nm到IOOOnm的细胞外囊泡。其受到包围生物分 子的脂质双分子层限制。术语"微粒"在本领域中是已知的并且涵盖许多不同种类的微粒， 包括膜粒子、膜泡、微泡、外来体样囊泡、外来体、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来泡。不同 类型的微粒是基于直径、亚细胞起源、其蔗糖密度、形状、沉降速率、脂质组合物、蛋白质标 记物和分泌方式（即根据信号（诱导性）或自发（组成性））来进行区分。四种常见微粒 和其区分特点描述于下表1中。
[0059] 表1 :多种微粒
[0060]

【权利要求】
1. 一种神经干细胞微粒。
2. 根据权利要求1所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒是外来体、微泡、膜粒子、膜 泡、夕卜来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外来泡（exovesicle)。
3. 根据权利要求1或2所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒来源于神经干细胞系。
4. 根据权利要求3所述的神经干细胞微粒，其中所述神经干细胞系是条件永生化的和 /或在无血清培养基生长中。
5. 根据权利要求4所述的神经干细胞微粒，其中所述神经干细胞系是具有ECACC登 记 No. 04091601 的 CTX0E03、具有 ECACC 登记 No. 04110301 的 STR0C05 和具有 ECACC 登记 No.04092302 的 HPC0A07。
6. 根据任一前述任何权利要求所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒具有： (a) 如通过电子显微镜术所测定的介于30nM和IOOOnM之间或介于30nM和200nM之间 或介于30nM和IOOnM之间的尺寸；或 (b) l. l-1.2g/ml的蔗糖密度。
7. 根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒，其包含RNA。
8. 根据权利要求7所述的神经干细胞微粒，其中所述RNA是mRNA和/或miRNA。
9. 根据权利要求8所述的神经干细胞微粒，其中所述微粒包含hsa-miR-1246、 hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的一种、两种、三种或四种。
10. 根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒，其包含以下一种或多种： (a) 脂质，选自神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或磷脂酰胆 碱； (b) miRNA,任选地选自 hsa_let_7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、 hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129_5p、hsa_miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、 hsa-miR-155、hsa_miR-15a、hsa_miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、 hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa_miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、 hsa_miR-20a、hsa_miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa_miR-301a、hsa_miR-302a、 hsa_miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、 hsa-miR-93、hsa_miR-96 和 hsa_miR-99a ; (c) 四跨膜蛋白，任选地选自⑶63、⑶81、⑶9、⑶53、⑶82和/或⑶37 ; (d) TSG101、Alix、CD109 和 / 或 thy-Ι ;和 / 或 (e) CD133。
11. 根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒，其包含表19或表21中所出现的蛋 白质中的至少10种。
12. 根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒，其包含神经干细胞或神经干细胞 条件培养基的至少一种生物活性。
13. 根据权利要求12所述的神经干细胞微粒，其中所述至少一种生物活性是再生活 性。
14. 根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒，其用于疗法中。
15. 根据权利要求14所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是再生疗法。
16. 根据权利要求14或15所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是用于 (i) 神经病症、疾病或缺损，例如帕金森氏病（Parkinson's)、阿尔茨海默氏病 (Alzheimer，s)、中风或 ALS ; (ii) 溶酶体贮积症； (iii) 心血管病症，例如心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周动脉疾病、糖尿病性溃疡、伤 口愈合； (iv) 肺病，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合症、慢性阻塞性肺病、特发性肺动脉高 血压、囊性纤维化和哮喘； (V)新陈代谢或炎症性病症，例如糖尿病（I或Π )、类风湿性关节炎、骨关节炎、狼疮、 克罗恩氏病（Crohn's disease)、肠易激综合症或移植物抗宿主病； (vi) 精神病症，例如：抑郁症、躁郁症、精神分裂症或自闭综合症病症（Autistic syndrome disorder)(例如自闭症、亚斯伯格综合症（Asperger's syndrome)或瑞特综合症 (Rett Syndrome))； (vii) 视网膜致盲疾病，例如年龄相关黄斑变性、斯塔加特病（Stargardt disease)、糖 尿病性视网膜病或色素性视网膜炎；和 (viii) 脱髓鞘病，例如多发性硬化症、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、 德维克病（Devic's disease)、进行性多灶性白质脑病、视神经炎、白质脑病、格巴二 氏综合症（Gui I Iain-Barre syndrome)、抗MAG周围神经病和恰克-马利-杜斯氏症 (Charcot-Marie-Tooth disease)〇
17. 根据权利要求14到16所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法改善功能和/或认知 恢复。
18. 根据权利要求14到17所述的神经干细胞微粒，其中所述疗法是对中风、外周动脉 疾病或视网膜致盲疾病的疗法。
19. 根据权利要求14到17所述的神经干细胞微粒，其中： (i) 所述微粒是外来体且疗法是对需要组织替换、再生或修复的疾病或病状的疗法； 或 (ii) 所述微粒是微泡且所述疗法是对需要血管生成的疾病或神经疾病、病症或缺损的 疗法。
20. -种根据任一前述权利要求所述的神经干细胞微粒在制造用于治疗疾病的药剂中 的用途。
21. -种产生根据权利要求1到13所述的神经干细胞微粒的方法，其包括从神经干细 胞条件培养基分离微粒。
22. -种产生干细胞微粒的方法，其包括从干细胞条件培养基分离微粒，其中： (i) 所述干细胞条件培养基包含一种或多种组分，其诱导通过所述干细胞将微粒释放 到所述培养基中； (ii) 在低氧条件下培养所述干细胞； (iii) 将所述干细胞与不同细胞类型共培养； (iv) 在多隔室生物反应器中培养所述干细胞；和/或 (V)使所述干细胞部分分化。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述干细胞是任选地根据权利要求3到5中任 一项所述的神经干细胞。
24. 根据权利要求22 (i)或从属于权利要求22 (i)时的权利要求23所述的方法，其中 所述一种或多种组分选自：转化生长因子-β (TGF-β)、干扰素 -Y (INF-γ)和肿瘤坏死因 子-a (TNF- α )。
25. 根据权利要求22 (iii)、从属于权利要求22 (iii)时的权利要求23或24所述的方 法，其中所述不同细胞类型是内皮细胞。
26. -种通过根据权利要求22到25中任一项所述的方法可获得的微粒。
27. -种组合物，其包含根据任何权利要求1到13或26中任一项所述的微粒和药学上 可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。
28. -种用于用以产生根据权利要求1到13或26中任一项所述的微粒的方法中的试 剂盒，其包含：(a)培养基；(b)神经干细胞；（c)任选地根据权利要求22到24所述的一种 或多种组分；（d)任选地适合用作对照的根据权利要求1到13或26中任一项所述的微粒； (e)任选地适于特异性检测所产生微粒的检测剂；和⑴使用所述试剂盒产生根据权利要 求1到13或26中任一项所述的微粒的说明书。
29. -种筛选改变干细胞的微粒产率的药剂的方法，其包括使干细胞与候选药剂接触 并观察所接触的干细胞的微粒产率与对照相比是增加还是减少。
30. -种组合物，其包含 hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488 和 hsa-miR-4532 中的两种、三种或全部四种。
31. 根据权利要求30所述的组合物，其为包含药学上可接受的载剂、稀释剂、媒剂和/ 或赋形剂的药物组合物。
32. 根据权利要求30或31所述的组合物，其用于疗法中。
33. 根据权利要求32所述的用于疗法中的组合物，其中所述疗法如权利要求16所述。
【文档编号】C12N5/0797GK104321062SQ201380025532
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2012年4月3日
【发明者】约翰·辛登, 拉腊·斯泰瓦纳托, 伦道夫·考特林 申请人:兰诺龙有限公司