用于制备酶固定珠的设备和使用其制备酶固定珠的方法
【专利摘要】本发明涉及用于制备用于塔格糖的制备的酶固定珠的设备，以及使用所述设备制备酶固定珠的方法。更具体来说，本发明涉及用于制备酶固定珠的设备，所述设备包括喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到1mm的内径并具有圆柱形下端且包括形成于所述下端处的切割型液体出口(垂直于所述喷嘴的垂直轴而切割)，并涉及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
【专利说明】用于制备酶固定珠的设备和使用其制备酶固定珠的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于制备用于塔格糖(tagatose)的制备的酶固定珠(enzyme-1mmobilized bead)的设备，以及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
[0002]更特定来说，本发明涉及用于制备酶固定珠的设备，所述设备包含喷嘴(nozzle)，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且包含形成于其下端处的切割型液体出口(cut-type liquid outlet)(垂直于喷嘴的垂直轴而切割)，并涉及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
【背景技术】
[0003]塔格糖，一种半乳糖(galactose)的异构体(isomer),是天然产生的低卡路里甜味料(sweetener)。虽然塔格糖展现类似于糖的甜度，即，糖的大约92%甜度，但塔格糖是作为糖的替代而受关注，因为塔格糖仅具有糖的大约38%的卡路里以及糖的大约4%的血糖指数(glycemic index, GI)。
[0004]而且,塔格糖被食品与药物管理局(Food and Drug Administrat1n, FDA)认可为普遍认为安全(Generally Recognized As Safe, GRAS),且因此被准许用作用于食品、饮料、健康食品、饮食添加剂和类似物，且已知在由人类摄入时几乎没有副作用，且因此预期广泛使用。
[0005]用于制造塔格糖的方法包含其中将化学催化剂(catalyst)用于异构化半乳糖的化学方法，以及其中使用异构酶(isomerase)来异构化半乳糖的生物方法。虽然化学方法具有经济效率和产量方面的优点，但存在的问题在于化学方法需要高温和高压下的化学工艺，具有复杂的工艺，且造成工业废品(industrial waste)。因此,越来越需要生物方法。
[0006]在与使用异构酶大量生产塔格糖的技术相关的现有技术中，韩国专利10-0872694揭示了使用阿拉伯糖(arabinose)异构酶大量生产塔格糖的方法,且韩国专利10-0464061揭示了其中将异构酶固定到适当载体(carrier)，然而引入半乳糖，进而驱动异构化(isomerizat1n)成为塔格糖的方法。
[0007]然而，由于生物方法比化学方法对反应条件更敏感，因此当反应条件调整时，生物方法引起工艺效率、最终产量和类似物的较大差异。另外，当使用固定到载体的异构酶时，所制备载体的性质和固定程度根据用于固定的设备以及固定方法而变化，进而使得难以确定工艺效率、产量和类似物，且阻碍生物方法的有效使用。
[0008]因此，需要为了通过生物方法稳定地大量生产塔格糖而优化的用于制备酶固定珠的设备，以及用于将异构酶或能够产生异构酶的微生物细胞(microbial cell)有效地固定到载体的方法。
【发明内容】
[0009]【技术问题】
[0010]本发明的目的是提供用于制备用于塔格糖的制备的酶固定珠的设备，以及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
[0011]更特定来说，本发明旨在提供用于制备酶固定珠的设备，所述设备包含喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且包含形成于所述下端处的切割型液体出口(垂直于喷嘴的垂直轴而切割)。
[0012]本发明的另一目的是提供为通过酶固定珠的形状和大小的适当调整来进行异构化而优化的用于制备酶固定珠的方法。
[0013]【技术解决方案】
[0014]本发明涉及一种用于制备酶和/或能够产生酶的微生物细胞所固定到的珠的设备，以及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
[0015]根据本发明的一个方面，用于制备酶固定珠的设备包含:a)第一罐(tank)，其中注入含有含酶材料(enzyme-containing material)和赋形剂(excipient)的混合液体；b)喷嘴单元，安置于所述第一罐的下端且包括喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且在其下端处包含垂直于所述喷嘴的垂直轴切割的液体出口 ；以及c)第二罐，安置于所述喷嘴单元下方且含有氯化钙(calcium chloride)溶液。
[0016]所述第二罐中的所述氯化钙溶液的表面与所述喷嘴单元的所述液体出口之间的距离范围可为从0.1m到1.5m。
[0017]喷嘴单元可包含至少两个喷嘴。
[0018]第一罐可包含混合液体和/或空气入口。
[0019]根据本发明的另一方面，提供使用根据本发明的用于制备酶固定珠的设备制备酶固定珠的方法。
[0020]可将注入到所述第一罐中的所述混合液体调整到3，OOOcPs到7，OOOcPs的粘度，且可将0.lkg/cm2到3kg/cm2的压力施加于所述第一罐的所述空气入口。
[0021]由所述方法制备的酶固定珠可具有直径为0.5mm到3_的球形形状。
[0022]【有利效果】
[0023]根据本发明，由于用于制备酶固定珠的设备包含喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且包含形成于所述下端处的切割型液体出口(垂直于喷嘴的垂直轴而切割)，因此可制备具有均匀且光滑的球形形状以及均匀孔隙的酶固定珠。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是根据本发明的一个实施例的用于制备酶固定珠的设备的喷嘴的下端的示意性纵向截面图。
[0025]图2是根据本发明的一个实施例的用于制备酶固定珠的设备的示意图。
[0026]图3是绘示用于制备酶固定珠的工艺和设备的示意图。
[0027]图4是用于制备酶固定珠的典型设备的注射针的下端的示意性纵向截面图。
【具体实施方式】
[0028]下文中，将参考附图详细描述本发明的实施例。为了清楚，将省略所属领域的技术人员了解的细节的描述。
[0029]本发明涉及用于制备用于塔格糖的制备的酶固定珠的设备，以及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
[0030]更特定来说，本发明涉及用于制备酶固定珠的设备，所述设备包含喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且包含形成于所述下端处的切割型液体出口(垂直于喷嘴的垂直轴而切割)，并涉及使用所述设备制备酶固定珠的方法。
[0031]根据本发明的一个实施例，用于制备酶固定珠的设备包含:a)第一罐(tank)，其中注入含有含酶材料(enzyme-containing material)和赋形剂(excipient)的混合液体；b)喷嘴单元，安置于所述第一罐的下端且包含喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且在所述下端处包含垂直于所述喷嘴的垂直轴切割的液体出口 ；以及c)第二罐，安置于所述喷嘴单元下方且含有氯化钙(calcium chloride)溶液。
[0032]第一罐可包含可接纳所述含有含酶材料和赋形剂的混合液体，以及所述混合液体和/或空气可注入到所述罐中所经过的入口。
[0033]注入到所述第一罐中的混合液体含有含酶材料和赋形剂。
[0034]含酶材料本身指代异构酶，或含有能够产生异构酶的微生物细胞或死微生物细胞的材料，且异构酶指代将半乳糖酶异构化为塔格糖，且可为阿拉伯糖异构酶。
[0035]在一个实施例中，能够产生阿拉伯异构酶的微生物细胞可包含棒状杆菌属(genusCorynebacterium)的重组菌株(recombinant strain)。
[0036]棒状杆菌属的重组菌株可为包含对从新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)得到的阿拉伯糖异构酶进行译码的基因(gene)的重组，所述新阿波罗栖热袍菌是一种超嗜热菌(hyperthermophile)。
[0037]关于棒状杆菌属的重组菌株的细节参见韩国专利10-0872694。
[0038]在一些实施例中，赋形剂优选为藻酸盐(alginate)，更优选为其中藻酸盐溶解于二氧化硅溶液中的藻酸盐溶液。
[0039]根据本发明的实施例，喷嘴单元安置于第一罐的下端处。
[0040]喷嘴单元可包含至少一个喷嘴。
[0041]在一些实施例中，喷嘴单元的喷嘴具有圆柱形下端，其具有从0.1mm到1mm、优选从0.2mm到0.5mm、更优选从0.3mm到0.4mm的内径,且可包含形成于所述下端处的切割型液体出口。
[0042]液体出口意味着注入到第一罐中的混合液体排放通过的出口，且切割型液体出口意味着所述液体出口是通过在与喷嘴的垂直轴垂直的方向上切割喷嘴的下端而形成(见图1，图1为喷嘴的下端的纵向截面图)。
[0043]用于制备固定珠的典型设备包含注射针(inject1n needle)(见图4)且用以制备球粒型(pellet-type)珠,从而造成异构化效率恶化的问题。更具体来说，当使用球粒型珠执行异构化时，基质液体(matrix liquid)由于在添加时的不均勻孔隙(pore)而具有不均勻的移动负载因数(moving load factor),从而造成异构化效率的恶化。
[0044]相比之下，当使用在其下端包含切割型液体出口且具有0.1mm到Imm的内径的根据本发明的喷嘴时，均匀且平稳的球形珠得以制备且因此提供均匀的孔隙，进而基质液体也可具有均匀的移动负载因数，进而防止由于填充塔(filling tower)(在异构化中使用的设施，通过用酶固定珠填充所述设施，然后注入基质液体而使用)中的孔隙差异所致的酶的不成比例的使用。
[0045]根据本发明，第二罐包含可接纳氯化钙溶液的罐，以及从喷嘴单元排放的混合液体下落并注入其中的入口。
[0046]在一些实施例中，第二罐中的氯化钙溶液的表面与喷嘴单元的液体出口之间的距离优选范围是从0.1m到1.5m,更优选是从0.5m到0.8m。
[0047]在此范围内，由于可适当地调整第一罐的混合液体从喷嘴单元的下落距离，因此混合液体在下落时可形成为球形珠，且可防止混合液体由于在混合液体从过高处下落的情况下与氯化钙溶液的表面的碰撞而形成为椭圆形珠。
[0048]将参见图2更详细描述根据本发明的实施例的用于制备酶固定珠的设备。
[0049]在图2中，根据本发明的实施例的用于制备酶固定珠的设备包含第一罐(a)、第二罐(b)以及喷嘴单元(c)。
[0050]第一罐(a)包含安置于其上端处的混合液体和/或空气入口。第一罐(a)可包含可共同或单独使用的一或多个入口。
[0051]喷嘴单元(C)安置于第一罐(a)的下端处，且可包含安装于其中的至少一个喷嘴。
[0052]由于喷嘴在其上端(d)处具备混合液体入口，因此混合液体通过混合液体入口输入(I)到喷嘴中，同时空气注入(2)到第一罐(a)中。由于喷嘴具有圆柱形下端(e)且包含形成于其下端处的切割型液体出口，因此通过液体出口排放的固定珠可在下落(4)时以平稳且均匀的球形形状形成。
[0053]从喷嘴的下端的液体出口排放的固定珠下落(5)到第二罐(b)中含有的氯化钙溶液上，且喷嘴的下端(e)与第二罐(b)中的氯化钙溶液的表面之间的距离可在从0.5m到0.8m的范围中。
[0054]根据本发明的一个实施例，提供根据本发明的使用用于制备酶固定珠的设备制备酶固定珠的方法。
[0055]在酶固定珠的制备中，可如下制备注入到第一罐中的混合液体:杀死能够产生阿拉伯糖异构酶的微生物细胞，然后对微生物细胞的培养液(culture fluid)进行离心分离(centrifugat1n)以回收死微生物细胞。接着，在0.4%到1.0%二氧化娃溶液中通过在90±5°C下搅拌3小时或更久以使得藻酸盐可完全溶解于其中，来将藻酸盐溶解到1.5%到2.5%的浓度。在确定藻酸盐的完全溶解之后，通过使冷却水通过护套(jacket)将藻酸盐溶液冷却到35±5°C。执行此过程以增加藻酸盐的粘度，同时防止在微生物细胞/酶的混合时对酶的损害。
[0056]接着,使用搅拌器(stirrer)在30rpm到60rpm下使经分离微生物细胞与藻酸盐溶液混合。由于藻酸盐溶液的高粘度，因此当在搅拌时旋转速度变得过高时，发生如下现象:气泡在混合液体内产生且不上浮到液体的上侧，且由于所述气泡，在珠的制备期间空气流入珠，从而造成珠浮动到液体的上侧。因此，有利地将搅拌速度调整到30rpm到60rpm。
[0057]在酶固定珠的制备中，注入到第一罐中的混合液体可具有3，OOOcps到7，OOOcps的粘度。在此范围内，可制备均匀且平稳的球形珠。
[0058]在一些实施例中，在酶固定珠的制备中，当混合液体通过喷嘴排放时，通过第一罐的空气入口对其施加从0.lkg/cm2到3kg/cm2、优选从0.5kg/cm2到2kg/cm2、更优选从
0.7kg/cm2 到 1.7kg/cm2 的压力。
[0059]在此范围内，含酶材料和赋形剂的混合液体可以适当量通过喷嘴且因此形成为珠，且在混合液体通过喷嘴时可对混合液体施加适当力，进而可形成实质上球形珠。由于珠的形状较接近于球体，因此存在的优点在于，可获得酶有效地固定到的珠，且由于珠的增加的表面积而可有效地执行后续的异构化。
[0060]根据本发明，在酶固定珠的制备中，在含酶材料和赋形剂的混合液体下落到氯化钙溶液上之后，可进一步执行空气到氯化钙溶液中的注入，使得固定珠可维持球形形状。
[0061]由于存在的问题是下落到氯化钙溶液上的混合液体由于重力而被压为板形状，且被压为板形状的珠由于其减少的表面积而在异构化中具有低可用性，因此可将空气注入到氯化钙溶液中以维持珠的球形形状。
[0062]下文将简要描述根据本发明的使用用于制备酶固定珠的设备来制备塔格糖的方法。
[0063]I)将菌元微生物接种为种菌(seed)。
[0064]2)使通过种菌培养获得的微生物细胞经受初级发酵(primary fermentat1n)。
[0065]3)在初级发酵完成之后，执行二次发酵(secondary fermentat1n)。
[0066]4)在二次发酵完成之后,执行三次发酵(tertiary fermentat1n)。
[0067]5)在三次发酵完成之后，执行四次发酵(quaternary fermentat1n)。
[0068]6)在四次发酵完成之后，引入表面活性剂(surfactant)，然后进行加热以诱发微生物细胞死亡。
[0069]7)通过离心分离而隔离微生物细胞。
[0070]8)将回收的微生物细胞与藻酸盐和二氧化硅混合。
[0071]9)将混合液体引入到固定设备中以形成珠。
[0072]10)通过浸入半乳糖溶液来使珠稳定。
[0073]11)将珠转移到流化床反应器(fluidized bed reactor)以用珠填充反应器管柱。
[0074]12)将半乳糖溶液转移到流化床反应器以执行向塔格糖的转换。
[0075]在使用根据本发明的用于制备酶固定珠的设备制备塔格糖时，可制备高浓度和/或高纯度塔格糖。有利地，可制备在固体含量(solid content)方面具有99%或更高纯度的塔格糖。
[0076]下文中，将参考一些实例更详细阐释本发明。然而应了解，这些实例仅是为了说明而提供，且不应以任何方式解释为限制本发明。
[0077]实例I
[0078]酶固定珠的制备
[0079](I)含酶材料和赋形剂的混合液体的制备
[0080]杀死能够产生阿拉伯糖异构酶的微生物细胞，然后对微生物细胞的培养液进行离心分离以回收死微生物细胞。接着，在0.7%二氧化硅溶液中通过在90°C下搅拌3小时或更久以使得藻酸盐可完全溶解于溶液中，来将藻酸盐溶解到2 %的浓度。在确定藻酸盐的完全溶解之后，通过使冷却水通过护套将藻酸盐溶液冷却到35°C。
[0081]接着，使用搅拌器在50rpm下将藻酸盐溶液与经分离微生物细胞混合。
[0082](2)混合液体的排放
[0083]确认混合液体具有5，OOOcps的粘度,然后注入到第一罐中。接着，通过在1.2kg/cm2的压力下供应空气，使藻酸盐/微生物细胞混合液体通过具有0.3mm的内径且在其远端处具有切割形状的喷嘴，进而使混合液体以具有1.7mm的直径的球形形状下落到第二罐中含有的I %氯化钙溶液上。
[0084](3)固定珠的形成
[0085]从喷嘴排放的珠下落到与喷嘴的液体出口分离0.6m距离的氯化钙溶液上，同时将空气供应到氯化钙溶液上(空气起泡)，且随后将所述珠转移到冷却罐，然后在2°C下固化24小时。
[0086]图3中绘示用于制备酶固定珠的工艺和设备。
[0087][参考标号列表]
[0088][设备]
[0089]a:第一罐
[0090]b:第二罐
[0091]c:喷嘴单元
[0092]d:喷嘴的上端
[0093]e:喷嘴的下端
[0094][工艺]
[0095]1:注入混合液体
[0096]2:注入空气
[0097]3:将混合液体注入到喷嘴的上端的混合液体入口中
[0098]4:从喷嘴的下端的液体出口排放且下落固定珠
[0099]5:使固定珠下落到第二罐中的氯化钙溶液上
【权利要求】
1.一种用于制备酶固定珠的设备，包括: a)第一罐,其中注入含有含酶材料和赋形剂的混合液体； b)喷嘴单元，安置于所述第一罐的下端处且包括喷嘴，所述喷嘴具有0.1mm到Imm的内径和圆柱形下端且在其所述下端处包含垂直于所述喷嘴的垂直轴切割的液体出口 ；以及 c)第二罐，安置于所述喷嘴单元下方且含有氯化钙溶液。
2.根据权利要求1所述的用于制备酶固定珠的设备，其中所述第二罐中的所述氯化钙溶液的表面与所述喷嘴单元的所述液体出口之间的距离范围是从0.1m到1.5m。
3.根据权利要求1所述的用于制备酶固定珠的设备，其中所述喷嘴单元包括至少两个喷嘴。
4.根据权利要求1所述的用于制备酶固定珠的设备，其中所述第一罐包括混合液体入口或空气入口。
5.一种制备酶固定珠的方法，使用根据权利要求1到4中任一权利要求所述的用于制备酶固定珠的设备。
6.根据权利要求5所述的制备酶固定珠的方法，其中将注入到所述第一罐中的所述混合液体调整到3，OOOcPs到7，OOOcPs的粘度，且将0.1 kg/cm2到3kg/cm2的压力施加于所述第一罐的所述空气入口。
7.根据权利要求5所述的制备酶固定珠的方法，其中所述酶固定珠具有直径为0.5mm到3mm的球形形状。
【文档编号】C12N11/00GK104284973SQ201380025477
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2012年5月17日
【发明者】金舜哲, 金成俌, 林栽闰, 安广镇, 金镇夏 申请人:Cj第一制糖株式会社