海马齿水通道蛋白SpAQP1及其编码基因在提高植物耐盐中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了海马齿水通道蛋白SpAQP1及其编码基因在提高植物耐盐中的应用。本发明提供了发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由（a）衍生的蛋白质。本发明从滨海耐盐植物海马齿中首次分离了水通道蛋白基因SpAQP1并对其耐盐功能进行了鉴定；本发明证实高盐胁迫下海马齿中SpAQP1的表达受到显著诱导，说明其功能与耐盐相关；本发明进一步将海马齿耐盐基因SpAQP1导入烟草，转基因植物的耐盐能力得到明显提高，说明SpAQP1蛋白可用于提高作物的耐盐性。
【专利说明】海马齿水通道蛋白SpAQPI及其编码基因在提高植物耐盐中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及海马齿水通道蛋白SpAQPl及其编码基因在提高植物耐盐中的应用。
【背景技术】
[0002]土壤盐碱化是影响农业生产和生态环境的重大问题。全国第二次土地普查资料显示，我国盐碱地面积为5.27亿亩，其中具有农业利用潜力的面积约为2亿亩。通过转基因技术培育耐盐作物新品种是开发利用盐碱地的一条有效途径。
[0003]海马齿(Sesuvium portulacastrum)又名滨水菜,属于双子叶植物纲石竹亚纲番杏科，为多年生肉质草本植物，多生长在热带、亚热带海边沙地，对滨海高盐环境具有极高的耐受性，能够在海水的冲击和浸泡下健康生长并完成其生活史，是一种典型的盐土植物。因此以海马齿为材料，从中挖掘耐盐基因资源用于作物抗逆新品种的培育，对提高作物耐盐性、开发利用盐碱土壤具有重要的应用价值。
[0004]水分子的跨膜运动并不是通过自由扩散的方式进行的，而是需要一种膜蛋白的协助来完成，这种蛋白称为水通道蛋白(aquaporin，AQP)。AQP在动物、植物和微生物细胞中大量存在，在 调节水分运输、保持细胞内外水分平衡中发挥重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供海马齿水通道蛋白SpAQPl及其编码基因。
[0006]本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质:
[0007](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008](b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
[0009]上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个取代和/或缺失和/或添加。
[0010]编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0011]上述DNA分子为如下I) -4)中任一所述的DNA分子:
[0012]I)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子；
[0013]2)编码区为自5’末端第1-852位核苷酸所示的DNA分子；
[0014]3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
[0015]4)与I)或2)的DNA分子至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
[0016]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。[0017]含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
[0018]上述重组载体为将序列表中序列I自5’末端第1-852位核苷酸插入载体PCAMBIA1304的Nco I和Spe I酶切位点间得到的载体。
[0019]扩增上述DNA分子的全长或其任一片段的引物对。
[0020]在本发明的实施例中，引物对如下:
[0021]F-1304-AQP:5/ -GACCATGGCGAAGGATTTTGAAACAGGAGGAG-3;(划线部分为 Nco I酶切位点)和
[0022]R-1304-AQP:5/ -CGACTAGTCACGTTGGAGGAGCTCCTAAAG-3'(划线部分为 Spe I 酶切位点)。
[0023]上述的蛋白、上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0024]上述应用中,所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。所述耐逆性为耐盐性；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草(Nicotiana tabacum)。
[0025]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0026]本发明提供的方法，是将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0027]上述方法中，编码上述蛋白的DNA分子是通过上述的重组载体导入目的植物中；
[0028]所述耐逆性为耐盐性。
[0029]上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
[0030]本发明的实验证明，本发明从优秀耐盐植物资源海马齿中分离了水通道蛋白基因SpAQPl, SpAQPl在受到盐胁迫时表达显著增加，在植物中过表达时能明显提高植物的耐盐能力。SpAQPl可用于耐盐作物新品种的培育，在盐碱地开发利用中具有广阔应用潜力和价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为NaCl处理不同时间SpAQPl的相对表达量
[0032]图2为转SpAQPl烟草的PCR鉴定结果
[0033]图3为转基因烟草SpAQPl的相对表达量分析
[0034]图4为转SpAQPl烟草的耐盐试验
【具体实施方式】
[0035]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]实施例1、海马齿SpAQPl蛋白及其编码基因的获得
[0038]1、海水诱导海马齿根系差异表达基因cDNA文库的构建
[0039]I)海马齿水培生根和RNA提取
[0040]从海马齿(Sesuviumportulacastrum L.参考文献:Zeng, H.C.，Deng, L.H.,&Zhang, C.F.(2006).Cloning of Salt Tolerance - Related cDNAs from theMangrove Plant Sesuvium portulacastrum L.Journal of Integrative PlantBiology, 48 (8),952-957.;公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得)母株上剪取长度5cm左右带有两个节点的茎段，去除下部节点上的叶片，插入淡水中进行水培生根。3-4周后将已生根的海马齿植株转入海水，分别处理2、4、6、8、12、24和48h，每个时间点取3株作为样品，以未经海水处理的海马齿作为对照。将各海水处理的样品混合在一起，采用CTAB法提取根的总RNA，同时提取对照样品根总RNA。
[0041]2)利用抑制差减技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建差异表达基因的cDNA文库
[0042]使用试剂盒Super SMART? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech 公司)将步骤 I)得到的RNA反转录合成双链cDNA,以对照样品cDNA作为driver海水处理样品作为tester,利用PCR-Select cDNA Substraction Kit (Clontech公司)构建海水处理差异表达基因cDNA文库。
[0043]2、SpAQP I基因的获得
[0044]对文库中的部分克隆进行测序，得到差异表达基因的EST序列，通过软件BLASTx在NCBI数据库中进行同源性搜素，确定其中一个EST序列为细胞质膜水通道蛋白5'端序列。根据已知序列设计特异引物AQP-3-RACE:5' -ATGGAGGTGGAGCCAATGAGTTATC-3'，使用SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司)扩增未知的3'端序列。将获得的PCR片段测序后与已知EST序列拼接，得到一条包含完整开放阅读框的拼接序列。根据拼接序列 Y 和:V 末端设计特异弓 I 物 F-AQP (5' -ATGGCGAAGGATTTTGAAACAGG-3')和 R-AQP (5' -ACCCAAGACACACTAACAATAACC-3')，以海马齿根系cDNA为模板进行扩增。扩增产物测序后与拼接序列比较，二者序列一致，说明拼接序列在海马齿中确实存在，从而获得了海马齿水通道蛋白基因，命名为SpAQPl，该基因的编码区核苷酸序列为序列表中的序列1，编码的蛋白命名为SpAQPl，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
`[0045]实施例2、海马齿SpAQPl在高盐胁迫下的表达分析
[0046]选取长势一致的海马齿水培苗，转入浓度为200mM的NaCl水溶液中，分别处理1、
2、4、8、12和24h，每个时间点取3棵苗作为实验材料，以未处理的水培苗作为对照。
[0047]用CTAB法提取样品根总RNA，反转录成cDNA后，使用UltraSYBR Mixture (北京康为世纪)进行Real-time PCR分析。SpAQPl的扩增引物为F-AQP-qRT:5 ' -TCTTCTCTGCCACTGACCCCA-3 '，R_AQP_qRT:5 ' -ACCGCAGCACCGAAACTACGA-3 '。内参基因为海马齿 Actin，引物为 F-Actin-qRT:5 ' -TTGAACCCAAAGGCTAACAGAGA-3 '，R-Actin-qRT:
-CACGACCAGCAAGATCCAAAC-3'。扩增条件为 95°C预变性 10min，40 个循环:95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸20s。Real-time PCR扩增以及SpAQPl相对表达量分析使用Mx3005P QPCR System (Stratagene 公司)进行。
[0048]结果见图1，其中对照Oh的相对表达量指定为I。结果显示，在植株受到盐胁迫时，SpAQPl的表达显著增强，处理4h后达到最高峰，为对照的26倍，说明SpAQPl参与盐胁迫应答。
[0049]实施例3、SpAQPl在调控植物耐盐性中的应用
[0050]1、重组载体 pCAMBIA1304-SpAQPl 的构建
[0051]以海马齿根的cDNA 为模板，合成引物 F-1304-AQP:5' -GACCATGGCGAAGGATTTTGAAACAGGAGGAG-3'(划线部分为 Nco I 酶切位点)和 R-1304-AQP:5' -CGACTAGTCACGTTGGAGGAGCTCCTAAAG-3 ’ (划线部分为Spe I酶切位点)进行PCR扩增。
[0052]得到864bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列I自5’末端第1-852位核苷酸。
[0053]将该PCR产物用限制性内切酶Nco I和Spe I进行双酶切，回收854bp酶切产物，与经相同酶双酶切植物表达载体pCAMBIA1304 (记载在如下文献:Bouquin, T., Mattsson, 0., Nsested, H., Foster, R., &Mundy, J.(2003).TheArabidopsis luelmutant defines a katanin p60ortholog involved in hormonalcontrol of microtubule orientation during cell growth.Journal of cellscience, 116 (5)，791-801 ;公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得)得到的12347bp的载体骨架连接，得到重组载体。
[0054]测序结果表明该重组载体为将序列表中序列I自5’末端第1-852位核苷酸插入载体PCAMBIA1304的Nco I和Spe I酶切位点间得到的载体，命名为pCAMBIA1304_SpAQPl。
[0055]2、转SpAQP I烟草的获得
[0056]I)重组农杆菌的获得
[0057]将重组载体pCAMBIA1304-SpAQPl 转入根瘤农杆菌 GV3101 (Berres R.0tten L.Tinland, B., Malgarin1-Clog, E., &ffalter, B.(1992).Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.PlantCell Reports, 11 (4), 192-195.;公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得，得到重组农杆菌。
[0058]提取重组农杆菌的质粒，测序为pCAMBIA1304_SpAQPl，含有该质粒的重组农杆菌命名为 GV3101/pCAMBIA1304-SpAQPlo
[0059]2)转SpAQPl烟草的获得
[0060]从平板挑取重组菌GV3101/pCAMBIA1304-SpAQPl单菌落，接种在含50mg/L利福平，50mg/L庆大霉素，50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28 °C培养至0D600=0.6-0.8。吸取Iul菌液作为模板，使用引物F-1304-AQP和R-1304-AQP进行菌液PCR对重组菌进行鉴定，得到864bp的为阳性。对鉴定为阳性的菌液以5000rpm离心5min收集菌体,然后用5倍体积的MS液体培养基悬浮，加入终浓度为100 μ M的乙酰丁香酮，得到农杆菌侵染菌液。
[0061]将无菌培养的烟草(Nicotiana tabacum cv.K326,文献:彭世清，黄冬芬.拟南芥肌动蛋白解聚因子4基因(AtADF4)在烟草中表达引起植株形态变化.植物生理与分子生物学学报32.1 (2006):52-56.;公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得；以下也称为野生型烟草)叶片，切成大小约为I X Icm的叶盘，浸入制备好的农杆菌菌液中侵染lOmin。用无菌吸水纸吸干叶盘表面的菌液，放置在共培养MS培养基(MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L IAA, pH5.8)上，28°C暗培养3d。然后将叶盘转入芽诱导培养基(MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L IAA+10mg/L 潮霉素 +500mg/L 羧苄青霉素，pH5.8)中，置于 25°C，光照周期为16h light/8h dark的光照培养箱中培养。当不定芽长到l-2cm时，在超净工作台中用无菌锋利刀片将芽切下，接到生根培养基(l/2MS+15mg/L潮霉素+250mg/L羧苄青霉素，pH5.8)上诱导生根，4-5周后即可得到完整的TO代转SpAQPl烟草。将组培苗转至花盆在自然条件下栽培，收获其自交Tl代种子，Tl代 植株自交收获T2代种子。
[0062]3)转SpAQPl烟草鉴定[0063]使用烟草直接PCR试剂盒(Tobacco Direct PCR Kit,成都福际生物)，以直径2mm的叶片为模板，F-1304-AQP和R-1304-AQP为引物，对TO代转SpAQPl烟草进行PCR鉴定，以未转基因的野生烟草作为对照。
[0064]结果如图2所示，M为D2000DNA ladder ;泳道I为野生烟草；泳道2_10为TO代转SpAQPl烟草，显示大部分转基因烟草植株中可以扩增出特异的目的条带(2、3、5-10能扩出864bp产物)，而野生烟草则没有相应的扩增条带。
[0065]使用相同的方法对Tl和T2代植株进行PCR鉴定，得到864bp片段的为阳性转SpAQPl 烟草。
[0066]利用含50mg/L潮霉素的MS平板对Tl代种子进行筛选，获得潮霉素抗性植株(抗性植株正常生长，敏感植株死亡)，并单株收获其T2代种子。按相同方法继续对T2代种子进行筛选，得到不产生抗性分离的T2代纯合转基因株系，用于以下转基因烟草的耐盐性分析，为T2代纯合转SpAQPl烟草株系。
[0067]进一步通过qRT-PCR对T2代转SpAQPl烟草纯合株系中SpAQPl的相对表达水平进行分析。
[0068]具体方法是:提取转基因烟草的叶片RNA，反转录成cDNA作为模板，扩增SpAQPl使用的引物为F-AQP-qRT和R_AQP_qRT，内参基因使用烟草actin基因，引物为F-NtACTIN-qRT:5, -TCAATCCTMGGCCMCAGAGA-3' R-NtACTIN-qRT:5, _CACGACCAGCMGATCCAAAC_3,。PCR扩增及数据处理使用Mx3005P QPCR System (Stratagene公司)进行。以野生型烟草(WT)为对照。
[0069]检测结果如图 3所示，T2代纯合转SpAQPl烟草株系1、2、3叶片中的SpAQPl的表
达水平显著高于野生烟草。
[0070]采用同样的方法将空载体pCAMBIA1304转入野生型烟草中，得到TO代转空载体烟草，播种得到T2代转空载体烟草，通过qRT-PCR鉴定，T2代转空载体烟草中SpAQPl表达与野生型烟草无显著差异。
[0071]3、转SpAQPl烟草的耐盐性研究
[0072]从经过鉴定的3个T2代纯合转SpAQPl烟草株系中随机选择植株进行耐盐试验，以野生型烟草和T2代转空载体烟草作为对照，试验重复5次，确保结果的一致性。
[0073]将生长在相同环境、苗龄2月左右、长势一致的野生植株和转基因植株用200mMNaCl水溶液进行浇灌，每2d浇灌一次，IOd后观察表型。
[0074]结果如图4所示，发现野生型烟草叶片失绿萎蔫，继而茎部和叶片出现坏死，而转基因植株症状明显轻于野生植株，基本正常，整体存活率明显高于野生植株，说明SpAQPl提高了植株的耐盐性。
[0075]统计存活率，阳性T2代纯合转SpAQPl烟草株系的平均存活率为85% ；
[0076]野生型烟草存活率仅为10%以下。
[0077]野生型烟草和T2代转空载体烟草结果无显著差异。
【权利要求】
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质: Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为如下I)_4)中任一所述的DNA分子: 1)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子； 2)编码区为自5’末端第1-852位核苷酸所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)的DNA分子至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.扩增权利要求2或3所述DNA分子的全长或其任一片段的引物对。
6.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述耐逆性为耐盐性；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草(Nicotiana tabacum)。
8.一种培育转基因植物的方法，是将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:编码权利要求1所述蛋白的DNA分子是通过权利要求4所述的重组载体导入目的植物中； 所述耐逆性为耐盐性。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
【文档编号】C12N15/82GK103804479SQ201410035161
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】畅文军, 张治礼, 朱家红, 范伟, 刘习文 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所