专利名称：表达趋化因子受体ccr5的骨髓源神经干细胞及制备方法
技术领域：
本发明涉及对多发性硬化症有治疗作用的神经干细胞，具体是涉及一种表达趋化 因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞及制备方法。
背景技术：
神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)的发现与成功分离，是20世纪末神经生物 学领域最重要的进展之一(参照参考文献)。成年动物与人体内的NSCs存在于侧脑室周围 和海马齿状回等区域，具有自我更新及分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等多 种潜能。多年来学者们一直寻求分离、扩增这些NSCs的方法，以用于替代、修复缺损的神经 细胞，治疗阿尔茨海默病、帕金森氏病、多发性硬化和脊髓损伤等神经系统疾病，但因取材 困难、损伤较大而降低了临床治疗的可行性；胚胎来源的神经干细胞无法回避免疫排斥和 道德伦理等问题[1_3]。因此，寻找取材方便、来源丰富、无免疫排斥、无道德伦理困扰的神经 干细胞的新来源具有重要的意义。骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新和多分化潜能， 在一定条件下可分化为神经干细胞，称骨髓源神经干细胞(Bone Marrow-NSCs, BM-NSCs) [4_5]。BM-NSCs取材容易，可直接抽取病人骨髓、经体外分选而获得，无免疫原性，来源丰富， 是神经干细胞的一个理想的新来源，因而日渐受到人们的重视。多发性硬化(multiple sclerosi^MS)是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为
特点的慢性自身免疫性疾病。病灶多发于脑和脊髓的白质，呈多灶性炎性细胞侵润、脱髓鞘
及神经元损伤，可导致感觉、运动、意识和神经认知等多方面的功能障碍。该病多发于青壮
年人，复发率和致残率高，是青壮年人非外伤性神经残疾最常见的原因，迄今缺少有效治疗
方法[6_7]。近年来许多学者用NSCs移植治疗MS，取得了一定效果。但移植的NSCs向中枢
炎症部位的迁移速度较慢，需20-30天才能到达病变部位[8’9]，因此疗效产生缓慢。其重要
原因是NSCs表面缺乏趋化因子受体，不能对炎症部位的趋化因子产生有效的趋化反应[8’9’ 10,11]
O在MS急性期，CNS炎症部位产生高水平趋化因子MIP-I α，β，RANTES等，与炎症 细胞表面的趋化因子受体CCR5结合，引起炎细胞的聚集与激活[1°’"’12]。但NSCs表面只表 达微量的CCR5，因此不能向炎症部位快速、大量迁移[8’9 2]。为了加快NSCs的迁移速 度、增强治疗效果，我们选择了趋化因子受体CCR5，将其基因转入BM-NSCs。CCR5的高表达 使BM-NSCs向CNS病灶区的迁移速度显著加快、数量明显增多、起效时间明显缩短，从而显 著减轻了 MS发病早期的脱髓鞘病变，促进了髓鞘修复及神经功能的恢复。总之，表达CCR5的自体骨髓源神经干细胞不仅可通过细胞替代、髓鞘修复来治疗 MS，而且迁徙能力显著增强，移植后可快速、有效地发挥治疗作用，成为治疗多发性硬化及 其他神经系统疾病的一种理想的新型干细胞制剂，具有十分广阔的开发和应用前景。参考文献1. Ben-Hur T, Einstein 0, Mizrachi-Kol R, Abramsky 0.2003. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in
3response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia41 :73-80.2. Pluchino SiQuattrini AiBrambilla EiGritti AiSalani G Martino G. 2003. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422 :688_694·3. Yang J，Jiang Z，Rostami A，Zhang GX. Adult neural stem cells expressing IL-IOconfer potent immunomodulation and remyelination in experimental autoimmune encephalitis. J Clin Invest. 2009,119 (12) :3678_369L4. Yang J，Rostami A，Zhang GX.Cellular remyelinating therapy in multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2009,276(1-2) :1_5·5. Song S，Song S，Zhang H，Sanchez-Ramos J. . 2007. Comparison of neuron-like cells derived from bone marrow stem cells to those differentiated from adult brain neural stem cells. Stem Cells Devl6 :747_756.6. Rudick，RA. Polman CH. 2009. Current approaches to the identification and management of breakthrough disease in patients with multiple sclerosis. Lancet Neurol 8 :545-559.7. Trapp BD, Ransohoff R, Rudick R. 1999. Axonal pathology in multiple sclerosis-relationship to neurologic disability. Curr Opin Neuroll2 :295_302·8.Pluchino S，A QuattriniiE BrambillaiA GrittiiG SalaniiG Dina，R GalliiU Del Carro,S Amadio,A Bergami，R Furlan,G Comi，AL Vescovi and G Martino. (2003). Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422:688-94.9.Pluchino S， L Zanotti, B Rossi， E Brambi11a, L Ottoboni, G Salani, M Martinello,A Cattalini,A Bergami，R Furlan，G Comi,G Constantin and G Martino. (2005). Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature 436:266—71.10. Zhang GX, CM Baker, DL Kolson and AM Rostami. (2000). Chemokines and chemokine receptors in the pathogenesis of multiple sclerosis. Mult Scler 6: 3-13.11. Segal BM. (2005). CNS chemokines，cytokines, and dendritic cells in autoimmune demyelination. J Neurol Sci 228:210—4.12.Aloisi F，S Columba-Cabezas，D Franciotta,B Rosicarelli，R Magliozzi, R Reynolds, E Ambrosini, E Coccia，M Salvetti and B Serafini. (2008). Lymphoid chemokines in chronic neuroinflammation. J Neuroimmunol198 106-12.
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种来源于骨髓、可表达趋化因子受体CCR5的 新型神经干细胞及制备方法，用于治疗多发性硬化症状及多种神经系统疾病。釆用的技术方案是一种表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，由骨髓间充质干细胞[lineage-/⑶117(c-kit)+]经体外诱导分化而来，转染了可表达CCR5基因的逆转录病毒 质粒，为转染了可表达CCR5、由CMV启动子驱动的逆转录病毒质粒，作为基因治疗的良好载 体，携带并有效表达外源基因CCR5。上述的骨髓充质干细胞来源于成年小鼠骨髓，表达Nestin与Sox2。一种表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞的制备方法，包括下列步骤步骤一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定提取4-6周龄C57BL/6小鼠全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪 (Miltenyi Biotec)筛选出间充质干细胞[lineage_/CD117 (c_kit)+]，体外用 bFGF 和 EGF 诱导分化为神经干细胞。经免疫组化染色、荧光显微镜检测，证实为Nestin与S0X2阳性表 达，可鉴定为未分化神经干细胞。步骤二、构建CCR5和EGFP共表达的质粒、转染骨髓源神经干细胞及CCR5表达的 检测。克隆小鼠CCR5基因、构建共表达CCR5和EGFP的逆转录病毒质粒，由CMV启动子 驱动；以293T细胞包装病毒；用病毒上清转染BM-NSCs ；对照组转染只表达EGFP的逆转录 病毒质粒。以免疫组化法和流式细胞仪检测CCR5的表达，证实被转染的BM-NSCs可有效表 达 CCR5 禾口 GFP。步骤三、CCR5转基因骨髓源神经干细胞的趋化性实验微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜 而设计的。滤膜将小室分隔成上下两部分，BM-NSCs在上面，趋化因子RANTES在下面，并通 过滤膜形成一定浓度梯度。BM-NSCs则沿着梯度穿过膜孔，粘附在膜的下面。迁移5h后取 出滤膜染色，并计数滤膜下表面的细胞数。结果证实CCR5-BM-NSCs的迁移率显著高于对照 组 GFP-BM-NSCs。本发明提供了一种制备神经干细胞的简捷而有效的方法，制备的神经干细胞为MS 患者提供了一种全新的治疗方法，也为其它多种神经系统疾病的治疗带来了新的希望。
图1为骨髓源神经干细胞(BM-NSCs)的生成与鉴定示图。图2为构建CCR5与GFP共表达质粒、转染BM-NSCs及CCR5表达的检测示图。图3为CCR5转基因骨髓源神经干细胞的趋化性实验示图。图4为CCR5的表达增强了骨髓源神经干细胞对EAE的治疗作用示图。图5为CCR5的表达增强了 BM-NSCs在CNS的迁移能力示图。图6为BM-NSCs在CNS的分化与修复髓鞘作用示图。图1是从成年小鼠的腓骨中提取全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪 筛选出 lineage-/CD117(c-kit)+细胞，以 1. 0X105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20 μ g/ ml+EGF 20 μ g/ml+2% Β27中培养，每隔3天换液一次。3_5周后诱导形成神经干细胞球。 免疫组化染色、荧光显微镜检测，结果显示BM-NSCs细胞球(A)及打散的单个细胞(B)都为 Nestin (绿色)和S0X2(红色)阳性，可鉴定为未分化NSCs。蓝色细胞核DAPI染色。放 大倍数神经球10 X，单细胞85 X。图2为是(A)共表达CCR5与GFP (Lv. CCR5)及只表达GFP (Lv. GFP)的逆转录病毒
5载体结构图，由CMV启动子驱动；(B)免疫组化法检测CCR5的表达用293T细胞包装病毒、 收集72小时内病毒上清液；用浓缩的病毒上清转染BM-NSCs，3天后以免疫组化染色、荧光 显微镜检测，显示两组BM-NSCs都显著表达GFP (绿色)，说明两组BM-NSCs都被病毒质粒有 效转染，但CCR5 (红色)只在CCR5-BM-NSCs中显著表达，在对照组BM-NSCs中几乎不表达。 放大倍数85X ； (C)流式细胞仪检测CCR5的表达转染3天后取两组BM-NSCs，分散成单 细胞，PBS洗3次，分别加入anti-nestin和anti_CCR5抗体，4°C孵育20min后用流式细胞 仪检测CCR5的表达。结果显示在CCR5-BM-NSCs组中，nestin+/CCR5+细胞数高达82. 5%， 而在对照组只有7. 1 %，说明CCR5转基因BM-NSCs能有效表达CCR5。图3为趋化小室中的微孔滤膜将小室分隔成上下两部分。(A)将转染后5天的 CCR5-BM-NSCs置于趋化小室的上部，以GFP_BM_NSCs为对照，趋化因子RANTES置于下部， 并形成一定浓度梯度。BM-NSCs则沿着梯度穿过滤膜孔，附在膜的下面。迁移5h后取滤膜 下表面的细胞染色(Diff-Quik dye，蓝色)，并计算穿过滤膜的细胞百分数。(B)细胞迁移 定量分析。结果证实CCR5-BM-NSCs组的迁移百分率显著高于对照组GFP_BM_NSCs，并呈 RANTES剂量依赖性，说明CCR5的表达显著增强了 BM-NSCs的迁移能力。*，ρ < 0. 05，**， ρ <0.01。CCR5-BM-NSCs组与GFP-BM-NSCs组比较。实线箭头细胞；虚线箭头膜孔。图4雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白乳化液 (MOG35^55) 200 μ g/ 只诱导 EAE 模型，22 天后尾 iv. CCR5_BM_NSCs 和对照组 GFP-BM-NSCs 各1.5X IO6/只，空白对照组(Sham-EAE) iv.等量PBS。每日观察记录临床症状评分。结 果显示，PBS组呈现典型的EAE疾病进程，GFP-BM-NSCs组的病情明显轻于PBS组，但起效 慢，iv. 18天后才出现明显治疗作用，且治疗效果不很理想(最低临床症状评分0.5士)；而 CCR5-BM-NSCs对疾病的抑制作用较GFP-BM-NSCs更快更强，iv. 6天后即出现明显治疗作 用，且治疗效果显著增强(最低临床症状评分0.2士)。*p<0.05，**p<0.01，PBS组与其 它组的比较;#p < 0. 05，CCR5-BM-NSCs 组与 GFP-BM-NSCs 组的比较，η = 8。图5为静脉移植2、4、6周后，取脑与脊髓制成冰冻切片，荧光显微镜下检测病 灶区(A)脑胼胝体(Corpus callosum), (B)脊髓腹侧角(Ventral), (C)两组动物病灶 区都可见GFP阳性细胞(静脉移植的细胞)；免疫组化检测结果显示，CCR5(红色)只在 CCR5-BM-NSCs中显著表达，在对照组GFP-BM-NSCs中几乎不表达；(D)细胞计数分析显示， CCR5-BM-NSCs组进入CNS病灶区的细胞数量较对照组GFP-BM-NSCs显著增多，说明CCR5 的表达显著增强了 BM-NSCs的迁移能力。*p < 0. 05，**p < 0. 01，CCR5_BM_NSCs组与 GFP-BM-NSCs组在iv.后2、4、6周的比较。图6为静脉移植4周后，取脑与脊髓制成冰冻切片，免疫组化检测NF-M、GalC, GFAP及Nestin的表达，电镜观察髓鞘修复与再生。(A)免疫组化、细胞计数分析结果表明， 与对照组GFP-BM-NSCs相比，CCR5_BM_NSCs组有更多细胞分化为GalC+少突胶质细胞(修 复髓鞘)和NF-M+神经元(神经元再生)；⑶电镜检查结果显示，EAE发病22天时(EAE Before iv.)，脊髓腹侧角病变区可见大量脱髓鞘神经轴突(虚线箭头)；iv. PBS 4周后 (Sham-EAE)，脱髓鞘病变进行性加重(虚线箭头)；iv.两组BM-NSCs 4周后，病变髓鞘得以 明显修复，并出现大量薄壁的新生髓鞘(实线箭头)，CCR5-BM-NSCs组的新生髓鞘明显多于 GFP-BM-NSCs组；正常鼠(Naive)的神经轴突外包绕着厚壁髓鞘(箭头)；(C)定量分析结 果表明，CCR5-BM-NSCs组有髓鞘轴突所占百分率明显高于对照组GFP-BM-NSCs，说明CCR5的表达促进了髓鞘的修复与再生。*P < 0. 05,CCR5-BM-NSCs组与GFP_BM_NSCs组的比较； flP < 0. 05, ##p < 0. 01, Sham-EAE 组与两种 BM-NSCs 治疗组的比较，η = 8。
具体实施例方式一种表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞的制备方法，包括如下步骤步骤一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定(1)骨髓源神经干细胞(BM-NSCs)的生成与培养取8_12周C57BL/6小鼠的腓骨， 提取全骨髓细胞，用德国美天旎公司(Miltenyi Biotec)的微珠标记抗体及磁性细胞分选 仪(QuadroMACS S印arator)分两步筛选出间充质干细胞。首先用系别细胞去除试剂盒 (Lineage Cell Depletion Kit)去除成熟造血细胞，如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、 粒细胞和红细胞以及定向祖细胞(CD5+，CD45+，CDllb+，Gr-I+, TERl 19+，7/4+)，保留系别 阴性细胞(lineage-)；再用抗 CD117 抗体(CDl 17 (c_kit)Microbeads)筛选出 lineage-/ CDl 17 (c-kit) + 间充质干细胞，以 1 X 105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20 μ g/ml+EGF 20μ g/ml+2% Β27中培养，每隔3天换液一次，3_5周后诱导形成神经干细胞球。结果见图 1A。(2)取第三代骨髓源神经干细胞球及打散的单个细胞，以抗小鼠Nestin和S0X2抗 体进行免疫组化染色、荧光显微镜检测。结果显示BM-NSCs细胞球及单个细胞都为Nestin 和S0X2阳性，可鉴定为未分化NSCs。结果见图1A，B。步骤二、CCR5与EGFP共表达质粒的构建、转染BM-NSCs及CCR5表达的检测(图 2)。(1)克隆小鼠CCR5基因，构建可共表达CCR5与EGFP的逆转录病毒表达质粒，由 CMV启动子驱动；只表达EGFP的质粒作为对照(图2A)。(2)以293T细胞包装病毒；收集72小时内病毒上清液；用浓缩的病毒上清转染 BM-NSCs。3天后以免疫组化染色、荧光显微镜检测，结果显示两组BM-NSCs都显著表达GFP， 但CCR5只在CCR5-BM-NSCs中显著表达，在对照组GFP-BM-NSCs几乎不表达(图2B)；转 染3天后取两组BM-NSCs，分散成单细胞，PBS洗3次，分别加入anti_nestin和anti_CCR5 抗体，4°C孵育20min后用流式细胞仪检测CCR5的表达。结果显示在CCR5_BM_NSCs组中， nestin+/CCR5+细胞数高达82. 5%，而在对照组只有7. 1 %，说明CCR5转基因BM-NSCs能有 效表达CCR5 (图2C)。步骤三、CCR5转基因骨髓源神经干细胞的趋化性实验(图3)将BM-NSCs置于趋化小室的上面，趋化因子RANTES在下面，并通过滤膜形成一定 浓度梯度。37°C，5% CO2孵育5h，BM-NSCs则沿着梯度穿过膜孔，粘附在膜的下面。取出滤 膜进行细胞染色，并计数滤膜下表面的细胞数。结果证实CCR5-BM-NSCs的迁移百分率显著 高于对照组GFP-BM-NSCs。见附图3。动物试验1、多发性硬化动物模型的制作与BM-NSCs移植治疗(图4)雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白乳化液 (MOG35^55)，200 μ g/只，诱导MS动物模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)。 22 # M jl iv. CCR5-BM-NSCs, M M jl
7iv. GFP-BM-NSCs各1. 5X IO6个细胞/只，观察、记录临床评分的改变。结果显示，PBS组呈 现典型的EAE疾病进程，两个干细胞移植组的发病明显轻于PBS组；CCR5-BM-NSCs治疗组 较GFP-BM-NSCs对照组起效显著加快，作用显著增强。见附图4。2、BM-NSCs在CNS的迁移能力检测(图5)静脉移植2、4、6周后，取脑与脊髓制成冰冻切片，荧光显微镜下检测病灶区(脑胼 胝体Corpus callosum,脊髓腹侧角Ventral)，可见GFP阳性细胞(绿色)，说明静脉移植的 BM-NSCs已进入病变区；免疫组化结果显示，CCR5(红色)只在CCR5_BM_NSCs中显著表达， 在对照组BM-NSCs中几乎不表达；细胞计数定量分析结果显示，CCR5-BM-NSCs组进入CNS 病灶区的细胞数量较对照组GFP-BM-NSCs明显著增，说明CCR5的表达显著增强了 BM-NSCs 的迁移能力。见附图5。3、BM-NSCs在CNS的分化与修复髓鞘作用检测(图6)静脉移植4周后，取脑与脊髓制成冰冻切片，免疫组化检测NF-M、GalC, GFAP及 Nestin的表达，电镜观察髓鞘修复与再生。免疫组化染色、细胞计数分析结果表明，与对照 组GFP-BM-NSCs相比，CCR5_BM_NSCs组有更多细胞分化为GalC+少突胶质细胞(修复髓鞘) 和NF-M+神经元(神经元再生)；电镜检查结果显示，EAE发病22天时(EAE Before iv.)， 脊髓腹侧角病变区可见大量脱髓鞘神经轴突；iv. PBS 4周后(Sham-EAE)，脱髓鞘病变进行 性加重；iv.两组BM-NSCs 4周后，病变髓鞘得以明显修复，并出现大量薄壁的新生髓鞘， CCR5-BM-NSCs组的新生髓鞘明显多于GFP-BM-NSCs组；正常鼠(Na'ive)的神经轴突外包绕 着厚壁髓鞘；定量分析结果表明，CCR5-BM-NSCs组有髓鞘轴突所占百分率明显高于对照组 GFP-BM-NSCs，说明CCR5的表达促进了髓鞘的修复与再生。见附图6。
权利要求
表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于由骨髓间充质干细胞[lineage /CD117(c kit)+]经体外诱导分化而来，转染了可表达CCR5基因的逆转录病毒质粒，用于治疗多发性硬化症。
2.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于所 述的骨髓充质干细胞来源于成年小鼠骨髓，表达Nestin与S0X2。
3.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于所 述的转染了可表达CCR5基因的逆转录病毒质粒为转染了可表达CCR5、由CMV启动的逆转录 病毒质粒，作为基因治疗的良好载体，携带并有效表达外源基因CCR5。
4.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞的制备方法，其 特征在于包括下列步骤步骤一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定提取4-6周龄C57BL/6小鼠全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪(Miltenyi Biotec)筛选出间充质干细胞[lineage-/CDl 17 (c-kit) +]，体外用bFGF和EGF诱导分化为 神经干细胞；经免疫组化染色、荧光显微镜检测，证实为Nestin与S0X2阳性表达，可鉴定为 未分化神经干细胞；步骤二、构建CCR5和EGFP共表达的质粒、转染骨髓源神经干细胞及CCR5表达的检测；克隆小鼠CCR5基因、构建共表达CCR5和EGFP的逆转录病毒质粒，由CMV启动子驱动； 以293T细胞包装病毒；用病毒上清转染BM-NSCs ；对照组转染只表达EGFP的逆转录病毒质 粒；以免疫组化法和流式细胞仪检测CCR5的表达，证实被转染的BM-NSCs可有效表达CCR5 禾口 GFP ；步骤三、CCR5转基因骨髓源神经干细胞的趋化性实验微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设 计的；滤膜将小室分隔成上下两部分，BM-NSCs在上面，趋化因子RANTES在下面，并通过滤 膜形成一定浓度梯度；BM-NSCs则沿着梯度穿过膜孔，粘附在膜的下面，迁移5h后取出滤膜 染色，并计数滤膜下表面的细胞数。
全文摘要
本发明描述了一种骨髓来源的、表达趋化因子受体CCR5、可用于治疗多发性硬化症的新型神经干细胞的制备方法及用途。具体涉及骨髓源神经干细胞的生成与鉴定、外源基因CCR5的导入及对多发性硬化症的治疗作用。骨髓源神经干细胞具有自我更新及分化为神经元与神经胶质细胞的能力，且取材容易，来源丰富，无免疫原性，是一种理想的神经干细胞的新来源；同时还可携带并有效表达外源基因CCR5，显著增强其向中枢病变区的迁移能力，使疗效明显提高，为多发性硬化及其他神经系统疾病的治疗提供了一种全新的神经干细胞制剂。
文档编号C12N5/10GK101979510SQ20101051111
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者徐志立, 李云兴, 杨静娴, 梁文波, 王东, 闫宇辉, 陶小军 申请人:辽宁中医药大学