发酵戊糖的细胞的制作方法

发酵戊糖的细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及发酵戊糖的细胞。本发明涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ?ID?NO:3中示出的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主是异源的。本发明的细胞可用于生产发酵产物如乙醇的方法中。这类方法可包含用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。
【专利说明】发酵戊糖的细胞
[0001]本申请是基于申请号为200980108010.4、申请日为2009年3月5日、 申请人:为帝斯曼知识产权资产管理有限公司、名称为“发酵戊糖的细胞”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及能够将木糖异构化为木酮糖的细胞。本发明还涉及其中使用这类细胞生产发酵产物例如乙醇的方法。
[0003]发明背景
[0004]最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少C02的无粒子燃烧燃料来源。
[0005]尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是，典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产的提高会需要使用更低成本的原料。
[0006]目前，只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用于乙醇生产的作物。在 大部分木质纤维素材料中，在葡萄糖之后第二常见的糖是木糖。因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomyces cerevisia是有活力的并且充分适合乙醇生产,但是不能使用木糖作为碳源生产乙醇。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力将木糖发酵成乙醇的。
[0007]因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地从木质纤维素原料生产乙醇。
[0008]发明概沭
[0009]根据本发明，提供了能够发酵(例如醇发酵)和使用木糖作为碳源的细胞。这样的细胞包含编码木糖异构酶的核苷酸序列，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3中公开的氨基酸序列具有至少约70%的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。这样的细胞在使用木糖作为碳源时，与野生型丝状真菌相比生产更大量的乙醇。
[0010]本发明还提供了
[0011]-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成所述发酵产物；
[0012]-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明定义的还能够利用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物；和
[0013]-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞和能够使L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物。
[0014]本发明还提供了本发明的细胞在生产发酵产物的方法中的用途。
[0015]附图概沭
[0016]图1公开了用于在Saccharomyces cerevisiae中表达的编码来自Bacteroidesuniformis ATCC8492 的木糖异构酶的 pYISIT4_XKSl_xylA (Baun CpO)的质粒图谱。CpO 表示经密码子对优化。
[0017]图2公开了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID n0.4中给出。
[0018]图3公开了野生型GRE3-基因座的物理图谱(图a)和GRE3-基因座中PWT080的I拷贝整合(展示引物在何处结合的图b，和展示RKIl-探针在何处结合的图c)。
[0019]图4公开了放射自显影图，显示CEN.PKl 13-7D中I拷贝质粒pPWT080的正确整合；
[0020]图a:染色体DNA制剂的Xcm1-消化，与RKIl-探针杂交。第I道:CEN.PK113-7D ；第 2 道:BIE104F1 ;第 3 道:BIE104P1
[0021]图b:染色体DNA制剂的Psi1-消化，与RKIl-探针杂交。第I道:CEN.PK113-7D ;第 2 道:BIE104F1 ;第 3 道:BIE104P1
[0022]AGRE3::PPP代表用含有处于强组成型启动子控制下的基因TAL1、TKLU RKIl和RPEl 的盒代替 GRE3-基因的编码区，Δ GRE3:: [TPIlp-TALl-ADHlp-TKLl-PGIlp-RPEl-EN01p-RKIl]。
[0023]图5公开了 GRE3-基因座的物理图谱，其中通过PPP-基因TAL1、TKLU RKIl和RPEl的整合代替GRE3-基因的编码区。图a展示SEQ ID5和6引物在何处结合，图b展示RKIl-探针在何处结合。
[0024]图6公开了质粒pYI#SIT4的物理图谱。
[0025]图7公开了质粒pPWT007的物理图谱。
[0026]图8公开了质粒pPWT042的物理图谱。
[0027]图9公开了野生型SIT4-基因座(图a)和SIT4-基因座中PWT080的I拷贝整合(图b，展示引物在何处结合)的物理图谱。
[0028]图10公开了 BIE104P1Y9在2%木糖作为唯一碳源上、在若干次预培养后的生长曲线，和基因组中未整合I拷贝PPWT042的参照菌株的生长曲线。图中用数字表示事件:(I):转移至YNB1%葡萄糖+1%木糖；(2):转移至ΥΝΒ0.1%葡萄糖+2%木糖；(3)转移至YNB2%木糖;(4)转移至YNB2%木糖(仅BIE104P1Y9)。
[0029]图11公开了参照菌株BIE104P1和木糖代谢菌株BIE104P1Y9的生长曲线。
[0030]图12公开了在葡萄糖上预培养的BIE104P1(图a)、在葡萄糖上预培养的BIE104P1Y9(图b)和在木糖上预培养的BIE104P1Y9(图c)菌株随时间的木糖和葡萄糖消
耗与乙醇生产。
[0031]图13公开了质粒pPWT018的物理图谱。
[0032]图14公开了质粒pPWT006的物理图谱。
[0033]图15公开了 Southern印迹放射自显影图。用EcoRI以及HindIII 二者消化野生型菌株CEN.PK113-7D (第I道)和BIE104A2(第2道)的染色体DNA。将所述印迹与特异性SIT2-探针杂交。
[0034]图16公开了野生型SIT2-基因座(图a)的物理图谱，和通过质粒pPWT018的整合引入ara-基因后，之后的分子内重组导致载体和可选择标记物序列的丢失(图b)。标明了探针的杂交。
[0035]图17公开了菌株BIE104A2P1Y9在不同培养基上的生长曲线的图示。图a:在半乳糖上生长的菌株BIE104A2P1Y9，之后是图中通过以下数字标明的事件:(1)转移至1%阿拉伯糖+1%木糖，和(2)转移至2%木糖+0.2%阿拉伯糖。图b:在葡萄糖上生长的菌株BIE104A2P1Y9，之后是(I)转移至I %阿拉伯糖+1 %木糖和(2)转移至2%木糖+0.2%阿拉伯糖。
[0036]序列表简沭
[0037]SEQ ID NO:1 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC8492 的野生型木糖异构酶序列。Genbank 登记号 AAYH02000036。
[0038]SEQ ID NO: 2公开了衍生自SEQ ID NO:1的经密码子优化的序列。
[0039]SEQ ID NO:3 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC8492 的木糖异构酶的氨基
酸序列。
[0040]SEQ ID NO:4 公开了质粒 pPWT080 的序列。
[0041]SEQ ID NO:5公 开了正向引物的序列。
[0042]SEQ ID NO:6公开了反向引物的序列。
[0043]SEQ ID N0:7公开了用于诊断性PCR的多功能正向引物的序列。
[0044]SEQ ID NO:8公开了用于诊断性PCR的多功能反向引物的序列。
[0045]SEQ ID NO:9公开了正向引物RKIl-探针的序列。
[0046]SEQ ID NO: 10公开了反向引物RKIl-探针的序列。
[0047]SEQ ID NO: 11公开了正向引物kanMX-盒的序列。
[0048]SEQ ID NO: 12公开了反向引物kanMX-盒的序列。
[0049]SEQ ID NO: 13公开了正向引物的序列。
[0050]SEQ ID NO: 14公开了反向引物的序列。
[0051]SEQ ID NO: 15公开了用于诊断性PCR的正向多功能引物序列。
[0052]SEQ ID NO: 16公开了用于诊断性PCR的反向多功能引物序列。
[0053]SEQ ID NO: 17公开了质粒pPWT018序列的序列。
[0054]SEQ ID NO: 18公开了整合pPWT018的正向引物的序列。
[0055]SEQ ID NO: 19公开了整合pPWT018的反向引物的序列。
[0056]SEQ ID NO: 20公开了正向引物SIT2-探针的序列。
[0057]SEQ ID NO: 21公开了反向引物SIT2-探针的序列。
[0058]发明详沭
[0059]在本说明书和附带的权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”以及变形如“包含”(〃comprises〃、〃comprising〃)、“包括”("includes〃和"including")应被解释为包括性地。也就是说，这些词语旨在告知在上下文允许时可能包括未明确指出的其它元件或者整数(integer)。
[0060]本发明涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:3中公开的氨基酸序列具有至少约70%的同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主是异源的。
[0061]编码木糖异构酶的核苷酸序列的存在向细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力。
[0062]“木糖异构酶” (EC5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反过来的酶。所述酶还已知为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可需要二价阳离子如镁、锰或钴作为辅因子。
[0063]因此，本发明的细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力，所述核酸构建体包含编码确定的木糖异构酶的核苷酸序列。本发明的细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化为木酮糖。这被理解为表示在木糖异构酶催化的单个反应中木糖被异构化为木酮糖，与分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的、木糖通过木糖醇中间产物成为木酮糖的两步转化相反。
[0064]木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为:在Kuyper et al.(2003, FEMSYeast Res.4:69-78)所述条件下,每分钟生产Inmol木酮糖的酶量。
[0065]本发明的细胞参照具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与之具有至少约70%序列同一性的序列来定义。类似地，本发明的细胞可以参照木糖异构酶和编码这类氨基酸序列的核苷酸序列来定义。
[0066]SEQ ID NO:3 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC8492 的木糖异构酶的氨基酸序列。本发明的细胞包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列，所述木糖异构酶具有SEQID NO:3的氨基酸序列或与之具有至少约70%的序列同一性。
[0067]优选地，根据本发明的细胞是包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，所述木糖异构酶的序列与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少约75%、优选地至少约80%、至少约85 %、至少约90 %、至少约92 %、至少约93 %、至少约94 %、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %或至少约99 %或至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。然而，根据本发明的细胞可包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列，所述木糖异构酶的序列与SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列具有至少约50%、至少约55%、至少约60%或至少约70%的序列同一性。
[0068]序列同一性(或序列相似性)在本文中定义为两条或更多氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系，所述关系通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性典型地在被比较的序列的整个长度上比较。然而，可以在更短的比较窗口中比较序列。在本领域中，“同一性”还表示根据情况通过氨基酸或核酸序列字符串之间的匹配测定的氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度。
[0069] 测定同一性的优选的方法被设计为给出被测试序列之间的最大匹配。测定同一性和相似性的方法在公众可获得的计算机程序中被编码。测定两条序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括例如BestFit、BLASTP, BLASTN和FASTA (AltschuI，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)， 公众可从 NCBI 和其它来源获得(BLASTManual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD20894)。使用 BLASTP 进行氨基酸序列比较的优选的参数是缺口开放11.0，缺口延伸l，Blosum62矩阵。使用BLASTP进行核酸序列比较的优选的参数是缺口开放11.0、缺口延伸1、DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。
[0070]任选地，在测定氨基酸相似性程度时，技术人员也可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，如本领域技术人员所明白的。
[0071]保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。
[0072]优选的保守性氨基酸取代组为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开的序列中至少一个残基被去除并在其位置中插入一个不同残基的变体。优选地，氨基酸改变是保守性的。对每种天然存在的氨基酸而言优选的保守性取代如下:Ala 至Ij ser ；Arg 至Ij Iys ；Asn 至Ij gin 或 his ；Asp 至Ij glu ；Cys 至Ij ser 或 ala ；GIn 至Ij asn ；GIu到 asp ；GIy 到 pro ；His 到 asn 或 gin ；He 到 Ieu 或 val ；Leu 到 ile 或 val ；Lys 到 arg ；gln或 glu ；Met 到 leu 或 ile ；Phe 到 met, leu 或 tyr ；Ser 到 thr ；Thr 到 ser ；Trp 到 tyr ；Tyr到 trp 或 phe ;和 Val 到 ile 或 leu。
[0073]根据本发明编码催化木糖转化成木酮糖的酶的核苷酸序列也可以通过其在中度或优选地在严格杂交条件下与编码下述酶的核苷酸序列杂交的能力来定义，所述酶具有SEQ ID NO: 3中公开的序列或与SEQ IDN0:3具有至少约70%序列同一性的序列。
[0074]正式地，这类 核苷酸序列与编码下述酶的核苷酸序列的反向互补链杂交，例如是与SEQ ID NO:1或2的反向互补链杂交的序列，所述酶具有SEQ ID NO: 3中公开的序列或与SEQ ID N0:3具有至少约70%序列同一性的序列。
[0075]严格杂交条件在本文中定义为下述条件，其允许至少约25个、优选地约50个核苷酸、75或100个和最优选地约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65°C的温度下，在包含约IM盐、优选地6x SSC(氯化钠、柠檬酸钠)的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中杂交，和在包含约0.1M盐或更少，优选地0.2x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中于65°C下洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行I小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的序列的特异性杂交。
[0076]中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选地约200个或更多个核苷酸在约45°C的温度下，于包含约IM盐、优选地6x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中杂交，并于室温下，在包含约IM盐、优选地6x SSC的溶液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行I小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具有至多50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够修饰这些杂交条件，从而特异性鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。
[0077]为了提高被引入的酶在本发明的细胞中以活性形式表达的可能性，可以改造相应的编码核苷酸序列，从而针对所选择的酵母细胞优化其密码子使用。密码子优化的若干方法是本领域已知的。针对酵母的密码子使用来优化核苷酸序列密码子使用的一种优选的方法是如W02006/077258和/或W02008/000632中公开的密码子对优化技术。W02008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样一种方法，其中编码多肽的核苷酸序列关于其密码子使用、尤其是使用的密码子对而被修饰，以获得编码所述多肽的核苷酸序列的改进的表达和/或所编码的多肽的改进的生产。密码子对被定义为编码序列中一组两个连续的三联体(密码子)。
[0078]作为基因表达和翻译效率的简单度量，本文中使用如Xuhua Xia, EvolutionaryBioinformatics2007,:353-58 中所述的密码子适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)。所述指数使用来自一个物种的高度表达基因的参照组来评价每种密码子的相对优点(merits)，并从所述基因中所有密码子的使用频率计算基因的分值。指数评价选择在塑造密码子使用模式中的有效程度。在这一方面中，预测基因的表达水平来评价病毒基因对其宿主的适应和在不同生物中进行密码子使用比较是有用的。指数也可给出异源基因表达可能成功的大致指示。在根据本发明的经密码子对优化的基因中，CAI为0.6或更多、0.7或更多、0.8或更多、0.85或更多、0.87或更多0.90或更多、0.95或更多或约1.0。
[0079]在本发明的细胞中，木糖异构酶对细胞而言典型地是异源的。也就是说，木糖异构酶具有下述序列，所述序列不作为其存在的生物、细胞、基因组DNA或RNA序列的一部分而天然存在于所述细胞中。也就是说，木糖异构酶对所述细胞而言是外源的，或者不天然存在于所述细胞中。因此，编码木糖异构酶的核苷酸序列在所述经转化的宿主细胞中典型地以活性形式被表达或者能够以活性形式被表达。
[0080]因此，本发明的细胞是包含下述核酸构建体(即用所述核酸构建体转化)的细胞，所述核酸构建体包含如上文定义的编码木糖异构酶的核苷酸序列。包含木糖异构酶编码序列的核酸构建体优选地 能够在所述宿主细胞中表达木糖异构酶。
[0081 ] 用于在细胞中表达异源木糖异构酶序列的方法是本领域技术人员公知的。
[0082]因此，本发明的细胞是重组细胞。也就是说，本发明的细胞包含下述核苷酸序列、用下述核苷酸序列转化或用下述核苷酸序列遗传修饰，所述核苷酸序列不天然存在于所述细胞中。
[0083]在细胞中重组表达木糖异构酶以及对本发明细胞进行其它遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。典型地，这类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。这类方法例如从标准手册如 Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress 或 F.Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York(1987)中已知。对真菌宿主细胞进行转化和遗传修饰的方法从例如 EP-A-0635574、W098/46772、W099/60102、W000/37671、W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186 中已知。
[0084]大部分附加体Gpisomal)或2 μ质粒是相对不稳定的，在每个世代后在约10-2或更多细胞中丢失。即便是在选择性生长的条件下，仅60%到95%的细胞保留附加体质粒。大部分附加体质粒的拷贝数范围为每个cir+宿主细胞中10-40个。然而，质粒并非相等地分布于细胞间，并且种群中每个细胞的拷贝数存在高度变化。用整合性质粒转化的菌株极度稳定，即便是不存在选择性压力时也是如此。然而，质粒损失可通过随机重复的DNA之间的同源重组以约10_3到10_4的频率发生，导致载体序列的成环离开(looping out)。优选地，稳定整合情况下的载体设计是，在选择标记物基因丢失(也可以通过分子内、同源重组发生)后，被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，所述基因因此被稳定整合。合适的整合在本文中被定义为整合进基因组中，其中被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，不存在选择标记物。
[0085]典型地，核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细胞可包含单个或多个拷贝的编码木糖异构酶的核苷酸序列，例如通过使用多拷贝核苷酸构建体或通过使用具有多拷贝木糖异构酶序列的构建体来实现。
[0086]核酸构建体可以作为附加体维持，并因此包含用于自主复制的序列，如常染色体复制序列序列。合适的附加体核酸构建体可以例如基于酵母2μ或pKDl质粒(Gleer et al., 1991, Biotechnology9:968-975)或 AMA 质粒(Fierro et al., 1995, CurrGenet.29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机发生，但优选地，核酸构建体可以通过同源重组被整合进细胞的基因组中，如本领域所公知的(见例如W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186)。
[0087]典型地，木糖异构酶编码序列应当与能够提供或帮助木糖异构酶序列转录和/或翻译的一条或多条核酸序列可操作地连接。
[0088]术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，所述启动子或增强子影响所述编 码序列的转录。
[0089]在本文中使用时，“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游，并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
[0090]能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。然而，启动子对宿主细胞而言可以是同源的，即内源的。
[0091]本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子以及经改造的启动子，这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GALl、CYC1、HIS3、ADHl、PGL、PH05、GAPDH、ADCl、TRP1、URA3、LEU2、EN01TPI1 和 AOXl。其它合适的启动子包括roCl、GPDl、PGKl、TEFl和TDH3。
[0092]在本发明的细胞中，编码木糖异构酶的核苷酸序列的3’ -端优选地与转录终止子序列可操作地连接。优选地，终止子序列在选择的宿主细胞、如例如选择的酵母物种中是可操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的；其可以例如来自于任何酵母基因，尽管如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常，编码木糖异构酶的核苷酸序列包含终止子。优选地，这类终止子与预防本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰变的突变组合(参阅例如:Shirley et al.，2002，Geneticsl61:1465-1482)。
[0093]转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。[0094]任选地，适用于本发明的核酸构建体中可存在可选择标记物。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗生素从未经转化的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3’ -O-磷酸转移酶II (卡那霉素、新霉素和G418抗性)。尽管对于多倍体宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的，然而优选地使用非抗生素抗性标记物，如营养缺陷型标记物_3、TRP1、LEU2)或S.pombe TPI基因(由RussellP R, 1985，Gene40:125-130描述)。在一个优选的实施方案中，用核酸构建体转化的宿主细胞是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-0635574中，并且基于双向标记物如k.nidulans amdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者，可以将可筛选的标记物如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中，允许筛选经转化的细胞。
[0095]可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于，一条或多条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点抗体(centromer)、调聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列，如ARS序列。
[0096]优选地，木糖异构酶在胞质溶胶中表达。胞质溶胶表达可通过线粒体或过氧化物酶体靶向信号的缺失或修饰来实现。
[0097]本发明的细胞可以是任何合适的细胞，如原核细胞如细菌，或真核细胞。典型地，细胞会是真核细胞，例 如酵母或丝状真菌。
[0098]酵母在本文中被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos, C.J., 1962, In:1ntroductory Mycology, Johnffiley&Sons, Inc., New York)。
[0099]酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长，或可通过生物的裂变生长。作为本发明细胞的一种优选的酵母可属于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属。优选地，酵母是能够厌氧发酵的酵母，更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。
[0100]丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖组成的植物菌丝体。
[0101]适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞，因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖，并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为本发明宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra>Fusarium或Penicillium属。更优选地，丝状真菌细胞可以是Aspergillusniger、Aspergillus oryzae> Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 细胞。
[0102]许多年来，建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度酸_、乙醇-和渗透-耐性，厌氧生长的能力，当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括 S.cerevisiae> S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum> S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K fragilis。
[0103]本发明的细胞可以能够将植物生物量、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油转化成例如可发酵的糖。因此，本发明的细胞可表达将纤维素转化为葡萄糖单体或将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体所需的一种或多种酶，如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)、半纤维素酶(内切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或能够将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。
[0104]本发明的细胞优选地是能够进行木糖主动或被动转运进入细胞的宿主。
[0105]优选地，本发明的细胞:
[0106]能够进行主动糖酵解；和/或
[0107]显示经过戊糖磷酸通路的通量；和/或
[0108]展示木酮糖激酶活性，使得由木糖异构化而来的木酮糖可以被代谢成丙酮酸。
[0109]所述细胞还优选地包含将丙酮酸转化成期望的发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、反丁烯二酸、苹果酸、衣康酸(itaconic acid)、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。
[0110]本发明的一种优选的细胞是天然能够进行醇发酵、优选地进行厌氧醇发酵的细胞。本发明的细胞优选地 具有对乙醇的高度耐性、对低pH的高度耐性(即能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物如糠醛和羟基-甲基糠醛的的高度耐性，和/或对提高的温度的高度耐性。
[0111]本发明细胞的任何上述特征或活性可以天然存在于细胞中，或者可以通过遗传修饰引入或修饰。
[0112]编码木糖异构酶的核苷酸序列典型地被表达，或者能够在经转化的宿主中以活性形式被表达。因此，宿主细胞中核苷酸序列的表达生产活性木糖异构酶，典型地其比活性在约30°C下为每mg蛋白质至少约IOU木糖异构酶活性,在约30°C下每mg优选地至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约500、至少约750或至少约1000U。经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文中被定义为宿主细胞无细胞裂解物(例如酵母无细胞裂解物)的每mg蛋白质的木糖异构酶活性单位的量。木糖异构酶活性的测定、蛋白质量和无细胞裂解物的制备如本文所述。优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生下述木糖异构酶，其对木糖的Km小于50、40、30或25mM，更优选地，对木糖的Kni约为20mM或更少。
[0113]本发明的细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地，遗传修饰可导致通过戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰，与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相比，所述修饰将所述通量提高至约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量:在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主，测定木糖消耗的比速率,并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例，优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μ_)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Qs)等于生长速率(P)除以在糖上的生物量产率(Yxs)，因为在糖上的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下:厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等；即Qs= μ/Yj。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高，除非转运(摄取收到限制)。
[0114]可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传修饰。这些方式包括例如，实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶更高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或编码酶的基因或调节这些基因的因子的重组DNA技术(例如过表达或失活)来实现。
[0115]在一种优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地，所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶组成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如可以被过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛酶；或至少是酶转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转醒酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方案中，酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞，其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达，因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上 厌氧生长。实际上，在一些条件下，仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率，所述宿主细胞过表达所有四种酶，即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外，过表达酶5-磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的，所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶，因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。
[0116]酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸核酮糖(phosphoribulose)异构酶；赤藓糖_4_磷酸异构酶；磷酸酮戍糖3_差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列或者通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPEI。
[0117]酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5_磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸戊糖异构酶；磷酸核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5_磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPII。
[0118]酶“转酮酶”(EC2.2.1.1)在本文中被定义为催化下述反应的酶:D_核糖5_磷酸+D-木酮糖5-磷酸〈-> 景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸且反之亦然。所述酶也已知为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通过其氨基酸定义。类似地，转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKLl。
[0119]酶“转醛酶”(EC2.2.1.2)在本文中被定义为催化下述反应的酶:景天庚酮糖7_磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸且反之亦然。所述酶还已知为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，转醛酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转醛酶的核苷酸序列在本文中称作TALl。
[0120]本领域技术人员已知用于在本发明的细胞中表达和过表达酶的多种手段。具体地，可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自附加体多拷贝表达载体的基因，或通过引入包含多拷贝基因的附加体表达载体)来过 表达酶。
[0121]或者，可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现本发明宿主细胞中酶的过表达。尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的，但是还优选启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源的。优选地，与对编码序列而言天然的启动子相比，异源启动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)，优选地在可获得木糖或木糖与葡萄糖作为碳源、更优选地作为主要碳源(即多于50%可获得的碳源由木糖和木糖与葡萄糖组成)、最优选地作为唯一碳源的条件下。在本文上下文中，合适的启动子包括组成型和诱导型启动子二者，以及经改造的启动子。用于本发明中的一种优选的启动子还应当对代谢产物(葡萄糖)阻抑不敏感，和/或应当优选地不需要木糖来诱导。具有这些特征的启动子是可广泛获得的，并是技术人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子，如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PFK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于这类启动子的更多细节可在(W093/03159)中找到。其它有用的启动子是编码核糖体蛋白的基因启动子，乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰，来影响它们的控制特征。
[0122]用于上述酶过表达的编码序列可优选地对本发明的宿主细胞而言是同源的。然而，可以使用对本发明宿主细胞而言异源的编码序列。
[0123]涉及经遗传修饰的宿主细胞中酶的生产时，酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常，这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产，或者以更高的稳态水平被生产。类似地，这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产，或者也以更高的稳态水平被生产。因此，优选地使用本文所述的适当酶测定法，通过测量宿主细胞中的酶比活性水平，来测定酶的过表达。或者，可以例如使用酶的特异性抗体，通过量化酶蛋白质的比稳态水平，或者通过定量编码所述酶的mRNA的比稳态水平，来间接测定酶的过表达。后者可尤其适用于戊糖磷酸通路，对所述戊糖磷酸通路而言酶测定法不是容易可行的，因为所述酶的底物不可商业获得。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时，要过表达的酶被过表达至至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
[0124]本发明的细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的，或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0125]酶“木酮糖激酶”(EC2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖=ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还已知为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似地，木酮糖激酶可以通过 编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
[0126]在本发明的细胞中，提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合。然而，这不是必需的。
[0127]因此，本发明的宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约
1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
[0128]本发明的细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性，所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地，所述遗传修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝或使其表达失活。宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序列不同并且鸽子由不同基因编码。还在这类情况下，优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地，通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活，其中在该语境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。
[0129]编码要在本发明宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0130]在本发明的宿主细胞中，降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰和/或提高上述宿主细胞中特异性木酮糖激酶活性的任何修饰组合。然而，这不是必需的。
[0131]因此，仅包含下述一种或多种遗传修饰的本发明的宿主细胞明确地包括在本发明中，所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。
[0132]酶“醛糖还原酶”(EC1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何酶。在本发明的语境中，醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源)的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化反应:
[0133]
【权利要求】
1.包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3中示出的氨基酸序列具有至少约70%的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。
2.根据权利要求1的细胞，其为真核细胞。
3.根据权利要求1或2的细胞，其为酵母细胞。
4.根据权利要求3 的细胞，其为 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Klockera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属的酵母细胞。、
5.根据权利要求4的细胞，其中所述酵母细胞是物种S.cerevisiae、S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum>S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K.fragilis的细胞。
6.根据权利要求1或2的细胞，其为丝状真菌细胞。
7.根据权利要求6的细胞,其中所述丝状真菌细胞是Aspergillus、Penicillium、Rhizopus、Trichoderma、Humicola、Acremonium 或 Fusarium 属的。
8.根据权利要求7的细胞，其中所述丝状真菌细胞是物种Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 的细胞。
9.根据前述权利要 求中任一项的细胞，其中所述细胞包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰导致: a.所述细胞中木糖转运提高； b.木酮糖激酶活性提高； c.通过戊糖磷酸通路的通量提高； d.醛糖还原酶活性降低； e.对分解代谢物阻遏的敏感性降低； f.对乙醇、渗量或有机分子的耐性提高；或 g.副产物的生产减少。
10.根据权利要求9的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致至少一种下述基因的过表达，所述基因编码所述戊糖磷酸通路的非氧化部分的酶。
11.根据权利要求10的细胞，其中所述基因是编码5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶或转醛酶的基因。
12.根据权利要求10或11的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致至少编码转酮酶和转醛酶的基因过表达。
13.根据权利要求9到12中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码木酮糖激酶的基因过表达。
14.根据权利要求8到13中任一项的细胞，其中被过表达的所述基因是对所述细胞来说内源的基因。
15.根据权利要求9到14中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致所述细胞中非特异性醛糖还原酶活性的降低。
16.根据权利要求15的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的内源基因的表达，或降低所述非特异性醛糖还原酶的活性。
17.根据权利要求16的细胞，其中通过缺失所述基因的至少部分或通过破坏所述基因使所述基因失活。
18.根据权利要求16或17的细胞，其中所述细胞中编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低。
19.根据前述权利要求中任一项的细胞，所述细胞具有使用L-阿拉伯糖的能力。
20.根据权利要求9到19中任一项的细胞，其中基因TAL1、TKL1、RPE1和RKIl被过表达。
21.根据权利要求9到20中任一项的细胞，其中GRE3-基因的编码区通过用包含基因TALl、TKLl、RPEl和RKIl的核苷酸序列来代替所述编码区而被失活。
22.根据权利要求9到21中任一项的细胞，其中来自Lactobacilluspi ant arum的基因araA、araB和araD被表达。
23.根据权利要求9到22中任一项的细胞，其中所有被表达的基因被组成型表达或组成型过表达。
24.根据权利要求23的细胞，其中一种或多种组成型表达或组成型过表达的基因被稳定整合进所述细胞的基因组中。
25.根据权利要求24的细胞，其中所有组成型表达或组成型过表达的基因被稳定整合进所述细胞的基因组中。
26.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用根据前述权利要求中任一项的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。
27.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用权利要求19到23中任一项定义的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物。
28.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用权利要求1到18中任一项中定义的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或阿拉伯糖发酵成为所述发酵产物。
29.根据权利要求26到28中任一项的方法，所述方法包括回收所述发酵产物。
30.根据权利要求26到29中任一项的方法，其中所述培养基还含有葡萄糖来源。
31.根据权利要求28到30中任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、内酰胺抗生素和头孢菌素。
32.根据权利要求26到31中任一项的方法，其中所述方法是厌氧的。
33.根据权利要求26到32中任一项的方法，其中所述方法是需氧的，优选地在氧受限的条件下进行。
34.本发明的细胞在用于生产发酵产物的方法中的用途。
【文档编号】C12R1/865GK104017741SQ201410193256
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2009年3月5日 优先权日:2008年3月7日
【发明者】保罗·克莱斯森, 简·米特斯卡·拉恩·范德, 比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·苏勒库姆·范 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司