热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法，本发明采用突变菌株和经点突变改造得到的突变菌株的植酸酶工程菌为模板进行DNA改造，构建植酸酶工程菌突变体库，获得重组的基因工程菌，其酶活及热稳定性均有所提高。
【专利说明】热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和微生物领域，具体而言，涉及一株热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肌醇六磷酸酯，又名植酸是一种广泛存在于植物中的有机磷酸化合物，是一种广谱性的抗营养因子，因此被视为饲料中的有害成分。目前，植酸酶作为一种绿色添加剂在饲料工业中广泛应用，可使饲料中的磷利用率增高，降低植酸盐的抗营养作用。但植酸酶天然材料中含量低，热不稳定性不能完全满足工业要求，使得其在推广中存在阻力。因此，利用基因工程手段改造植酸酶，提高其酶活及热稳定性成为研究热点。易错PCR技术和DNA改组技术均属于在DNA水平上构建突变体库，主要通过人为控制，增加突变的几率，同时控制的一定的方向，具有一定的目标性。与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点:①DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率?’②DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十KB DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；④通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高。可以看 出，DNA改组比随机突变具有较大的优势。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0004]本发明一方面涉及植酸酶工程菌，其特征在于相对于一般植酸酶，其2个氨基酸位点发生改变，即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)。
[0005]在本发明的一个优选实施方式中，所述的植酸酶工程菌氨基酸序列为SEQIDN0.1
[0006]本发明另一方面涉及上述植酸酶工程菌的制备方法，其特征在于通过DNA改组技术产生植酸酶工程菌基因突变，通过转染表达得到植酸酶工程菌。
[0007]本发明采用突变菌株和经点突变改造得到的突变菌株的植酸酶工程菌基因为模板进行DNA改造，构建植酸酶工程菌突变体库，获得重组的基因工程菌，其酶活及热稳定性均有所提闻。
【具体实施方式】:
[0008]1、通过DNA改组技术进行植酸酶工程菌突变体库的构建
[0009]将本实验室前期获取的PP-NPn1-S' PP-NPep-6A、PP-NPm-44-252, PP-NPep-1lC 菌株(上述菌株公开于《定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究》，硕士研究生学位论文，廖燕，2012)的总DNA提取后，分别通过KOD高保真酶扩增植酸酶基因，纯化回收后并等比例混合,用DnaseI酶切成随机片段，反应体系为50 μ L含上述DNA各 10 μ L，10 XDnaseIBuffer4.5 μ L，DnaseIl μ L, ddH20 补足。25°C处理 20min，7(TC处理IOmin使酶失活，回收小片段。
[0010]然后合成In-fusion反应的引物phyl和Phy2,序列分别为[0011 ] 5 ’ -AGCTTACGTAGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCGAGAAATC-3，和
[0012]5 ’ -AATTAATTCGCGGCCGCCTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA-3 ’，使经过 EcoRI 和 NotI双酶切的突变植酸酶工程菌基因PPIC9K线性化载体(质粒载体PPIC9K的制备:接种一环含有pPIC9K质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmLLB (含100 μ g/mLAmp抗生素)液体培养基中，37°C，180r/min培养过夜，使用E.Z.N.A.?质粒提取试剂盒按操作说提取pPIC9K质粒。质粒经EcoR1、NotI双酶切37°C酶切过夜。使用胶回收试剂盒回收纯化)引入与其同源的15个碱基序列(如下划线所标)。再以5μ L无引物PCR产物(反应体系为50 μ L体系含 Fragments5 μ L, dNTPs4 μ L, Mg2+5 μ L, 10 XKODbuffer5 μ L, KOD polymerasel μ L,ddH20补足。PCR反应条件为94°C预变性4min ;94°C变性50s，50.5 °C退火lmin，72°C延伸2min，48个循环；72°C IOmin0 )为模板，进行有引物PCR反应(反应体系为50 μ L体系含 primerless PCR product5 μ L, phyl IOpmol, Phy210pmol, 10XK0Dbuffer5 μ L,dNTP4.5 μ L，KODpolymerasel μ L, ddH20 补足。PCR 反应条件为:94°C预变性 4min ;94°C变性 lmin，50°C退火 7 0s，72。。延伸 2minl0sec,30 个循环；72°C IOmin0 )，回收 1400bp 左右片段。
[0013]2、突变植酸酶基因pPIC9K表达载体的构建
[0014]按照In-FusionAdvantagePCRCloningKit (Clontech 公司)操作说明操作。将经EcoRI和NotI双酶切的质粒pPIC9K和突变植酸酶基因后，胶回收9000bp左右片段，质粒PPIC9K与突变植酸酶基因(与线性化载体PPIC9K的末端有15个相同的碱基)用In-Fusion酶连接转化(DH5 α感受态细胞)后，随机挑取转化子进行菌落PCR鉴定，能够扩增出1400bp左右大小片段初步判断为阳性克隆菌株。
[0015]将上述步骤中获得的阳性重组质粒经BspE I线性化后，通过电击转化至巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，提取酵母总DNA后，通过PCR方法鉴定阳性克隆菌株。能扩增出1400bp大小片段的转化子鉴定为阳性克隆菌株。
[0016]3、植酸酶工程菌突变体的高通量筛选及重组基因工程菌的诱导表达
[0017]挑取上述阳性转化子转入每孔含有300 μ LBMGY液体培养基的96孔深孔培养板，每一孔对应一个阳性转化子，同时预留3孔作为对照，一孔接入出发菌株PP-NPep-6A，一孔接入ΡΡ-ΝΡΦ-11C，一孔不接入任何菌株。最后，与出发菌株PP-NPep-6A或PP-NPep-1 IC相比，具有高酶活或高热稳定性的转化子被筛选出来进行保种。通过对6000个转化子的酶活及80°C保温IOmin剩余酶活的测定初步筛选出12个转化子具有酶活提高或热稳定性提高或酶活及热稳定性均有所提高的有益突变体，分别命名为NPds-2F、NPds-6F、NPds_3D、NPds_4G、NPds-4A、NPds-5A、NPds_6H、NPds_6B、NPds_8D、NPds_8F、NPds-12D 和 NPds_12G。筛选结果表明对突变植酸酶基因的基于DNA改组方法的定向进化改造取得了效果。
[0018]通过摇瓶扩大培养及诱导产酶，对上述筛选得到的12个转化子进一步进行复筛，最终确定，最优突变株为NPds-12D，对这株菌所产植酸酶工程菌进行粗酶活、比活及热稳定性测定，结果表明，相比出发菌株PP_NPep-6A，NPds-12D的粗酶活达到94420U/mL，提高了35%，其比活力438366U/mg，提高了 44%。热稳定性也有明显提高:在70°C时，NPds_12D提高 35% ;801:时咿<13-120提高36%。
[0019]4、重组菌株的遗传稳定性分析
[0020]NPds-12D的I代酶活为112856±305U/mL，连续10次培养及酶活性测定结果为112479 土 269U/mL，结果表明突变菌株所产植酸酶工程菌的活性在各代之间无显著差异。
[0021]5、突变植酸酶工程菌基因序列测定分析
[0022]将经过DNA改组得到的突变植酸酶工程菌基因片段PhyA1211测序结果与出发菌株PhyA6A基因序列进行比对，结果表明，植酸酶PhyA1211序列有8个碱基发生突变(具体序列参见SEQ ID N0.1)，导致2个氨基酸位点发生改变，即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)(见表1);
[0023]表lNPds_12D中的DNA和氨基酸突变位点
[0024]
【权利要求】
1.一种热稳定性高的重组产植酸酶工程菌的制备方法，采用突变菌株和经点突变改造得到的突变菌株的植酸酶工程菌为模板进行DNA改造，构建植酸酶工程菌突变体库，获得重组的基因工程菌，其酶活及热稳定性均有所提高，所述的植酸酶相对于一般植酸酶，其2个氨基酸位点发生改变，即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)。
2.植酸酶，其特征在于相对于一般植酸酶，其2个氨基酸位点发生改变，即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)。
3.根据权利要求2所述的植酸酶，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQIDN0.1。
4.权利要求2或3所述的植酸酶的制备方法，其特征在于通过DNA改组技术产生植酸酶工程菌基因突变，通过转染表达得到植酸酶。
【文档编号】C12R1/84GK103952325SQ201410195490
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】陈惠 , 刘姗, 廖 燕, 孙蓉, 李成磊, 吴琦, 韩学易, 唐自钟, 郑天润, 晋海军, 刘默洋, 杨毅 申请人:四川农业大学