一种乙型肝炎病毒rna定量pcr检测方法及试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂，选取了与目的RNA?cDNA大小相近的质粒作为竞争模板对基因拷贝数进行量化。选取不同的模板分别对fRNA和trRNA进行检测，具有通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，适于不同人群HBV?RNA的检测，有望对HBV病毒各阶段的动力学进行更加全面的了解，完善传统检测项目。
【专利说明】—种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂
【技术领域】
[0001]本发明属于人乙型肝炎病毒检测【技术领域】，涉及一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)是一种基因组长度约为3200碱基的DNA病毒，由外膜和核衣壳组成。外膜为由HBsAg组成的病毒包膜 。传统诊断HBV感染的方法主要为从血清中用免疫学方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBCAg、HBcAb，用免疫组化方法原位检测HBV基因产物及HBV DNA的检测。但是，这些方法不能直观反应肝组织中HBV基因表达的实时状态，蛋白的检测也往往具有滞后性。即使HBV DNA的检测，对大部分处于低复制期或无复制期(肝癌晚期和新生儿期)的隐匿性感染也无法诊断。1999年以来，科学家确立了 HBV血清学标志物fRNA和trRNA，提出新的从血清中检测HBV核酸的方法。
【发明内容】
[0003]本发明解决的问题在于提供一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法及试剂，该方法适于不同人群HBV fRNA和trRNA的定量检测，具有灵敏度高、特异性强的特点。
[0004]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0005]一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，包括以下操作:
[0006]I)第一轮扩增
[0007]构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系:
[0008]14.Ομ I Η20，10.Ομ I来自待检测对象的核酸提取物，Ι.Ομ I竞争模板19L27，1.5μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1434+，Ομ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a, 3.Ομ I 浓度为IOOng/ μ I的引物1808a，5.0 μ I浓度为IOmM的dNTP，2.5 μ I浓度为IOOmM的DTT溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0μ I RNA 聚合酶；
[0009]所述的引物1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ；
[0010]所述的引物1806a为:⑴15AGCTC ；
[0011]所述的引物1808a 为:(T) 15GAAGC ；
[0012]构建trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系:
[0013]17.0μ I H20,10.0μ I来自待检测对象的核酸提取物，Ι.Ομ I竞争模板J166 (16)，1.5μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1445+，Ομ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a, 5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0μ IRNA聚合酶；
[0014]所述的引物1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ；
[0015]所述的引物1683a 为:(T) 15CGTGG ；
[0016]将构建的fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系、trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增:[0017]50 °C 孵育 20min ；93 °C 变性 lmin40sec ；DNA 扩增为 90 °C 40sec, 53 °C 50sec,70°C 40sec, 35 个循环；70°C 15min 后冷却至 4°C ；
[0018]2)第二轮扩增
[0019]构建fRNA第二轮反应体系:
[0020]31.Ομ I Η20。5.0μ1 第一轮 fRNA 扩增产物，0.75μ1 浓度为 lOOng/μΙ 的引物 1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a-O，0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物1808a-, 5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，1.5 μ I 浓度为 50mM 的MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer,
0.25 μ I Taq DNA 聚合酶；
[0021]构建trRNA第二轮反应体系:
[0022]31.75 μ I Η20，5.0μ1 第一轮 trRNA扩增产物，0.75μ1 浓度为 IOOng/μ I 的引物1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ I 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶；
[0023]所述的引物1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ；
[0024]所述的引物1683a为:⑴15CGTGG ；
[0025]将构建的fRNA第二轮反应体系、trRNA第二轮反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增: [0026]93?变性 lmin40sec ；DNA 扩增为 9(TC 40sec, 53°C 50sec, 70°C 40sec, 35 个循环；70 °C 15min 后冷却至 4°C ；
[0027]3)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物
[0028]在第二轮扩增完成之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，同时添加一定浓度的竞争模板作为对照；比较扩增产物与竞争模板条带的信号值，如果两者信号值相当则表明待测对象中fRNA、trRNA的浓度与竞争模板的浓度相当；如果两者的信号值不相当，则增加或稀释琼脂糖凝胶电泳时竞争模板的浓度，直到两者信号值相当为至。
[0029]所述竞争模板克隆的HBVcDNA位点为:
[0030]19L27:4-1808+ (T) 151，4
[0031]J166(16):1445-1656+71bpl, 5。
[0032]一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测试剂盒，包括以下反应体系:
[0033]fRNA 第一轮 50ul RT/PCR 反应体系:
[0034]14.Ομ I H20,10.Ομ I来自待检测对象的核酸提取物，Ι.Ομ I竞争模板19L27，
1.5μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1434+，Ομ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a, 3.0μ I 浓度为IOOng/ μ I的引物1808a，5.0 μ I浓度为IOmM的dNTP，2.5 μ I浓度为IOOmM的DTT溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0μ I RNA 聚合酶；
[0035]所述的引物1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ；
[0036]所述的引物1806a为:⑴15AGCTC ；
[0037]所述的引物1808a为:⑴15GAAGC ；
[0038]trRNA 第一轮 50ulRT/PCR 反应体系:
[0039]17.0μ I H20,10.0μ I来自待检测对象的核酸提取物，Ι.Ομ I竞争模板J166 (16)，
1.5μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1445+，0μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a, 5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0μ IRNA聚合酶；
[0040]所述的引物1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ；
[0041]所述的引物1683a为:⑴15CGTGG ；
[0042]fRNA第二轮反应体系:
[0043]31.Ομ I Η20。5.0μ1 第一轮 fRNA 扩增产物，0.75μ1 浓度为 lOOng/μΙ 的引物 1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a-O，0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物1808a-, 5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，1.5 μ I 浓度为 50mM 的MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer,0.25 μ I Taq DNA 聚合酶；
[0044]构建trRNA第二轮反应体系:
[0045]31.75 μ I Η20，5.0μ1 第一轮 trRNA扩增产物，0.75μ1 浓度为 IOOng/μ I 的引物1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ I 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶；
[0046]所述的引物1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ； [0047]所述的引物1683a为:⑴15CGTGG。
[0048]一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测引物，包括以下引物:
[0049]fRNA第一轮扩增用引物包括:引物1434+，引物1806a和引物1808a ；
[0050]trRNA第一轮扩增用引物包括:引物1445+和引物1683a_ ；
[0051]fRNA第二轮扩增用引物包括:引物1464+和引物1806a_ ；
[0052]trRNA第二轮扩增用引物包括:引物1464+和引物1683a ；
[0053]所述的引物1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ；
[0054]所述的引物1806a为:⑴15AGCTC ；
[0055]所述的引物1808a为:⑴15GAAGC ；
[0056]所述的引物1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ；
[0057]所述的引物1683a为:⑴15CGTGG ；
[0058]所述的引物1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ；
[0059]所述的引物1683a为:⑴15CGTGG。
[0060]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0061]本发明提供的乙型肝炎病毒转录体(Frna，trRNA)检测方法及试剂，通过一步法对RNA进行半巢式PCR和反转录后再进行扩增，通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于不同人群，为提高在对新生儿期、肝癌晚期等隐匿性感染期低复制状态HBV的检测效果提供可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0062]图1为HBV fRNA和trRNA扩增引物位置。数字表示Xho I酶切坐标，括号内数字表示扩增产物的大小。
[0063]图2为fRNA和trRNA检测系统的原理。f和tr分别表示fRNA和trRNA检测系统的扩增产物。
[0064]图3为应用fRNA和trRNA检测系统从感染患者血清中检测到的RNA。图3A从左到右分别为DNA marker,含有4种不同量的竞争模板，不含竞争模板的结果。图3B前3列为不同量的竞争模板，后3列为只含trRNA，只含竞争模板和只含DNA marker。
【具体实施方式】
[0065]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0066]本发明公开了一种乙型肝炎病毒的定量PCR检测方法及试剂，选取了与目的RNAcDNA大小相近的质粒作为竞争模板对基因拷贝数进行量化。选取不同的模板分别对fRNA和trRNA进行检测。
[0067]参见图2，本发明提供的乙型肝炎病毒的定量PCR检测方法，包括以下操作:
[0068]待检测对象的处理，主要是RNA的提取:
[0069]每例采集静脉血5ml,立即注入DNase和RNase灭活的试管中，4°C 2000g离心lOmin，取上清液于另一试管中再次离心，获取2_3ml血清；
[0070]使用高纯度病毒核酸提取试剂盒提取试剂，操作严格按照试剂盒操作说明，仅将Poly⑷替换为rRNA:
[0071]将200μ1 含有 rRNA (0.0Ol % )的裂解缓冲液(Binding buffer:6Mguandine-HCl, IOmM 尿素，IOmM Tris-HCl, 20 % Triton X-100, PH4.4)与 200 μ I 血清混合，随即加入蛋白酶Κ50μ 1(0.18% )，充分混匀后于72°C孵育lOmin。加入100 μ Iisopropanol p.a.,混匀后移入带有玻璃纤维丝膜的离心套管中，8000g离心lmin。随后依次用抑制因子清除缓冲液(Inhibitor Removal Buffer: 5M guanidine-HCl, 20mMTris-HCl, PH6.6)和洗涤缓冲液(Washing buffer:20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, PH7.5)清洗，7000g离心，最后用50 μ I洗脱液将核酸洗脱。
[0072]DNA 的消化:16.0μ I 核酸提取物，2.0μ I DNase I buffer (200mM Tris-HClPH8.4, 20mM MgCl2), 2.0 μ I DNase I(lU/y I), 25 °C 孵育 15min 后力卩 Λ 2μ 125mMEDTA，65°C孵育lOmin,终止反应。
[0073]I)第一轮单管 RT/PCR 系统(Titan One Tube RT/PCR System, Roche)
[0074]参见图2，fRNA 以 1434+，1806a，1808a 为引物，19L27 (对应序列 1689-1746，有一 58bp删除区间)为竞争模板；trRNA以1445+，1683a-为引物，J166(16)(对应序列1445-1656+71bp)为竞争模板在扩增体系中进行进行半巢式扩增。引物序列分别为:
[0075]1434+: TCTCATCTGCCGGACCGTGT
[0076]1806a:⑴ 15AGCTC
[0077]1808a: (T) 15GAAGC
[0078]1445+: GGACCGTGGCACTTCGCTT
[0079]1683a: (T) 15CGTGG
[0080]竞争模板克隆的HBVcDNA位点为:
[0081]19L27:4-1808+(T) 151, 4
[0082]J166(16):1445_1656+71bpl, 5 [0083]fRNA50ul RT/PCR 反应体系包括:
[0084]14.0μ I Η20, 10.0 μ I 核酸提取物，1.0 μ I 竞争模板 19L27，1.5 μ I 弓丨物1434+(100ng/y I) ,3.0μ I 引物 1806a (IOOng/μ I)，3.0 μ I 引物 1808a (lOOng/μ I)，5.0 μ IdNTP(IOmM), 2.5 μ I DTT 溶液(IOOmM)，10.0 μ 15*RT/PCR buffer (7.5m MMgCl2，DMSO)，1.0 μ I Enzyme 混合物。
[0085]trRNA50u I RT/PCR 反应体系包括:
[0086]17.Ομ I Η20，ΙΟ.Ομ I 核酸提取物，Ι.Ομ I 竞争模板 J166(16)，1.5y I 引物1445+(100ng/y I)，3.Ομ I 引物 1683a (lOOng/μ I), 5.Ομ I dNTP (IOmM), 2.5 μ I DTT 溶液(IOOmM), 10.Ομ 15*RT/PCR buffer (7.5m M MgC12, DMSO)，1.0 μ I Enzyme 混合物。
[0087]RT/PCR 程序为:
[0088]PCR 试管 50 0C 孵育 20min, 93 °C 变性 lmin40sec ；DNA 扩增为900C 40sec, 53°C 50sec, 70°C 40sec, 35 个循环，70°C 15min 后冷却至 4°C。
[0089]2)第二轮PCR系统
[0090]参见图l，fRNA cDNA 以 1464+，1806a-，1808a-为引物；trRNA cDNA 以 1464+，1683a为引物。引物序列为:
[0091 ] 1464+: TCACCTCTGCACGTCGCATG
[0092]1683a: (T) 15CGTGG
[0093]fRNA第二轮反应体系包括:31.Ομ I H2O, 5.0 μ I第一轮PCR扩增产物，0.75 μ I弓 I 物 1464+ (lOOng/ μ I)，0.75 μ I 引物 1806a-(lOOng/ μ I)，0.75 μ I 引物 1808a-(lOOng/μ I), , 5.0μ I dNT P (IOmM), 1.5μ I MgCl2 溶液(50mM)，5.0 μ I PCR buffer (200mMTris-HCl PH8.4, 500mM KCl), 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶(5U/yl，Life Technologies)。
[0094]trRNA第二轮反应体系包括:31.75 μ I H2O, 5.0 μ I第一轮PCR扩增产物，0.75 μ I引物 1464+(100ng/y I)，0.75μ I 弓 I 物 1683a(100ng/μ I)，5.0 μ I dNTP (IOmM)，1.5 μ IMgCl2 溶液(50mM), 5.0 μ I PCR buffer (200mM Tris-HCl ΡΗ8.4，500mM KCl), 0.25 μ I TaqDNA 聚合酶(5U/ μ I, Life Technologies)。
[0095]PCR程序为:PCR试管93 °C 变性lmin40sec ；DNA扩增为900C 40sec, 53°C 50sec, 70°C 40sec, 35 个循环，70°C 15min 后冷却至 4°C。
[0096]3)3%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物
[0097]在第二轮扩增完成之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，同时添加一定浓度的竞争模板作为对照；比较扩增产物与竞争模板条带的信号值，如果两者信号值相当则表明待测对象中fRNA、trRNA的浓度与竞争模板的浓度相当；如果两者的信号值不相当，则增加或稀释琼脂糖凝胶电泳时竞争模板的浓度，直到两者信号值相当为至。
[0098]用含有不同量竞争模板的PCR体系进行扩增和凝胶电泳，与目的条带信号值相同的竞争模板的量即与目的基因相同。
[0099]下面以具体的实施例对各部分进行详细的说明。
[0100]实施例
[0101]对拉米夫定治疗14周患者血清中fRNA，trRNA水平每周进行检测。
[0102]1)RNA 的提取
[0103]使用QIAGENE血清RNA提取试剂盒对患者RNA血清DNA进行提取。对浓度、OD260/OD280进行检测。
[0104]2)按照上述两轮扩增方法进行检测，其中在第二轮扩增后的凝胶电泳检测时，竞争模板上样量分别为100fg、10fg、lfg。[0105]3)电泳跑胶后将样本信号值与不同上样量的竞争模板的信号值进行比较，计算样本拷贝数。检测结果如图3所示。其中，图3A从左到右分别为DNA marker,含有4种不同量的竞争模板，不含竞争模板的结果。图3B前3列为不同量的竞争模板，后3列为只含trRNA,只含竞争模 板和只含DNA marker。
【权利要求】
1.一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作: .1)第一轮扩增 构建fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系: .14.0 μ I H20,10.0 μ I来自待检测对象的核酸提取物，1.0 μ I竞争模板19L27，1.5μ I浓度为IOOng/μ I的引物1434+，3.0μ I浓度为IOOng/μ I的引物1806a，3.0μ I浓度为 IOOng/μ I 的引物 1808a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0 μ I RNA 聚合酶； 所述的引物 1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ； 所述的引物1806a为:(T) 15AGCTC ； 所述的引物1808a为:(T) 15GAAGC ； 构建trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系: .17.0μ I H20,10.0μ I来自待检测对象的核酸提取物，1.0μ I竞争模板J166(16)，.1.5μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 1445+，0μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, .1.0μ IRNA聚合酶；
所述的引物 1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ； 将构建的fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系、trRNA第一轮50ulRT/PCR反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增: . 5(TC孵育 20min ;93°C变性 lmin40sec ;DNA扩增为 9(TC 40sec, 53°C 50sec, 70°C .40sec,.35个循环；70°C 15min后冷却至4°C ； .2)第二轮扩增 构建fRNA第二轮反应体系: .31.Ομ I H2O ; 5.Ομ I 第一轮 fRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1464+，.0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a-0,0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 .1808a-，.5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ I 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ ITaq DNA聚合酶； 构建trRNA第二轮反应体系: .31.75 μ I Η20，5.0μ I 第一轮 trRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物.1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ .1 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶； 所述的引物 1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ； 将构建的fRNA第二轮反应体系、trRNA第二轮反应体系分别按照以下RT/PCR程序进行半巢式扩增: . 93 O 变性 lmin40sec ;DNA 扩增为 90 °C 40sec,53 °C 50sec,70 °C 40sec，35 个循环；.70 °C 15min 后冷却至 4°C ； .3)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物 在第二轮扩增完成之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，同时添加一定浓度的竞争模板作为对照；比较扩增产物与竞争模板条带的信号值，如果两者信号值相当则表明待测对象中fRNA、trRNA的浓度与竞争模板的浓度相当；如果两者的信号值不相当，则增加或稀释琼脂糖凝胶电泳时竞争模板的浓度，直到两者信号值相当为至。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测方法，其特征在于，所述竞争模板克隆的HBVcDNA位点为:
19L27:4-1808+(T)151，4
J166 (16):1445-1656+71bpl, 5。
3.—种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下反应体系: fRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系: 14.0 μ I H20,10.0 μ I来自待检测对象的核酸提取物，1.0 μ I竞争模板19L27，1.5μ I浓度为IOOng/μ I的引物1434+，3.Ομ I浓度为IOOng/μ I的引物1806a，3.Ομ I浓度为 IOOng/μ I 的引物 1808a，5.Ομ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5 μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.Ομ I RNA 聚合酶； 所述的引物 1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ； 所述的引物1806a为:(T) 15AGCTC ； 所述的引物1808a为:(T) 15GAAGC ； trRNA第一轮50ul RT/PCR反应体系: 17.0μ I H20,10.Ομ I来自待检测对象的核酸提取物，1.Ομ I竞争模板J166(16)，1.5μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 1445+，0μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a, 5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，2.5μ I 浓度为 IOOmM 的 DTT 溶液，10.0 μ 15 X RT/PCR buffer, 1.0μ IRNA聚合酶； 所述的引物 1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ； fRNA第二轮反应体系:
31.Ομ I H2O ; 5.Ομ I 第一轮 fRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1464+，0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1806a-0,0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物 1808a-，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，1.5 μ I 浓度为 50mM 的MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ ITaq DNA聚合酶； 构建trRNA第二轮反应体系: 31.75 μ I Η20，5.0μ I 第一轮 trRNA 扩增产物，0.75 μ I 浓度为 lOOng/μ I 的引物1464+,0.75 μ I 浓度为 IOOng/μ I 的引物 1683a，5.0 μ I 浓度为 IOmM 的 dNTP，l.5μ I 浓度为 50mM 的 MgCl2 溶液，5.0 μ I PCR buffer, 0.25 μ I Taq DNA 聚合酶； 所述的引物 1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ； 所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG。
4.一种乙型肝炎病毒RNA定量PCR检测引物，其特征在于，包括以下引物: fRNA第一轮扩增用引物包括:引物1434+，引物1806a和引物1808a ； trRNA第一轮扩增用引物包括:引物1445+和引物1683a-； fRNA第二轮扩增用引物包括:引物1464+和引物1806a-； trRNA第二轮扩增用引物包括:引物1464+和引物1683a ；所述的引物 1434+ 为:TCTCATCTGCCGGACCGTGT ；所述的引物1806a为:(T) 15AGCTC ；所述的引物1808a为:(T) 15GAAGC ；所述的引物 1445+ 为:GGACCGTGGCACTTCGCTT ；所述的引物1683a为:(T) 15CGTGG ；所述的引物 1464+ 为:TCACCTCTGCACGTCGCATG ；所述的引物1683a为 :(T) 15CGTGG。
【文档编号】C12N15/11GK103981287SQ201410215921
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】张伟, 李艳红, 张佳瑞, 巩丽, 朱少君, 韩秀娟, 姚丽, 王姝妹 申请人:中国人民解放军第四军医大学