一种提高脂肪酶酯化活力及重复利用的方法
【专利摘要】本发明提供了一种油脂加工方法，该方法包括将油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化的步骤。该方法不需要对固定化载体进行额外的处理，只需将氯化钙添加入油脂中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作，而且能够明显提高液体脂肪酶的酯化活性，能够提高液体脂肪酶的重复利用次数，节约成本。
【专利说明】一种提高脂肪酶酯化活力及重复利用的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食用油脂加工领域，更具体地涉及脂肪酶用于油脂加工，特别涉及提 高液体脂肪酶酯化活力及重复利用的方法。
【背景技术】
[0002] 为了保证油脂在后期使用过程中无酸败味道，在煎炸过程中不会产生大量的油 烟，所以在油脂精炼过程中必须对油脂进行脱酸处理，从而使得油脂的各项指标符合国标 规定。因此对于高酸值油脂，在碱炼的过程中就必须加入大量的碱进行中和游离脂肪酸， 但是在加入碱之后在降低游离脂肪酸的同时会导致有益的微量成分大量损失，降低了其价 值，而且还能造成中性油的损失。
[0003] 对于高酸值油脂而言，如何将油脂中的游离脂肪酸降低而同时保留有益的微量成 分是一技术难题。以米糠油为例，由于米糠中存在脂肪酶，如果米糠不能及时处理，则米糠 中的油脂很容易被脂肪酶水解为游离脂肪酸，从而造成稻米油的酸价升高，酸价可以达到 15-80mgK0H/g，限制了稻米油的加工和利用。油脂工业中常用的碱炼脱酸和物理脱酸方法 用于高酸值米糠油都存在损耗过高的问题，化学精炼还会造成油脂中谷维素等营养成分的 大量损失，此外还将产生大量的有机废水，污染环境。
[0004] 对于含油大量游离脂肪酸的稻米油来说，能够将其中的游离脂肪酸酯化转变为甘 三酯是增加产量，提高其利用率的最佳途径。在酯化过程中，常用的酯化方法分为化学酯化 和生物酯化两种。由于化学酯化需要高温，对油脂中活性物质如维生素 E、留醇等破坏严重， 而且会产生大量污染环境的废水等，因此在实际生产中无法应用。而生物酯化是利用脂肪 酶的高效催化活性在低温情况下催化酯化，同时无废水产生。现在常用的脂肪酶为诺维信 公司的固定化脂肪酶Novozymes435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM，而这些固定化脂肪 酶在使用过程中主要是经济成本过高，不太适合用于高酸值油脂的生物脱酸过程。除了固 定化脂肪酶还有液体脂肪酶也可以用于高酸值油脂的生物酯化脱酸过程，对于液体脂肪酶 在酯化过程的应用有些学者也进行了研究。
[0005] Marchetti J M等公开了（Marchetti J M, Errazu A F. Comparison of different heterogeneous catalysts and different alcohols for the esterification reaction of oleic acid[J]· Fuel, 2008, 87 (15) :3477-3480.采用液体脂肪酶CALB (南极假丝酵母脂 肪酶B)进行催化油酸和醇的酯化反应，在这些反应较为容易的体系中经过25h的反应游离 脂肪酸的转化率为95%左右。但作者在结论中同时也指出，对于高酸值的油脂利用液体脂 肪酶进行酯化，由于无法重复利用而造成生产成本昂贵。
[0006] 由于液体脂肪酶CALB在使用过程中比较昂贵，因此有人研究将其固定化，降低生 产成本，例如：
[0007] Tufvesson P 等公开了（Tufvesson P，Tdmvall U，Carvalho J，et al. Towards a cost-effective immobilized lipase for the synthesis of specialty chemicals[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2011,68(2) :200-205.)将液体脂肪酶 CALB进行固定化的技术。Tufvesson P等选用粒径为250-500 μ m的载体MPlOOO分别用乙 醇（3ml/g)和磷酸钠缓冲液清洗后加入液体脂肪酶CALB，震荡搅拌8h后分离液体，再次用 缓冲液冲洗去除游离蛋白脂肪酶，然后在真空状况下干燥12h后得到成品。
[0008] CN101736000B中公开了一种提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法。其固定化方 法主要为：用lmol/L HCl将载体于室温下浸泡3h后水洗至中性，然后将Ig经预处理的固 定化载体加入30?50ml酶液中，于30°C、150rpm振荡吸附2h，过滤分离得湿固定化酶，于 4°C放置24h，在20?50ml极性有机溶剂中加入Ig湿固定化酶，于25?35°C、150rpm振荡 处理1?I. 5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4°C放置24h后得到成品。
[0009] 上述专利和文献通过各种工艺研究脂肪酶的酯化活性及提高利用率。但由于液体 脂肪酶在油脂的酯化过程中由于脂肪酶是水溶性蛋白质，而游离脂肪酸为油溶性物质，从 而造成二者不能完全接触，酯化活性低，反应时间太长；此外，为了提高脂肪酶的重复利用 率而采用的固定化技术对载体进行多次的化学处理，处理过程步骤多，过程繁琐，从而造成 生产效率低。
[0010] 因此，有必要对脂肪酶的酯化工艺加以改进。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种油脂加工方法，该方法不需要对固定化载体进行额外的处理， 只需将氯化钙添加入油脂中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作，而且能够明显提高 液体脂肪酶的酯化活性，能够提高液体脂肪酶的重复利用次数，节约成本。
[0012] 本发明提供方法包括以下步骤：
[0013] 将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高酸价 棕榈油。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三 醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单甘脂和/或甘 二酯。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或 Lipase TL100L。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523. 6-5236U/100g 油脂，优选加入 1570. 8-4188. 8U/100g 油脂。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 l-10wt%，，优选为加入2-8wt%，更优选为加入3-5wt%。
[0019] 本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、脂肪酶和氯化钙接触。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高酸价 掠桐油等。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三 醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单甘脂和/或甘 二酯。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或 Lipase TL100L。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523. 6-5236U/100g 油脂，优选加入 1570. 8-4188. 8U/100g 油脂。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 l-10wt%，优选为加入2-8wt%，更优选为加入3-5wt%。
[0025] 本发明还提供了一种脂肪酶组合物，该组合物包括脂肪酶与氯化钙。
[0026] 在本发明的一个实施方案中，以所述氯化钙的重量计，所述脂肪酶的加入量为 52. 36-5236U/g 氯化钙，优选为 26L 8-1570. 8U/g 氯化钙。
[0027] 本发明还提供了一种油脂加工方法，该方法包括将上述的脂肪酶组合物与所述油 脂和酰基供体接触，进行酯化。
[0028] 本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、上述的脂肪酶组合物接触。
【具体实施方式】
[0029] 为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下文结合实施例对本发明的优选 实施方式进行了更详细地说明。应当理解，这些说明仅为示例性的，而不应理解为以任何方 式对本发明构成限制。
[0030] 本文所公开的"范围"以下限和上限的形式，例如一个或多个下限与一个或多个上 限的形式给出。给定范围可通过选择一个下限和一个上限来进行限定，选定的下限和上限 限定了给定范围的边界。所有以这种方式限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可与 任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60-110和80-120的范围，理解为 60-120和80-110的范围也是可预料到的。此外，如果列出的下限为1和2而列出的上限为 3,4和5，则下面的范围都是可预料到的：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。
[0031] 在本文中，除非有其他说明，数值范围"a-b"表示a到b之间的任意实数组合的缩 略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围"0-5 "表示本文中已经全部列出了 "0-5 "之 间的全部实数，"0-5"只是这些数值组合的缩略表示。
[0032] 在本文中，除非有其他说明，术语"其组合"或"它们的组合"表示所列出的各选择 要素的任意组合，例如两种、三种、四种以及直到最大可能数量的选择要素的组合，如混合 物。
[0033] 如果没有特别指出，本说明书所用的术语"一种（个）"指"至少一种（个）"。
[0034] 在本文中，除非有其他说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以 相互组合形成新的技术方案。
[0035] 在本文中，除非有其他说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互 组合形成新的技术方案。
[0036] 在本文中，除非有其他说明，术语"包括"、"包含"、"含有"、"具有"和类似措词表示 开放式，但是也应当理解为同时明确公开了封闭式的情形。例如，"包括"表示还可以包含没 有列出的其他要素，但是也同时明确公开了仅包括所列出的要素的情形。
[0037] 在本文中，除非有其他说明，实施例中记载的具体步骤、具体数值以及具体物质可 与说明书其它部分的其他特征结合。例如，说明书
【发明内容】
或【具体实施方式】部分提到反应 的温度为10-KKTC，而实施例记载的具体反应温度为20°C，那么可以认为本文已经具体公 开了 10-20°C的范围，或者20-KKTC的范围，且该范围可以与说明书其它部分的其他特征 结合起来形成新的技术方案。
[0038] 本发明的发明人在研发过程中发现，在利用脂肪酶进行酯化过程中，普遍存在酯 化活性低，反应时间长，固定化步骤繁琐等缺点，因此，有必要对现有利用脂肪酶进行酯化 的方法进行改进。发明人通过研发发现，在利用脂肪酶进行油脂脱酸酯化过程中加入氯化 钙，不仅能够明显提高液体脂肪酶的酯化活性，而且能够提高液体脂肪酶的重复利用次数， 节约成本。同时该方法能够避免对固定化载体进行多久的处理，只需将氯化钙添加入油脂 中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作。
[0039] 基于此，发明人提供了一种油脂加工方法，该方法包括以下步骤：
[0040] 将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化。
[0041] 在本发明中，使用的油脂为动物油脂和/或植物油脂。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。
[0043] 在本发明的一个实施方案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉 籽油、高酸价鱼油、和/或高酸价棕榈油。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三 醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单甘脂和/或甘 二酯。
[0045] 在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或 Lipase TL100L。
[0046] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523. 6-5236U/100g油脂。发明人发现，当脂肪酶的加入量为1570. 8-4188. 8U/100g油脂时， 高酸价稻米油的利用率，保留稻米油的营养价值等方面的效果更为明显，因此，在本发明的 一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量优选为1570. 8-4188. 8U/100g 油脂。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 I-IOwt %，综合考虑酯化效率、生产操作等因素，氯化钙的加入量优选为加入2_8wt %，更优 选为加入3_5wt%。
[0048] 在本发明的一个实施方案中，所述油脂中游离脂肪酸与所述酰基供体的摩尔比为 5:1-1:2 优选为 3:1-1:1。
[0049] 本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、脂肪酶和氯化钙接触。
[0050] 在本发明中，使用的油脂为动物油脂和/或植物油脂。
[0051] 在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高酸价 棕榈油。
[0052] 在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三 醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单甘脂和/或甘 二酯。
[0053] 在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或 Lipase TL100L。
[0054] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523. 6-5236U/100g 油脂，优选加入 1570. 8-4188. 8U/100g 油脂。
[0055] 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 l-10wt%，优选为加入2-8wt%，更优选为加入3-5wt%。
[0056] 在本发明的一个实施方案中，所述油脂中游离脂肪酸与所述酰基供体的摩尔比为 4:1_1:2,优选为
[0057] 本发明还提供了一种脂肪酶组合物，该组合物包括脂肪酶与氯化钙。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，以所述氯化钙重量计，所述脂肪酶的加入量为 52. 36-5236U/g 氯化钙，优选为 261. 8-1570. 8U/g 氯化钙。
[0059] 本发明还提供了一种油脂加工方法，该方法包括将上述的脂肪酶组合物与所述油 脂和酰基供体接触，进行酯化。
[0060] 本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、上述的脂肪酶组合物接触。
[0061] 在本发明中，术语"油脂"具有本领域通常接受的含义，特别是表示植物或动物来 源的以高级脂肪酸甘油酯为主要成分的混合物，例如，可以包括但不限于，茶籽油、稻米油、 棉籽油、蓖麻油、玉米油、棕榈油、菜籽油、鲸鱼油、牛脂、奶油、大豆油、红花籽油、亚麻油、杏 仁油葵花籽油、芝麻油、玉米胚芽油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、猪油、鱼油等等。适 用于本发明工艺的油脂优选为高酸价油脂，例如可以包括但不限于高酸价稻米油、高酸价 棕榈油、高酸价鱼油、高酸价棉籽油等。
[0062] 在本发明中，术语"高酸价油脂"指的是采用国标GB/T5530-2005《动植物油脂酸 值和酸度测定》滴定法测得酸价大于等于5mgK0H/g，例如酸价高于2mgK0H/g的油脂，优选 酸价高于5mgK0H/g的油脂。在本发明中，"高酸价油脂"包括但不限于高酸价的稻米油、棕 榈油、鱼油、棉籽油、大豆油、菜籽油、茶油、葵籽油、玉米油等。
[0063] 在本发明中，术语"酰基供体"指的是含油羟基的烷烃类，例如，包括但不限于甲 醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇、苯酚等。 [0064] 在本发明中，术语"脂肪酶"指的是任何能够催化酯交换反应或酯化反应的酶，在 本发明中，术语"液体脂肪酶"指的是含有脂肪酶的液体，例如包括但不限于：包含脂肪酶的 溶液（例如商品化销售的脂肪酶酶活或其稀释液），表达脂肪酶的菌株或重组菌株的发酵 液、发酵上清液等。在本发明中，使用的脂肪酶可以使用菌株发酵表达的脂肪酶，例如包括 但不限于：假丝酵母南极脂肪酶（Candida antarctica lipase)、thermomyces lanuginosa 脂肪酶、突光假单胞菌脂肪酶（pseudomonas fluorescens lipase)、假单胞杆菌脂肪酶 (pseudomonas cepacia lipase) > chromobacterium viscosum 月旨肪酶、P. aeruginosa 月旨 肪酶、P. fluorescens 脂肪酶、Pseudomonas 脂肪酶、B. cepacia 脂肪酶、C. viscosum 脂 肪酶、Bacillus subtilis 脂肪酶、Achromobacter sp.脂肪酶、Alcaligenes 脂肪酶和 Serratia marcescens脂肪酶以及来自真菌的C.antarctica B脂肪酶和C.rugosa脂肪 酶等，也可以使用商品化销售的脂肪酶，例如包括但不限于：Lipase A〃Amano〃6、Lipase AY"Amano"30SD、Lipase G"Amano"50、Lipase R"Amano"、Lipase DF"Amano"15、Lipase MER"Amano"、Newlase F、Lipase CALB、Lipase PALATASE100L、或 Lipase TLlOOL 等。
[0065] 在本发明中，油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，既可以将油脂、酰基供体、月旨 肪酶、氯化钙一同混合，也可分别混合，例如，将油脂、酰基供体混合后，再与脂肪酶、氯化钙 一同混合；或使脂肪酶和氯化钙接触，然后再与油脂、酰基供体接触；或向油脂中分别加入 酰基供体、脂肪酶和氯化钙，也可采用本领域的技术人员所熟知或方便使用的方式，使油脂 与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触。
[0066] 在本发明中，酯化反应为酶法酯化，具体工艺为本领域的技术人员所熟知或可通 过实验确定。例如，在本发明的一个实施方案中，酯化反应的反应温度为30-KKTC，优选为 50-90°C。在本发明的一个实施方案中，酯化反应于真空度小于5000Pa条件下进行，优选在 小于3000Pa条件下进行，更优选在小于IOOOPa条件下进行。
[0067] 为了使表述更加简洁，在说明书中本发明的各种优选实施方式是分开单独描述 的，但是本领域技术人员可以理解，在不相矛盾的情况下，各优选实施方式的技术特征可以 重新组合形成其它的或者更进一步优选的实施方式，这些实施方式应当视为已经被本文明 确公开并且落入本发明的保护范围内。
[0068] 实施例
[0069] 以下通过实施例对本发明作了示例性的描述，应当理解这些实施例仅用于说明目 的而不构成对本发明的限制。
[0070] 在本发明的下述实施例中，使用的高酸值稻米油采用罗晓岚，朱文鑫.浸出米糠 油精炼工艺及难点分析[J].中国油脂，2008, 33(11) :57-60.的方法制备，经检测，其酸价 为28. 72mgK0H/g ;使用的原料稻米油通过市场购买获得。
[0071] 在本发明的下述实施例中，使用的CALB购自诺维信（中国）投资有限公司济南分 公司创新与发展中心。
[0072] 在本发明的下述实施例中，碱炼脱酸的具体方法为：取IOOg高酸价稻米油，搅拌 加热至80°C，然后在半小时内缓慢加入理论计算的浓度为10%的KOH溶液，之后在8000rpm 转速下离心分离皂脚和油脂，将分离的油脂水洗三次，然后干燥脱水即为碱炼脱酸稻米油。
[0073] 在本发明的下述实施例中，酸价的检测方法为：GB/T5530-2005《动植物油脂酸值 和酸度测定》；
[0074] 酯化率的计算方法如下：
[0075] 酯化率=(AVAV1VAV0
[0076] 其中：AVtl为酯化前AV !AV1为酯化反应后AV。
[0077] 在本发明的下述实施例中，CALB液体脂肪酶的酶活测定方法为丁酸丁醇法，具体 过程如下：
[0078] 底物：丁酸丁醇正庚烷混合物，其中丁酸浓度为0. 16M和丁醇浓度为0. 33M。
[0079] 底物配制方法：将 I. 35ml 丁酸（butyric acid)和 2. 7ml 丁醇（butanol)溶于 85. 95ml正庚烧（n-heptane)混勻即可。
[0080] 酯化反应过程
[0081] 取两个50ml具塞三角瓶，分别加入3ml上述底物，样品瓶加 50vl酶液，对照瓶不 力口。于50°C水浴，220rpm反应1小时，分别加 Iml甲醇终止，对照瓶补加 50vl酶液。分别 加 2-3滴酚酞溶液，用0. 02M NaOH滴定至淡粉红色。
[0082] 3，计算公式：酯化活力单位：μ mol/min. ml lipase
【权利要求】
1. 一种油脂加工方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化。
2. -种油脂酯化方法，其特征在于，在进行酯化前，将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和 氯化钙接触。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述油脂为高酸价油脂，所述高酸价油 脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油和/或高酸价棕榈油。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙 醇、丙三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单甘脂 和/或甘二酯。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为液体脂肪酶，优选为 Lipase CALB、Lipase PALATASE100L、和 / 或 Lipase TL100L。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入 量为 523. 6-5236U/100g 油脂，优选加入 1570. 8-4188. 8U/100g 油脂。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入 量为l-10wt %，优选为加入2-8wt %，更优选为加入3-5wt %。
8. -种脂肪酶组合物，其特征在于，所述组合物包括脂肪酶与氯化钙；优选的，以所述 氯化钙重量计，所述脂肪酶的加入量为52. 36-5236U/g氯化钙，优选为261. 8-1570. 8U/g氯 化钙。
9. 一种油脂加工方法，其特征在于，所述方法将权利要求8所述的脂肪酶组合物与所 述油脂和酰基供体接触，进行酯化。
10. -种油脂酯化方法，其特征在于，在进行酯化前，将所述油脂与酰基供体、权利要求 8所述的脂肪酶组合物接触。
【文档编号】C12P7/64GK104293840SQ201410229160
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】李磊, 孙周平, 洪丰, 王勇 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司