一种辣椒根rna提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种辣椒根RNA提取方法，属生物【技术领域】。本发明所解决的技术问题是提供了一种成本较低、效率较高的辣椒根RNA提取方法。本发明提取的辣椒根RNA的方法包括如下步骤：称取0.1g辣椒根，研磨后加入预热的裂解液和β-巯基乙醇，涡旋后水浴，加氯仿/异戊醇(24/1)离心，取上清加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)后再离心，加入沉淀剂沉淀后离心，乙醇洗涤并回收RNA。本发明操作简单，节约成本，能够很好的提取辣椒根RNA。
【专利说明】一种辣椒根RNA提取方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种辣椒根RNA提取方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]辣椒(Capsicum annuum L.)俗称“辣子”,是全世界消费量最大的蔬菜之一,我国是居全球之首的辣椒生产和消费大国，辣椒在近几十年其贸易量超过咖啡与茶叶。据不完全统计，全国辣椒播种面积已超过140多万公顷，产量2700万吨，实现产值270亿元，占据我国蔬菜作物种植面积的1/10之多。随着种植及消费变化，辣椒育种方向和目的不再单纯以追求产量、早熟要求为目标，而逐步转向优质、抗病、抗逆和适应特殊要求，诸如适宜保护地栽培耐低温、耐弱光、高产品种，适宜加工的加工型辣(甜)椒等。而选育抗逆、优质、抗病品种的首要关键是选育具备目标特性的辣椒种质资源，因此通过现代生物技术及育种手段，探索特异资源的遗传机理、选育理想的辣椒种质资源亲本材料，显得尤为重要和迫切。
[0003]目前对于辣椒的分子生物学研究正在深入，而RNA提取是分子生物学研究的基础，所以摸索一套适合辣椒根的RNA提取技术显的尤为重要。因为辣椒根中含有大量多糖和多酚，常规方法如Tr i Z01、改良Tr i z ο I等提取到的RNA质量不能满足试验要求，对辣椒的研究增加了困难。
【发明内容】
:
[0004]针对目前的现状及存在的问题，本发明所要解决的问题是提供一种成本较低、效率较高的辣椒根RNA提取方法，能够提取到高质量的RNA，为后续试验提供了良好的基础。
[0005]本发明提取辣椒根的方法包括如下步骤:一种辣椒根RNA提取方法，包括如下步骤:
[0006](I)取2ml离心管，加CTAB提取液lml，在65 - 70°C水浴中预热1min ；
[0007](2)液氮中研磨0.1g辣椒根；
[0008](3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β -巯基乙醇，裂解完毕后重新装入离心管，激烈涡旋30s，然后放回65 - 70°C继续水浴；
[0009](4)向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液并涡旋混合，在lOOOOrpm，4°C离心15min ；
[0010](5)将上清液转移至一新的离心管，重复抽提一次；
[0011](6)继续将上清液转移至另一新离心管中，再加入异丙醇，在4°C下沉淀2h;
[0012](7)然后在4°C，12000rpm条件下离心20 - 30min，振荡混匀分层后，再室温静置5~1min,弃上清液，用500 μ L70%乙醇洗沉淀,继续在4°C, 12000rpm条件下离心5min,然后再用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀I~2次；
[0013](8)弃上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。
[0014]优选地，所述的CTAB提取液的组成成分为100mmol/L Tris - HCl、20mmol/LEDTA - Na2、l.4mol/L NaCl、2% CTABU % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH 值为 8.0。[0015]优选地，步骤(3)中所述的β -巯基乙醇的加入量为30 μ L，水浴温度为65 -70°C，时间为4 - 5min。
[0016]优选地，步骤(4)中所述的氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
[0017]优选地，步骤(6)中所述异丙醇的加入体积为上清液体积的1/3。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为不用RNA提取方法的琼脂糖凝胶电泳比较结果图。A为Trizol法，B为改良Trizol法，C为本发明。
【具体实施方式】:
[0019]下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0020]一种辣椒根RNA提取方法，包括以下具体步骤:
[0021]试剂准备
[0022]1.2 X CTAB 提取缓冲液:100mmol/l Tris - HCl (ρΗ8.0)，20mmol/l EDTA - Na2,
1.4mol/l NaCl,2% CTAB(ff/V) ,1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)。即:配置 100ml2XCTAB提取缓冲液需加=Trisl.2114g，EDTANa2.2Η200.7444g，NaC18.1816g，PVPlg，加水 60ml，用4MHC1调pH至8.0，定容至1 00ml，加入CTAB2g，65°C水浴溶解。以上试剂均用RNase Free水配置，122。。灭菌20min ;氯仿/异戊醇为24:1(V/V)。
[0023]2.具体操作步骤
[0024](I)取2ml离心管，加CTAB提取液1ml，65 - 70°C水浴中预热lOmin。
[0025](2)液氮中研磨0.1g辣椒根。
[0026](3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β -巯基乙醇30 μ L，融化后重新装入离心管，激烈涡旋30s，放回65 - 70°C水浴。
[0027](4)加入等体积的氯仿/异戍醇并润旋混合，lOOOOrpm, 4°C离心15min。
[0028](5)将上清转移至一新。重复抽提一次。
[0029](6)将上清转移至一新离心管中，加入1/3上清体积冰冷的异丙醇，4°C下沉淀2h。
[0030](7) 4 V，12000rpm 离心 20 - 30min,弃上清，用 500 μ L70 % 乙醇洗沉淀，4 °C，12000rpm离心5min,然后用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀。
[0031](8)弃上清，吹干后用30 μ LDEPC水溶解RNA。
[0032]3.Trizol法提取辣椒根RNA
[0033](I)称取约0.1g辣椒根，在液氮环境下研磨成灰白色粉末后，加入ImL Trizol裂解液。
[0034](2)室温放置5min，待融化后迅速转至1.5mL离心管中，使核酸蛋白复合物完全分离。
[0035](3)4°C，12000rpm，离心10min，样品分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中。取上清(约500 μ L)，转入另一干净的1.5mL离心管中。
[0036](4)加入200 μ L氯仿，盖好管盖，涡旋混匀15s，室温放置2min。
[0037](5)4。。, 12000rpm,离心1min,取上清(约600 μ L)，转入1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，涡旋混匀15s。
[0038](6) 4°C, 12000rpm,离心10min。取上清(约400 μ L),转入1.5mL离心管中，加入
等体积冰的异丙醇，润旋混匀15s,室温放置lOmin。
[0039](7) 4°C, 12000rpm,离心1min (此时可能会出现沉淀)。弃上清，加入111^75%乙
醇，震荡片刻。
[0040](8) 4°C, 7500rpm,离心5min。弃上清，4°C, 7500rpm,高速离心Imin,用移液器移走残余溶液，室温倒置lOmin。
[0041](9)加入 30 μ L RNase - free 水溶解 RNA。
[0042]4.改良Trizol法提取辣椒根RNA
[0043](I)取1.5mL离心管，加入ImL Trizol裂解液、30 μ L β -巯基乙醇、30mg PVP,混匀，65 °C 水浴 15min。
[0044](2)称取0.1g辣椒根,在液氮条件下研成灰白色粉末后,迅速转入Trizol裂解液的离心管中，涡旋混匀。
[0045](3)65°C水浴15min，使核酸蛋白复合物完全分离，4°C，12000rpm，离心10min。其余步骤同Trizol试剂法。
[0046]试验结果如图1和表1所示。
[0047]表1不同RNA提取方法的RNA浓度和纯度
[0048]
【权利要求】
1.一种辣椒根RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取2ml离心管，加CTAB提取液1ml，在65- 70°C水浴中预热1min ； (2)液氮中研磨0.1g辣椒根； (3)将预热过的CTAB提取液加入到研钵中裂解，加入β-巯基乙醇，裂解完毕后重新装入离心管，激烈涡旋30s，然后放回65 - 70°C继续水浴； (4)向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液并涡旋混合，在10000rpm，4°C离心15min ； (5)将上清液转移至一新的离心管，重复抽提一次； (6)继续将上清液转移至另一新离心管中，再加入异丙醇，在4°C下沉淀2h； (7)然后在4°C，12000rpm条件下离心20- 30min,振荡混匀分层后，再室温静置5~1min,弃上清液,用500 μ 170%乙醇洗沉淀,继续在4°C, 12000rpm条件下离心5min,然后再用500 μ LlOO %乙醇洗沉淀I~2次； (8)弃上清，吹干后用30μ LDEPC水溶解RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CTAB提取液的组成成分为10mmoI/L Tris - HCl、20mmol/L EDTA - Na2U.4mol/L NaCl、2% CTABU % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，pH值为8.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的β-巯基乙醇的加入量为30 μ L，水浴温度为65 - 70°C，时间为4 - 5min。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述异丙醇的加入体积为上清液体积的1/3。
【文档编号】C12N15/10GK104031911SQ201410307733
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】孙国胜, 马志虎, 潘跃平, 戴忠良, 毛忠良, 孙春青, 吴国平, 王建华, 潘永飞, 张振超, 秦文斌, 姚悦梅 申请人:镇江瑞繁农艺有限公司