转录因子DksA基因的新用途
【专利摘要】本发明公开了一种转录因子DksA基因的新用途。Photorhabdus?luminescens?LN2中的dksA基因在调控P.luminescens?LN2菌落对色素吸收、P.luminescens?LN2的荧光蛋白产生量、P.luminescens?LN2菌落的粘性、P.luminescens?LN2对大蜡螟的毒力、P.luminescens?LN2对Heterorhabditis?bacteriophora?H06线虫的毒力、P.luminescens?LN2对H.indica?LN2感染期线虫的恢复中的应用。dksA突变对共生细菌LN2的生理生化特征产生明显影响。突变菌株LN2△dksA明显延迟LN2感染期线虫的恢复和怀卵；丧失了对非特异共生线虫H.bacteriophora?H06的毒性，且能支持H06线虫的生长繁殖；对大蜡螟的注射毒力显著降低；但未显著影响共生细菌的生长、LN2线虫的体外培养产量。
【专利说明】转录因子DksA基因的新用途
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及转录因子DksA基因的新用途。
【背景技术】：
[0002] 昆虫病原线虫是一种高效、安全的生物杀虫剂。昆虫病原斯氏属（Steinernema) 和异小杆属（Heterorhabditis)线虫分别与致病杆菌属（Xenorhabdus)和发光杆状菌 属（Photorhabdus)细菌共生（Forst and Clarke, 2002)。该两属共生细菌属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，革兰氏阴性，是致死昆虫的毒力因子。这类线虫规模化培养技术成 熟，被广泛应用于防治草坪、农林、花舟及牧草等害虫（Georgis et al.，2006 ;Kaya, 2006)， 在害虫综合治理方面发挥了显著作用（El-Borai et al.，2012)。
[0003] 种间特异杀线虫专化性即共生细菌能够产生杀线虫毒素致死非特异性共生线虫 的专化性（Han and Ehlers，2001)。这种种间杀虫作用使共生菌在自然环境下具有竞争优 势，对线虫之间的营养竞争也有重要的作用。共生细菌P. luminescens LN2产生的信号物 质能够诱导H. bacteriophora H06感染期线虫恢复，但LN2细菌能够分泌杀H06线虫的毒 素，使非特异共生线虫不能利用LN2细菌进行生长和繁殖（Han and Ehler，1998)。将共生 细菌上清过滤液无菌H06感染期线虫仍然具有毒性，且滤液经过80°C热处理后失去致死能 力（Han and Ehlers，1999)。预测至少有7种公认的蛋白（包括DsbA，HlpA，RhlE，RplC, NamB)和2种推定蛋白涉及LN2细菌对H06的杀虫作用（Qiu et al.，2012)。
[0004] P. luminescens LN2特有的杀线虫毒性相关基因 namA已被分离和鉴定。 P. luminescens LN2的namA突变体能支持H06线虫的生长与繁殖，丧失了对非特异共生的 H06线虫的致死作用（Qiu et al.，2009)。在大肠杆菌中表达该蛋白时，NamA重组蛋白对 H06感染期线虫无直接的杀虫毒性（丘雪红，2009)，所以namA基因对线虫的种间特异性杀 虫的毒性的分子作用机制仍有待研究。另外，namA基因是P. luminescens LN2所特有，这 说明每个共生菌菌株对非特异共生线虫的杀线虫活性可能由不同的基因控制，共生菌种间 特异的杀线虫机制仍有待深入研究。
[0005] DksA是和卷曲螺旋结构域一起结合到RNA聚合酶次级通道的的转录因 子（Stebbins, 1995 ;Perederina, 2004)。最近的研究结果表明，DksA能够消除本身 就存在的损伤以外的其它损伤（Tehranchi, 2010)，能够减少DNA复制过程的损伤 (Trautinger, 2005)。DksA是转录起始因子，它和ppGpp -起来调节rRNA和许多其它对饥 饿应激的基因的转录（Paul，2004)。另外，DksA也作用于转录起始复合物。在严谨条件下， 大肠杆菌基因表达谱的改变是RNA聚合酶（RNAP)，ppGpp和DksA相互作用的结果。ppGpp 和DksA都能使转录起到相反的效应，rRNA和tRNA以及细胞增殖有关的基因的表达显著下 调，同时耐受压力和饥饿的基因的表达上调（Kanjee，2012)。在存在DksA和提高ppGpp水 平时，转录既能激活也能钝化，激活和抑制取决于启动子的内在特性。在严谨反应中，dksA 基因的过量表达能够补偿信号素 ppGpp的缺失。最近的研究还发现，在昆虫病原线虫-共 生细菌体系中，P. luminescens LN2菌株的rpoB基因的缺失引起DksA蛋白下调，而且rpoB 基因缺失突变也引起共生细菌丧失杀线活性，所以dksA基因可能与线虫的杀线作用有关 (Qiu et al，2012)。因此研究dksA基因缺失对细菌与线虫共生关系的影响有重要意义。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供转录因子DksA基因的新用途。
[0007] 本发明通过实验发现，P. luminescens LN2中dksA基因突变的菌株具有以下性 质：
[0008] 1.突变菌株LN2 Λ dksA在菌落形态、菌落粘性、荧光、色素分泌等特征与野生型菌 株具有明显差异。
[0009] 野生型菌株LN2-A在NBTA板上呈现黄绿色，而突变株LN2 Λ dksA的菌落在NBTA 平板上呈深绿色而且突变菌株的菌落明显比野生型大，说明dksA基因的缺失导致了菌落 对色素的吸收。将培养了 48h的野生型菌株LN2-A和突变株LN2 Λ dksA菌液置于黑暗 中观察，发现两者都产生了荧光。将培养3d的LB平板上的野生型菌株LN2-A和突变株 LN2 Λ dksA菌落，在黑暗上观察荧光时发现LN2-A有强荧光，突变株LN2 Λ dksA的荧光很 微弱，说明dksA基因的缺失导致菌株荧光蛋白的产生量减少。野生型菌株LN-A和突变菌 株LN2 Λ dksA的菌落均具有粘性，但野生型的粘性强于突变菌株。而且在LB平板上培养 3d时野生型菌株的菌落颜色为深黄色，而突变菌株的颜色为微黄色。
[0010] 2. LN2 Λ dksA菌株对大蜡螟的注射毒力显著降低。
[0011] 野生型的注射毒力明显高于突变菌株。当注射浓度为100CFU和1000CFU野生型 菌株对大蜡螟的注射死亡率均显著高于突变菌株的注射毒力。互补菌株对dksA基因的缺 失有一定的补偿作用。
[0012] 3. dksA基因的敲除使P. luminescens LN2细菌失去对非特异共生线虫 H. bacteriophora H06的毒性，且能支持H06线虫繁殖。
[0013] 野生型菌株LN2-A与H06线虫共培养体系中，LN2菌株能够支持H06线虫恢复， 但是因为LN2菌株对线虫的毒力作用，不能产生大母虫和二代小虫。野生型菌株的死亡率 显著高于缺失突变菌株。突变菌株LN2 Λ dksA与H06线虫共培养体系的线虫怀卵比率 和怀小虫比率显著高于野生型菌株，说明缺失突变菌株已经丧失了部分杀虫活性，能够支 持H06线虫产生二代小虫。野生型菌株H06-H06线虫共培养体系中，线虫的怀小虫比率分 显著高于突变菌株的，说明突变菌株对虽然能够支持H06线虫的生长繁殖但是支持的效果 没有H06菌株好，野生型菌株H06与H06线虫共培养体系的线虫发育速度明显比突变菌株 LN2 Λ dksA快。突变菌株的互补菌株在IJ、RJ3、F4、AE和AJ和突变菌株均没有明显差异， 但是互补菌株的死亡率略高于突变菌株，说明互补菌株部分补偿了 dksA基因的缺失。
[0014] 结果表明：敲除dksA基因后，LN2菌对H06线虫的毒性减弱，且能产生二代小虫。 这说明dksA基因对共生细菌LN2对共生线虫的种间杀虫能力具有重要的调控作用。
[0015] 4. LN2 Λ dksA菌株显著延迟H. indica LN2感染期线虫的恢复和雌雄同体母虫的 怀卵。
[0016] 生物测定实验结果表明：野生型菌株LN2和H. indica LN2线虫组合培养时，LN2 线虫的生长发育明显比突变菌株LN2 Λ dksA和H. indica LN2线虫组合培养时线虫的生长 发育快。
[0017] 5. LN2 Λ dksA菌株不影响H. indica LN2线虫于海绵固体培养基中的产量。
[0018] 野生型菌株LN2-A和突变菌株LN2 Λ dksA和LN2线虫组合培养时，LN2线虫的产 量没有显著差异。所以dksA基因对组合培养时线虫的产量没有影响。
[0019] 因此，本发明提供 P. luminescens LN2 中的 dksA 基因在调控 P. luminescens LN2 菌落对色素吸收、Ρ· luminescens LN2的突光蛋白产生量、Ρ· luminescens LN2菌落的粘性、 P. luminescens LN2 对大錯螺的毒力、P. luminescens LN2 对 H.bacteriophora H06 线虫毒 力、P. luminescens LN2对H. indica LN2感染期线虫的恢复中的应用。
[0020] 本发明的P. luminescens LN2中的dksA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 898-1353位碱基所示。
[0021] dksA突变对共生细菌LN2的生理生化特征（色素、荧光等）产生明显影响。突 变菌株LN2 Λ dksA明显延迟LN2感染期线虫的恢复和怀卵；丧失了对非特异共生线虫 H. bacteriophora H06的毒性，且能支持H06线虫的生长繁殖；对大錯螟的注射毒力显著降 低；但未显著影响共生细菌的生长、LN2线虫的体外培养产量。由此可见，dksA基因在昆虫 病原线虫-共生细菌的共生关系方面具有重要功能。这些结果为研究这一共生体的共生性 和病原性的分子机理提供参考。
[0022] 本发明的P. luminescens LN2是现有技术中的细菌，公开于非专利文献： Qiu XH,Han RC,Yan X, Liu MX,Cao L,Yoshiga T,Kondo E.Identification and Characterization of a Novel Gene Involved in the trans-Specific Nematicidal Activity of Photorhabdus luminescens LN2[J]. Appl Environ Microb, 2009, 75(12):42 21-4223. 2009.该菌株 申请人:也持有，保证自申请日起20年内向公众提供。
【专利附图】
【附图说明】：
[0023] 图1是融合PCR的技术图解，其中1. P1和P2扩增基因的上游序列；2. P5和P6扩 增基因的下游序列；3. P3和P4扩增抗性标记基因 cat ;4.引物P2和P3、P4和P5分别在5' 末端有20bp的碱基反向互补，因而在进行融合PCR第一步扩增时的无引物扩增可以将cat 基因插入到基因的上下游同源臂间，形成融合片段。此时形成的融合片段较少，需要进行第 二步PCR反应；
[0024] 图2是dksA基因的上游序列和cat基因的PCR扩增，dksA基因的上游序列和cat 基因的PCR扩增；
[0025] 图 3 是融合 PCR 第二步，M. DL5000DNA Marker ;L dksA: :Cm 融合片段（2657bp);
[0026] 图4是dksA: :Cm融合片段阳性转化子鉴定，E DL2000DNA Marker ;l-9. dksA: :Cm(2858bp左右）基因转化子；10.为空白对照；
[0027] 图 5 是 pEASY?-Blunt-dksA: :Cm 质粒的 BamHI 和 spel 双酶切图谱，M. DL5000DNA Marker ;1 和 2pEASY?-Blunt-dksA: :Cm 双酶切（BamH I 和 spe I);
[0028] 图6是自杀质粒的单酶切和双酶切图谱，M. XHindlllDNA Marker ;l.pKNG101质 粒双酶切（BamH I和spe I ;2、3.分别为BamHI单酶切和spel单酶切；4. pKNGlOl质粒；
[0029] 图7是转化子质粒以及酶切鉴定图谱，Μ. λ Hind III DNA Marker ; I. pKNGlOl-dksA: :Cm 双酶切（BamH I 和 spe I) ;2. pKNGlOl-dksA: :Cm 质粒；
[0030] 图 8 是 PCR 转化子鉴定，M. DL5000DNA Marker ;1-16 为 dksA: :Cm 阳性转化子； 17LN2-W野生型对照；
[0031] 图9是菌株的生长曲线，注：四个菌株分别为野生型菌株LN2_A、dksA缺失突变菌 株LN2 Λ dksA、携带空的pLAFR3质粒互补对照菌株LN2 Λ dksA/PLA以及携带目的基因 dksA的pLAFR3质粒的互补菌株LN2 Λ dksA/PLA-dksA。该实验设置2个重复，图中数值为 各个时间点共生菌的〇D_的平均值；
[0032] 图10是共生细菌对H06感染期线虫生物测定，注：IJ表示感染期幼虫， RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示 怀卵成虫、AJ(adultwith juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫（RJ3+J4+AE+AJ)。图 中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（P < 0.05%);
[0033] 图11是共生细菌上清液诱导H. indica LN2感染期线虫恢复的生物测定，注：IJ表 示感染期幼虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、R(total recovery)表示恢复的线 虫。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（P < 0.05%);
[0034] 图 12 是突变菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A与H. indica LN2线虫共培养第一天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感 染期幼虫，RJ3(reC〇vered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼 虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫 (RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（p < 0. 05% )；
[0035] 图 13 是突变菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A与H. indica LN2线虫共培养第二天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感 染期幼虫，RJ3(reC〇vered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ (adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼 虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫 (RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（p < 0. 05% )；
[0036] 图 14 是突变菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A与H. indica LN2线虫共培养第三天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感 染期幼虫，RJ3(reC〇vered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ (adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼 虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫 (RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（p < 0. 05% )；
[0037] 图 15 是突变菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A与H. indica LN2线虫共培养第四天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感 染期幼虫，RJ3(reC〇vered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ (adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼 虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫 (RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（p < 0. 05% )；
[0038] 图16是突变株LN2-dksA及野生型LN2-A与H. indica LN2固体培养感染期线虫 产量，注：图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著（P < 0.05%)。
【具体实施方式】：
[0039] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0040] 实施例1 :
[0041] P. luminescens LN2细菌基因组的提取：按照常规方法提取P. luminescens LN2 细菌基因组DNA。
[0042] 2. 5. 5. 1、重组克隆载体 pEASYTM-Blunt-dksA: :Cm 的构建
[0043] 根据P. luminescens LN2的基因组测序结果中，获得dksA基因片段及其上下游基 因的碱基序列，由此设计特异性引物，以LN2基因组为模板扩增dksA基因上下游序列及标 记基因 cat。再通过融合PCR获得同源重组的融合片段dksA::Cm，该实验所设计的引物序 列如表1所示，重叠 PCR的原理如图1所示。
[0044] dskA基因序列及其上下游序列如SEQ ID NO. 1所示，其中第1-897位碱基为dskA 基因的上游序列，第898-1353位碱基为dskA基因序列，第1354-2241位碱基序列为dskA 基因的下游序列。
[0045] 表1 :片段扩增所需要的引物
[0046]
【权利要求】
1. Photorhabdus luminescens LN2 中的 dksA 基因在调控 P. luminescens LN2 菌 落对色素吸收、P. luminescens LN2的焚光蛋白产生量、P. luminescens LN2菌落的 粘性、Ρ· luminescens LN2 对大錯螟的毒力、Ρ· luminescens LN2 对 Heterorhabditis bacteriophora H06 线虫的毒力、P. luminescens LN2 对 H. indica LN2 感染期线虫的恢复 中的应用，所述的P. luminescens LN2中的dksA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 898-1353位碱基所示。
【文档编号】C12R1/01GK104195144SQ201410328197
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】丘雪红, 胡素丽, 韩日畴 申请人:广东省昆虫研究所