巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用,属于分子生物学【技术领域】，所述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；本发明提供了巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的特异性正反向引物，还提供了优化的PCR体系和扩增程序，通过对巴氏新小绥螨待测样本的该分子标记的分析，即可得知待测样本是对甲氰菊酯的敏感品系还是抗性品系。该方法操作简便快捷，检测特异性强、灵敏度高，可以随时监测捕食螨的抗药性，有利于“以虫杀虫”的生物防治策略，对于减少化学农药的使用、环境保护、果园可持续发展有重要意义。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种分子标记，尤其涉及一种巴氏新小绥 螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用。 巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用 【背景技术】
[0002] 巴氏新小绥螨属蜱螨亚纲，寄螨目，革螨亚目、植绥螨科，小新绥螨属，因其发育历 期短、死亡率低、产卵率高、扩散力强的优点被认为是最好的生物防治天敌之一。巴氏新小 绥螨是多食性捕食螨，除了捕食叶螨和蓟马外，还可以捕食蚜虫、木虱、粉虱、介壳虫、跳虫、 跗线螨、丝状菌和蚊蝇类的幼虫等。
[0003] 以甲氰菊酯为代表的菊酯类农药是目前果园使用较为广泛的杀虫杀螨剂，已有研 究表明，菊酯类农药对植绥螨的毒力较大，在使用过程中容易造成植绥螨的大量死亡，导致 害螨的大爆发。因此我们室内筛选获得抗药性巴氏新小绥螨，释放到果园后可以有效应对 农药胁迫，这对于该螨的田间释放与长期应用有很高的实用价值。然而从形态上很难鉴别 巴氏新小绥螨对甲氰菊酯的敏感品系和抗性品系。
[0004] 随着分子生物技术的发展及其广泛应用，分子标记被用来解决种类鉴定这个问 题。找到巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，对于区分巴氏新小绥螨对甲氰菊酯的 敏感品系和抗性品系具有重要意义。目前螨类对菊酯类杀虫剂的抗性产生普遍认为是由于 其靶标钠离子通道基因发生突变而导致的。
【发明内容】
[0005] 本发明根据巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感和抗性品系分类领域的空白，提供一种 巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记。
[0006] 本发明的另一目的是提供该分子标记在巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感品系和抗 性品系分类中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分 子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所不：
[0008]
【权利要求】
1. 巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 权利要求1所述分子标记在巴氏新小绥螨对甲氰菊酯敏感品系和抗性品系分类中 的应用。
3. 扩增权利要求1所述分子标记的特异性正反性引物，其特征在于：所述引物序列如 下： F :5' -CAACCTTTCACAGGCCAATC-3' ； R :5' -TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3'。
4. 一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的检测方法，其特征在于：PCR扩增 体系中采用的特异性正反向引物是根据权利要求1所述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的 分子标记的核苷酸序列设计的，所述特异性正反向引物扩增的区域在该标记的核苷酸序列 上，该方法先提取待测巴氏新小绥螨的总RNA，将总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板用 所述特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的钠离子通道基因片段，将得到 的基因片段与上述巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记进行序列比对，即可判断该品 系是对甲氰菊酯的敏感品系还是抗性品系，所述特异性正反向引物为： F :5' -CAACCTTTCACAGGCCAATC-3' ； R :5' -TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3'。
5. 根据权利要求4所述的一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的检测方法， 其特征在于：所述PCR体系为：PCR Master Mix25yL，正反向引物各2yL，待测样本cDNA 模板50?lOOng，补充ddH20至50 μ L。
6. 根据权利要求4或5所述的一种巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性的分子标记的检测方 法，其特征在于：所述PCR扩增的程序为：94°C预变性3min，然后94°C变性30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35个循环，最后72°C延伸5min。
【文档编号】C12Q1/68GK104109668SQ201410350374
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】冉春, 于士将, 陈飞, 刘浩强, 田慧霞, 杨涓 申请人:中国农业科学院柑桔研究所