一种利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用餐厨垃圾发酵制备的饲用二十二碳六烯酸(DHA)添加剂及其制备方法，所述饲用DHA添加剂是由产DHA菌株的发酵液喷雾干燥获得，所得饲用DHA添加剂的DHA含量较高。制备方法如下：将餐厨垃圾经过预处理、分段酶解后，得到酶解复合物，其中酶解复合物离心后的沉淀物可以制成饲料蛋白粉，酶解复合物离心后的酶解上清液可制成发酵培养基，经高压灭菌后接种产DHA菌株进行发酵，得到发酵液，发酵液经过添加抗氧化剂和或絮凝剂后，可得到饲用DHA添加剂。本发明所使用的餐厨垃圾酶解液能够同时替代培养基中的碳源、氮源，降低了培养基的生产成本，进而极大降低了饲用DHA添加剂的生产成本，同时实现餐厨垃圾的资源最大化利用。
【专利说明】一种利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及饲料加工领域和餐厨垃圾资源化利用【技术领域】，特别涉及一种利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的不饱和脂肪酸，可作为营养成分与饲料抗氧化剂混合作为饲用添加剂。饲料中DHA的添加对动物的生长发育、改善健康与防治疾病具有重要作用。
[0003]目前DHA的商业来源主要是深海鱼油。但鱼油中DHA含量较低，且日益匮乏的海洋资源难以满足对DHA的市场需求。近年来，利用微生物发酵法生产DHA受到了广泛关注。培养基是发酵的基础，对微生物的生长和DHA积累具有重要影响，而发酵培养基成本约占DHA生产成本的30%左右，因此寻找来源广泛、廉价的培养基原料，是降低饲用DHA添加剂生产成本的直接途径之一。专利CN101824442B、CN103614427A所用的豆柏水解液、秸杆酶解液仅能部分替代发酵培养基中的氮源或碳源，降低培养基生产成本的效果不显著。
[0004]因此，有必要提供一种低成本的饲用DHA添加剂及其制备方法。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂及其制备方法。
[0006]第一方面，本发明提供了一种利用餐厨垃圾制备饲用二十二碳六烯酸(DHA)添加剂的方法，包括以下步骤:
[0007](I)预处理:取餐厨垃圾，去除其中不能作为饲料的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾，将所述除杂后的餐厨垃圾粉碎处理后加水稀释，再经均质处理得到匀浆液；
[0008](2)分段酶解:第一酶解阶段:将步骤(I)中所述匀浆液加热至70?100°C，力口入α -淀粉酶酶解，得到第一酶解产物；第二酶解阶段:待所述第一酶解产物冷却到50?60°C后，加入糖化酶、蛋白酶和纤维素酶进行复合酶解，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和酶解上清液；
[0009](3)发酵培养基制备:取步骤⑵所述酶解上清液，添加葡萄糖、无机盐和海水晶，得到发酵培养基，调节所述发酵培养基的糖浓度和PH值；
[0010](4)接种发酵:将步骤(3)所述发酵培养基进行高压灭菌后，接种DHA菌株到发酵罐进行液态发酵，通气、搅拌下发酵5?7天，收获发酵液；
[0011](5)喷雾干燥:发酵结束后，在步骤(4)所述发酵液中添加抗氧化剂或在步骤(4)所述发酵液中添加抗氧化剂和絮凝剂，经过喷雾干燥，制得所述利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂。
[0012]如本发明所述的，步骤(I)中，所述餐厨垃圾是以糖类、蛋白质和脂肪为主要营养成分的且未变质的剩饭剩菜。
[0013]优选地，所述步骤(I)中，所述餐厨垃圾的含水率为60?90%。
[0014]优选地，所述步骤(I)中，所述餐厨垃圾的总固形物(TS)质量分数为10?30%。
[0015]优选地，所述步骤(I)中，所述餐厨垃圾的挥发性固体(VS)的质量分数(VS/TS)为70?95%，盐分含量为0.5?2.5%。
[0016]优选地，所述步骤(I)中，所述餐厨垃圾的干基中各化学组成为:总糖20?70%，蛋白质10%?30%，粗脂肪10?25%，粗纤维2?15%，灰分5?15%。
[0017]如本发明所述的，步骤(I)中所述不能作为饲料的杂物包括纸张、玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头和牙签中的一种或多种。
[0018]如本发明所述的，加水稀释除杂后的餐厨垃圾，所述除杂后的餐厨垃圾与所加水的体积比为1:1?2。
[0019]如本发明所述的，稀释后的餐厨垃圾，再采用均质机进行均质处理得到匀浆液。所述勻衆液中物料的粒径小于10mm。
[0020]优选地，所述匀浆液中物料的粒径小于等于5mm。
[0021]如本发明所述的，步骤(2)分段酶解中，优选地，所述第一酶解阶段，匀浆液中每克餐厨垃圾添加α -淀粉酶8?18U，所述第二酶解阶段，匀浆液中每克餐厨垃圾添加糖化酶100?300U、蛋白酶15?35U、纤维素酶10?20U。
[0022]如本发明所述的，酶活力单位U的定义:lUa-淀粉酶的酶活力定义为在温度70°C, pH为6.0条件下，Imin内水解Img可溶性淀粉所需要的酶量;1U糖化酶的酶活力定义为Ig固体酶(或Iml液体酶)，在40°C，pH为4.6的条件下，Ih水解可溶性淀粉产生Img葡萄糖所需的酶量；1U蛋白酶的酶活力定义为40°C，pH为7.0条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸所需要的酶量；1U纤维素酶的酶活力定义为在50°C、pH为4.8的条件下，Ih水解羧甲基纤维素产生Img葡萄糖所需的酶量。
[0023]如本发明所述的，第一酶解阶段是在较高温度下进行，一方面高温可以改变餐厨垃圾物料颗粒的微观结构，增加淀粉、多糖、蛋白质等营养物的溶出与降解，以便对餐厨垃圾进行资源最大化利用；另一方面，淀粉在高温下溶胀、分裂成均匀糊状溶液(称为糊化)，而α -淀粉酶对糊化后的淀粉更易于进行水解，而对未糊化的淀粉水解作用很低。
[0024]优选地，所述步骤⑵中，所述第一酶解阶段的酶解温度为70?100°C，酶解时间为 50 ?10min0
[0025]在此条件下，α -淀粉酶在高温下的活性及淀粉的糊化程度均较高，α -淀粉酶可使淀粉水解生成小分子糊精和其他低聚糖，糊精、低聚糖会在后续糖化酶的作用下生成葡萄糖。
[0026]第二酶解阶段中，由于糖化酶的作用随温度升高而活力增大，超过65°C又随温度升高而活力急剧下降，同时纤维素酶的最适温度也在45?55°C，为了使糖化酶、蛋白酶、纤维素酶等的酶活性都较高，优选地，所述步骤(2)中，所述第二酶解阶段的酶解温度50?60°C，酶解时间为2?6h。
[0027]如本发明所述的，所述步骤(2)中，所述沉淀物经过干燥、灭菌处理后，可制备得到饲料蛋白粉。
[0028]本发明所用的产DHA菌株为海洋真菌，适宜于生长在海洋环境里。海水晶是海水及盐化工的产物，保留了海水的主要成分。在酶解上清液中选择地加入含Mg、K等无机盐及海水晶，所得培养基的盐度、无机盐、PH值与海洋相似，菌株的生长和DHA积累情况较好，生物量、油脂含量、DHA产量也会有较大提高。
[0029]如本发明所述的，所述步骤⑶中，所述无机盐包括MgSO4.7Η20、ΚΗ2Ρ04。
[0030]更优选地，所述无机盐包括1.0 ?5.5g/L MgSO4.7H20、1.5 ?10.0g/L KH2PO4。
[0031]如本发明所述的，所述步骤(3)中，所述海水晶的浓度为0.5?2.5%。
[0032]如本发明所述的，所述步骤(3)中，调节pH值是采用HCl和NaOH溶液。
[0033]优选地，所述发酵培养基的pH值调节为5.0?8.0。
[0034]更优选地，所述发酵培养基的pH值调节为6.0。
[0035]如本发明所述的，产DHA菌株的菌体生长需要较高浓度的葡萄糖，而酶解上清液中的葡萄糖有可能无法完全满足菌体生长需要，需要适当添加葡萄糖。
[0036]优选地，添加葡萄糖，以调节所述发酵培养基的糖浓度为80?100g/L。
[0037]所述发酵培养基的糖浓度的检测方法为DNS (3，5- 二硝基水杨酸)法。
[0038]如本发明所述的，步骤(4)中，优选地，所述产DHA菌株为裂殖壶菌(Schizochytrium)和破囊壶菌(Thraustochytrium)中的一种或多种。
[0039]更优选地，所述产DHA菌株为裂殖壶菌Schizochytrium SR21菌株。
[0040]优选地，所述步骤(4)接种发酵过程，发酵温度为20?30°C。
[0041]更优选地，发酵温度为25?27°C。
[0042]优选地，所述步骤(4)接种发酵过程，发酵液的pH为5.0?8.0。
[0043]更优选地，发酵液的pH为6.0?6.2。
[0044]优选地，所述步骤(4)接种发酵过程，是采用分段液态发酵。第一发酵阶段，发酵罐中发酵液的通气比为1.5?2.0VVM，搅拌速度为200?400rpm。第二发酵阶段，发酵罐中发酵液的通气比为1.0?1.5VVM，搅拌速度为100?200rpm。
[0045]如本发明所述的，通气比是指每分钟通过单位体积发酵液的空气体积，即VVM。充足的氧气有助于DHA的合成和菌体的快速生长。机械搅拌和通气比可以调控发酵液中的溶氧量，同时使菌体和营养物质均匀分布，有利于不饱和脂肪酸的合成，提高菌体生长率。另有文献报道，降低溶解氧有利于裂殖壶菌积累二十二碳六烯酸。因此，本发明发酵前期，搅拌速度和通气比较大，溶氧充足使菌体生长更快；发酵后期，搅拌速度和通气比减小，溶氧限制刺激菌体积累DHA。
[0046]优选地，步骤(4)中所述接种发酵过程，还包括第一发酵阶段结束后，往发酵罐中补加浓缩的步骤(2)中所述酶解上清液，补加浓缩的步骤(2)中所述的酶解上清液到发酵罐中，使所述发酵罐中糖浓度为30?50g/L，当培养基中糖浓度低于5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0047]如本发明所述的，第一发酵阶段结束后，产DHA菌株的菌体生长达到稳定期，发酵罐中葡萄糖已经被大大消耗，这将会限制菌体生长，而稳定期也是DHA积累的重要时期，故可以向发酵罐中补加一定的营养物(即酶解上清液)以延长菌体的生长期及促进DHA的积累。同时为了维持发酵罐中的装液量基本不变，添加的是浓缩的酶解上清液。
[0048]如本发明所述的，DHA、EPA( 二十碳五烯酸)、虾青素等物质易氧化变质，因此在发酵液中添加抗氧化剂防止DHA等氧化变质。
[0049]优选地，步骤(5)中，所述抗氧化剂包括维生素E、乙氧基喹琳(EMQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或多种，所述抗凝剂包括壳聚糖、聚丙烯酰胺(PAM)、三氯化铁、硫酸铝、聚合氯化钙(PAC)和明矾中的一种或多种。
[0050]当向所述发酵液同时添加抗氧化剂和絮凝剂，可使产DHA菌株的菌体絮凝，便于离心分离得到藻泥，而菌体内发酵产生有DHA等营养物质，所得藻泥中含有DHA，再经过洗涤重悬后，喷雾干燥得到饲用DHA添加剂。
[0051]而当向所述发酵液只添加抗氧化剂时，菌体不会被絮凝，但发酵液中也含积累了DHA的菌体，经均匀混合后直接喷雾干燥，可得到饲用DHA添加剂。
[0052]第二方面，本发明提供了一种饲用二十二碳六烯酸(DHA)添加剂，所述DHA添加齐U，是按本发明第一方面所述的方法制备得到。
[0053]所述DHA添加剂中DHA的含量为13%?28%。
[0054]优选地，本发明所述饲用DHA添加剂为饲用DHA藻粉或饲用DHA蛋白质营养复合物。
[0055]当向所述发酵液同时添加抗氧化剂和絮凝剂，得到的饲用DHA添加剂为饲用DHA藻粉。
[0056]优选地，所述饲用DHA藻粉中DHA的含量为24.1 %?27.6%。
[0057]如本发明所述的，当向所述发酵液只添加抗氧化剂时，得到的饲用DHA添加剂为饲用DHA蛋白质营养复合物。
[0058]优选地，所述饲用DHA蛋白质营养复合物中，DHA的含量为13.4%?17.4%。
[0059]本发明的有益效果包括以下几个方面:
[0060]1.本发明以餐厨垃圾作为发酵制备饲用二十二碳六烯酸(DHA)添加剂的初始原料，能够同时替代培养基中的绝大部分碳源和全部氮源，降低了培养基生产成本，进而极大降低了饲用DHA添加剂的生产成本。
[0061]2.对餐厨垃圾进行分段复合酶解处理，可以最大限度地将餐厨废弃物中的营养成分降解成菌种能够直接利用的成分。
[0062]3.采用分段液态发酵工艺，有利于产DHA菌株的生长和DHA的积累。所得发酵液中生物量含量为65.3?87.9g/L，油脂含量为36.4?51.4g/L,DHA含量为16.6?24.9g/L0
[0063]4.本发明将富含DHA的发酵液加工成饲用DHA添加剂，所得饲用DHA添加剂的DHA含量高。同时制备工艺简单，所得产品附加值高，省去了传统方法制备DHA油脂过程中的有机试剂提取、甲酯化等工艺流程，生产成本更低。
【专利附图】
【附图说明】
[0064]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0065]图1是本发明生产方法的流程图。
【具体实施方式】
[0066]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0067]实施例1
[0068](I)预处理:从南方某科研单位食堂收集新鲜未变质的餐厨垃圾，人工辅助机器剔除玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头、牙签等无机或难生物降解的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾；用食品组织粉碎机对餐厨垃圾进行粉碎处理，并按1:1的体积比加水稀释，用均质机进行均质处理得到匀浆液，使匀浆液中物料的粒径在5mm以下；
[0069]本次使用的餐厨垃圾的含水率为72.1 %，TS为13.8%, VS/TS为86.4%，盐分为1.51%,餐厨垃圾的干基中各化学组成为总糖23.4%，蛋白质27.7%，粗脂肪19.4%，粗纤维 7.5%，灰分 9.3%。
[0070](2)分段酶解:将步骤⑴中匀浆液加热至80°C，加入α _淀粉酶15U/(g餐厨垃圾)，酶解lOOmin，得到第一酶解产物；待第一酶解产物冷却至55°C时，加入糖化酶300U、蛋白酶30U、纤维素酶20U/ (g餐厨垃圾)，酶解3h，得到酶解混合物；将酶解混合物于4000rpm离心lOmin，得到沉淀物和酶解上清液，所得固体沉淀物可脱水干燥制备成饲用蛋白粉。
[0071](3)发酵培养基制备:往酶解上清液中加入葡萄糖，使培养基中糖浓度为100g/L，同时添加2.5g/L MgSO4.7H20、6.0g/L KH2PO4等无机盐及1.0%的海水晶，调整发酵培养基的pH为6.0，在115°C下灭菌30min后待用；
[0072](4)接种发酵:将灭菌后培养基按活菌浓度为18?109cfu/ml的菌悬液、10% (v/
V)的接种量接种产DHA菌株-裂殖壶菌Schizochytrium SR21。分段液态发酵,发酵过程中控制发酵温度为25?27°C，发酵液的pH为6.0?6.2，发酵时间为7天。其中，第一发酵阶段(O?3天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.6VVM，搅拌浆转速为200rpm ;第二发酵阶段(4?7天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.2VVM，搅拌桨转速为160rpm。当发酵液中糖浓度降为50g/L时，开始流加浓缩酶解上清液，当培养基中糖浓度为5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0073](5)喷雾干燥:往发酵液中添加5.0g/L维生素E、0.15g/L乙氧基喹琳(EMQ)作为抗氧化剂，添加0.3g/L壳聚糖作为絮凝剂，絮凝40min后，离心得藻泥，将藻泥先后用生理盐水、蒸馏水洗涤干净，悬浮后直接进行喷雾干燥，进风温度180?190°C，出风温度80°C。喷雾干燥所得的粉末即为饲用DHA添加剂，快速真空包装，并避光存贮。
[0074]实施例1制备的饲用DHA添加剂为饲用DHA藻粉。
[0075]发酵结束后，测得发酵液中生物量、油脂含量及DHA占总脂含量分别为87.9g/L、
58.1% (51.lg/L)和 45.4% (23.2g/L)。
[0076]其中，发酵液离心、洗涤后，105°C干燥至恒重称量测定发酵液生物量；发酵液离心后得到湿菌体，加氯仿甲醇抽提后，干燥称量测定发酵液油脂含量；而抽提后的油脂，经甲酯化处理后，采用气相色谱可分析测定油脂中DHA含量。
[0077]所得饲用DHA藻粉的营养组成为(g/100g):蛋白质14.5%、粗脂肪56.6%、碳水化合物13.6%、灰分3.9%、水分6.3%，其中DHA含量为25.7%。
[0078]实施例2
[0079](I)预处理:从南方某科研单位食堂收集新鲜未变质的餐厨垃圾，人工辅助机器剔除玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头、牙签等无机或难生物降解的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾；用食品组织粉碎机对餐厨垃圾进行粉碎处理，并按1:2的体积比加水稀释，用均质机进行均质处理得到匀浆液，使匀浆液中物料的粒径在1mm以下；
[0080]本次使用的餐厨垃圾的含水率为63.3%, TS为17.4%, VS/TS为92.6%，盐分为1.21%,餐厨垃圾的干基中各化学组成为总糖44.3%，蛋白质20.1 %，粗脂肪9.7%，粗纤维 5.9%，灰分 8.5%。
[0081](2)分段酶解:将匀浆液加热至70°C，加入α-淀粉酶8U/(g餐厨垃圾)，酶解80min，得到第一酶解产物；待第一酶解产物冷却至55°C时，加入糖化酶100U、蛋白酶15U、纤维素酶1U/(g餐厨垃圾)，酶解4h，得到酶解混合物；将酶解混合物于4000rpm离心lOmin，得到沉淀物和酶解上清液，所得固体沉淀物可脱水干燥制备成饲用蛋白粉。
[0082](3)发酵培养基制备:往酶解上清液中加入葡萄糖，使培养基中糖浓度为100g/L，同时添加5.5g/L MgSO4.7H20、10.0g/L KH2PO4等无机盐及2%的海水晶，调整发酵培养基的pH为6.0，在115°C下灭菌30min后待用；
[0083](4)接种发酵:将灭菌后培养基按活菌浓度为18?109cfu/ml的菌悬液、15% (v/
V)的接种量接种产DHA菌株-裂殖壶菌Schizochytrium SR21。分段液态发酵,发酵过程中控制发酵温度为25?27°C，发酵液的pH为6.0?6.2，发酵时间为7天。其中，第一发酵阶段(O?3天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.8VVM，搅拌浆转速为250rpm ;第二发酵阶段(4?7天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.0VVM，搅拌桨转速为lOOrpm。当发酵液中还原糖浓度降为30g/L时，开始流加浓缩酶解上清液，当培养基中还原糖浓度为5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0084](5)喷雾干燥:往发酵液中添加0.10g/L乙氧基喹琳(EMQ)、0.25g 二丁基羟基甲苯(BHT)作为抗氧化剂，添加1.2g/L三氯化铁作为絮凝剂，絮凝30min后，离心得藻泥，将藻泥先后用生理盐水、蒸馏水洗涤干净，悬浮后直接进行喷雾干燥，进风温度180?190°C，出风温度80°C。喷雾干燥所得的粉末即为饲用DHA添加剂，快速真空包装，并避光存贮。
[0085]实施例2制备的饲用DHA添加剂为饲用DHA藻粉。
[0086]发酵结束后，测得发酵液中生物量、油脂含量及DHA占总脂含量分别为65.3g/L、55.7% (36.4g/L)和 45.6% (16.6g/L)。
[0087]其中，发酵液离心、洗涤后，105°C干燥至恒重称量测定发酵液生物量；发酵液离心后得到湿菌体，加氯仿甲醇抽提后，干燥称量测定发酵液油脂含量；而抽提后的油脂，经甲酯化处理后，采用气相色谱可分析测定油脂中DHA含量。
[0088]所得饲用DHA藻粉的营养组成为(g/100g):蛋白质13.2%、粗脂肪51.4%、总糖12.9%、灰分4.1 %、水分6.5%，其中DHA含量为24.1%。
[0089]实施例3
[0090](I)预处理:从南方某科研单位食堂收集新鲜未变质的餐厨垃圾，人工辅助机器剔除玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头、牙签等无机或难生物降解的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾；用食品组织粉碎机对餐厨垃圾进行粉碎处理，并按1:1的体积比加水稀释，用均质机进行均质处理得到匀浆液，使匀浆液中物料的粒径在1mm以下；
[0091]本次使用的餐厨垃圾的含水率为63.3%, TS为17.4%, VS/TS为92.6%，盐分为1.21%,餐厨垃圾的干基中各化学组成为总糖44.3%，蛋白质20.1 %，粗脂肪9.7%，粗纤维 5.9%，灰分 8.5%。
[0092](2)分段酶解:将匀浆液加热至90°C，加入α -淀粉酶18U/(g餐厨垃圾)，酶解60min，得到第一酶解产物；待第一酶解产物冷却至60°C时，加入糖化酶200U、蛋白酶35U、纤维素酶15U/(g餐厨垃圾)，酶解2h，得到酶解混合物；将酶解混合物于4000rpm离心lOmin，得到沉淀物和酶解上清液，所得固体沉淀物可脱水干燥制备成饲用蛋白粉。
[0093](3)发酵培养基制备:往酶解上清液中加入葡萄糖，使培养基中糖浓度为90g/L，同时添加1.5g/L MgSO4.7Η20、7.0g/L KH2PO4等无机盐及I %的海水晶，调整发酵培养基的pH为6.0，在115°C下灭菌30min后待用；
[0094](4)接种发酵:将灭菌后培养基按活菌浓度为18?109cfu/ml的菌悬液、8% (v/
V)的接种量接种产DHA菌株-裂殖壶菌Schizochytrium SR21。分段液态发酵,发酵过程中控制温度为25?27°C，pH为6.0?6.2，发酵时间为7天。其中，第一发酵阶段(O?3天)，发酵罐中发酵液的通气比为2.0VVM,搅拌浆转速为300rpm ;第二发酵阶段(4?7天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.5VVM，搅拌桨转速为lOOrpm。当发酵液中还原糖浓度降为40g/L时，开始流加浓缩酶解上清液，当培养基中还原糖浓度为5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0095](5)喷雾干燥:往发酵液中添加4.5g维生素E、0.12g/L乙氧基喹琳(EMQ)作为抗氧化剂，添加0.45g/L壳聚糖作为絮凝剂，絮凝30min后，离心得藻泥，将藻泥先后用生理盐水、蒸馏水洗涤干净，悬浮后直接进行喷雾干燥，进风温度180?190°C，出风温度80°C。喷雾干燥所得的粉末即为饲用DHA添加剂，快速真空包装，并避光存贮。
[0096]实施例3制备的饲用DHA添加剂为饲用DHA藻粉。
[0097]发酵结束后，测得发酵液中生物量、油脂含量及DHA占总脂含量分别为85.3g/L、60.2% (51.4g/L)和 46.5% (23.9g/L)。
[0098]其中，发酵液离心、洗涤后，105°C干燥至恒重称量测定发酵液生物量；发酵液离心后得到湿菌体，加氯仿甲醇抽提后，干燥称量测定发酵液油脂含量；而抽提后的油脂，经甲酯化处理后，采用气相色谱可分析测定油脂中DHA含量。
[0099]所得饲用DHA藻粉的营养组成为(g/100g):蛋白质13.5%、粗脂肪54.9%、总糖14.6%、灰分4.9%、水分5.9%，其中DHA含量为27.6%。
[0100]实施例4
[0101](I)预处理:从南方某科研单位食堂收集新鲜未变质的餐厨垃圾，人工辅助机器剔除玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头、牙签等无机或难生物降解的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾；用食品组织粉碎机对餐厨垃圾进行粉碎处理，并按1:1的体积比加水稀释，用均质机进行均质处理得到匀浆液，使匀浆液中物料的粒径在1mm以下；
[0102]本次使用的餐厨垃圾的含水率为72.1 %，TS为13.8%, VS/TS为86.4%，盐分为1.51%,餐厨垃圾的干基中各化学组成为总糖23.4%，蛋白质27.7%，粗脂肪19.4%，粗纤维 7.5%，灰分 9.3%。
[0103](2)分段酶解:将匀浆液加热至100°C，加入α-淀粉酶18U/(g餐厨垃圾)，酶解50min，得到第一酶解产物；待第一酶解产物冷却至50°C时，加入糖化酶150U、蛋白酶25U、纤维素酶15U/(g餐厨垃圾)，酶解4h，得到酶解混合物；将酶解混合物于4000rpm离心lOmin，得到沉淀物和酶解上清液，所得固体沉淀物可脱水干燥制备成饲用蛋白粉。
[0104](3)发酵培养基制备:往酶解上清液中加入葡萄糖，使培养基中糖浓度为85g/L，同时添加2.5g/L MgSO4.7Η20、5.0g/L KH2PO4等无机盐及1.5%的海水晶，调整发酵培养基的pH为6.0，在115°C下灭菌30min后待用；
[0105](4)接种发酵:将灭菌后培养基按活菌浓度为18?109cfu/ml的菌悬液、5% (v/
V)的接种量接种产DHA菌株-裂殖壶菌Schizochytrium SR21。分段液态发酵,发酵过程中控制发酵温度为25?27°C，发酵液的pH为6.0?6.2，发酵时间为7天。其中，第一发酵阶段(O?3天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.5VVM，搅拌浆转速为225rpm ;第二发酵阶段(4?7天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.2VVM，搅拌桨转速为135rpm。当发酵液中还原糖浓度降为45g/L时，开始流加浓缩酶解上清液，当培养基中还原糖浓度为5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0106](6)喷雾干燥:往发酵液中添加3.0g/L维生素E、0.10g/L乙氧基喹琳(EMQ)作为抗氧化剂，混匀后直接进行喷雾干燥，进风温度180?190°C,出风温度80°C。喷雾干燥得到的粉末即为饲用DHA添加剂，快速真空包装，并避光存贮。
[0107]实施例4制备的饲用DHA添加剂为饲用DHA蛋白营养复合物。
[0108]发酵结束后，测得发酵液中的生物量、油脂含量及DHA占总脂含量分别为74.6g/L、61.3% (45.8g/L)和 49.7% (22.7g/L)。
[0109]其中，发酵液离心、洗涤后，105°C干燥至恒重称量测定发酵液生物量；发酵液离心后得到湿菌体，加氯仿甲醇抽提后，干燥称量测定发酵液油脂含量；而抽提后的油脂，经甲酯化处理后，采用气相色谱可分析测定油脂中DHA含量。
[0110]所得饲用DHA蛋白营养复合物的营养组成为(g/100g):蛋白质12.8%、粗脂肪
59.9%、总糖11.9%、灰分5.0%、水分6.2%，其中DHA含量为13.4%0
[0111]实施例5
[0112](I)预处理:从南方某科研单位食堂收集新鲜未变质的餐厨垃圾，人工辅助机器剔除玻璃、陶瓷、塑料、金属、骨头、牙签等无机或难生物降解的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾；用食品组织粉碎机对餐厨垃圾进行粉碎处理，并按1:1.5的体积比加水稀释，用均质机进行均质处理得到匀浆液，使匀浆液中物料的粒径在1mm以下；
[0113]本次使用的餐厨垃圾的含水率为63.3%, TS为17.4%, VS/TS为92.6%，盐分为1.21%,餐厨垃圾的干基中各化学组成为总糖44.3%，蛋白质20.1 %，粗脂肪9.7%，粗纤维 5.9%，灰分 8.5%。
[0114](2)分段酶解:将匀浆液加热至90°C，加入α-淀粉酶18U/(g餐厨垃圾)酶解80min，得到第一酶解产物；待第一酶解产物冷却至55°C时，加入糖化酶200U、蛋白酶20U、纤维素酶15U/(g餐厨垃圾)，酶解6h，得到酶解混合物；将酶解混合物于4000rpm离心lOmin，得到沉淀物和酶解上清液，所得固体沉淀物可脱水干燥制备成饲用蛋白粉。
[0115]3)发酵培养基制备:往酶解上清液中加入葡萄糖，使培养基中糖浓度为80g/L，同时添加2.5g/L MgSO4.7Η20、5.0g/L KH2PO4等无机盐及I %的海水晶，调整发酵培养基的pH为6.0，在115°C下灭菌30min后待用；
[0116](4)接种发酵:将灭菌后培养基按活菌浓度为18?109cfu/ml的菌悬液、10% (v/V)的接种量接种产DHA菌株-裂殖壶菌Schizochytrium SR21。分段液态发酵,发酵过程中控制发酵温度为25?27°C，发酵液的pH为6.0?6.2，发酵时间为7天。其中，第一发酵阶段(O?3天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.8VVM，搅拌浆转速为400rpm;第二发酵阶段(4?7天)，发酵罐中发酵液的通气比为1.2VVM，搅拌桨转速为200rpm。当发酵液中还原糖浓度降为40g/L时，开始流加浓缩酶解上清液，当培养基中还原糖浓度为5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
[0117](5)喷雾干燥:往发酵液中添加4.0g维生素E、0.10g/L乙氧基喹琳(EMQ)作为抗氧化剂，混匀后直接进行喷雾干燥，进风温度180?190°C，出风温度80°C。喷雾干燥得到的粉末即为饲用DHA添加剂，快速真空包装，并避光存贮。
[0118]实施例5制备的饲用DHA添加剂为饲用DHA蛋白营养复合物。
[0119]发酵结束后，测得发酵液中的生物量、油脂含量及DHA占总脂含量分别为83.Sg/L、57.9% (48.5g/L)和 44.7% (21.7g/L)。
[0120]其中，发酵液离心、洗涤后，105°C干燥至恒重称量测定发酵液生物量；发酵液离心后得到湿菌体，加氯仿甲醇抽提后，干燥称量测定发酵液油脂含量；而抽提后的油脂，经甲酯化处理后，采用气相色谱可分析测定油脂中DHA含量。
[0121]所得饲用DHA蛋白营养复合物的营养组成为(g/100g):蛋白质15.5%、粗脂肪52.2%、总糖13.5%、灰分4.8%、水分6.0%，其中DHA含量为16.9%。
【权利要求】
1.一种利用餐厨垃圾制备饲用二十二碳六烯酸添加剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)预处理:取餐厨垃圾，去除其中不能作为饲料的杂物，得到除杂后的餐厨垃圾，将所述除杂后的餐厨垃圾粉碎处理后加水稀释，再经均质处理得到匀浆液； (2)分段酶解:第一酶解阶段:将步骤(1)中所述匀浆液加热至70?100°C，加入α -淀粉酶酶解，得到第一酶解产物；第二酶解阶段:待所述第一酶解产物冷却到50?60°C后，加入糖化酶、蛋白酶和纤维素酶进行复合酶解，得到酶解混合物；将所述酶解混合物进行离心，得到沉淀物和酶解上清液； (3)发酵培养基制备:取步骤(2)所述酶解上清液，添加葡萄糖、无机盐和海水晶，得到发酵培养基，调节所述发酵培养基的糖浓度和pH值； (4)接种发酵:将步骤(3)所述发酵培养基进行高压灭菌后，接种产二十二碳六烯酸菌株到发酵罐进行液态发酵，通气、搅拌下发酵5?7天，收获发酵液； (5)喷雾干燥:发酵结束后，在步骤(4)所述发酵液中添加抗氧化剂或在步骤(4)所述发酵液中添加抗氧化剂和絮凝剂，经过喷雾干燥，制得所述利用餐厨垃圾制备的饲用二十二碳六烯酸添加剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一酶解阶段，匀浆液中每克餐厨垃圾添加α -淀粉酶8?18U。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二酶解阶段，匀浆液中每克餐厨垃圾添加糖化酶100?300U、蛋白酶15?35U、纤维素酶10?20U。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，添加葡萄糖调节所述发酵培养基的糖浓度为80?100g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发酵培养基的pH值调节为5.0 ?8.0。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述产二十二碳六烯酸菌株为裂殖壶菌和破囊壶菌中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述接种发酵是采用分段液态发酵，第一发酵阶段，所述发酵罐中发酵液的搅拌速度为200?400rpm，通气比为1.5?2.0VVM，第二发酵阶段，所述发酵罐中发酵液的搅拌速度为100?200rpm，通气比为1.0?1.5WM。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述接种发酵过程，还包括，所述第一发酵阶段结束后，补加浓缩的步骤(3)中所述的酶解上清液到发酵罐中，使所述发酵罐中糖浓度为30?50g/L，当培养基中糖浓度低于5g/L时，发酵终止，收获发酵液。
9.一种饲用二十二碳六烯酸添加剂，其特征在于，所述饲用二十二碳六烯酸添加剂是如权利要求1?8中任意一项所述的方法制备得到。
10.如权利要求9所述的饲用二十二碳六烯酸添加剂，其特征在于，所述饲用二十二碳六烯酸添加剂为饲用二十二碳六烯酸藻粉或饲用二十二碳六烯酸蛋白质营养复合物；其中，所述饲用二十二碳六烯酸藻粉中二十二碳六烯酸的含量为24.1%?27.6%，所述饲用二十二碳六烯酸蛋白质营养复合物中二十二碳六烯酸的含量为13.4%?17.4%。
【文档编号】C12R1/645GK104342462SQ201410567962
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】梁岩, 刘春花, 徐芳芳 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院