一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株血清5型副猪嗜血杆菌菌株JX1002，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014127。该菌株生物学性能稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。CCTCC NO：M 201412720140410
【专利说明】一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物免疫领域，具体地说，涉及一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病（Glasser ' sdisease),由副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis, Hps)引起。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已 在全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因 之一。在美国，该病已成为危害保育猪群健康的重要传染病，与蓝耳病（PRRS)、圆环病毒 (PCV)并列为第一位，排在流感、链球菌和大肠杆菌病之前。该病目前也给中国猪群带来很 大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，蓝耳病）的流行，副猪嗜血杆菌病给猪群造成的 损失比以往更为严重，而爆发性的副猪嗜血杆菌病也比以往更为普遍。
[0003] Hps只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄?4月龄的猪，主要在断奶前 后和保育舍阶段发病，常见于5?8周龄，感染高峰通常见于保育期的4?6周，有些可早 在保育舍内最初2周时就开始出现，并一直持续到肥育期早期，发病率可达40%，严重时死 亡率可达50%。与以往相比，本病的流行特点已经发生改变。以前本病是零星散发发生的， 且与断奶猪的应激有关，但目前此病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势，呈现地方流行 性，而且常与猪的几种重要病原体并发感染，如与猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及 猪圆环病毒引起混合感染。
[0004] Hps是一种细小杆菌，在显微镜下呈多形态，非溶血性，不运动，无芽孢，无鞭毛，革 兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链状，在陈旧培养物中多呈多 形态，有长杆状和丝状。Hps属于需氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为35?37°C，pH7. 6? 7.8, C023%?5%。在适宜培养基上生长的菌落呈圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，灰白色 半透明，针尖大小。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）， 不需要X因子。在巧克力培养基上生长较差，在加 NAD、马血清的M96支原体培养基或加酵 母浸出物的PPLO培养基上生长良好。目前副猪嗜血杆菌至少有15种血清型，其中血清1、 5、10、12、13、14型毒力最强，2、4、8、15型具有中等毒力，3、6、7、9、11型不能引起临床感染。 从世界范围内看，血清4、5、13型最为流行，日本、德国、美国、西班牙、加拿大和中国以血清 4型和5型最常见，澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为血清5型和13型，但临床分离菌中约 20%无法定型。但最新的研究结果表明，危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改变，在 美国的猪场中血清5型不再广泛流行，而以血清4型（39%)和不能分型的分离株（27%) 最为流行。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。Hps毒力和致病性可能 与细菌毒素有关，但至今这方面的报道很少。副猪嗜血杆菌是否只产生巴氏杆菌科的一些 非常重要的毒力因子如荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及它们与本菌的毒力是否有关，目 前还知之甚少。
[0005] 我国是猪肉消费大国，猪肉的消费占总体肉食消费的80%以上，生猪价格的波动 会严重影响居民消费指数。目前曾严重影响我国养猪业的猪瘟、高致病性蓝耳病、猪圆环病 毒病等已经得到有效控制，但以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加 重。从而导致大量使用抗生素进行治疗，结果是：一方面导致猪产品抗生素超标，危害人的 身体健康，另一方面导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜血杆菌， 非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。国外研究 表明，用同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副猪 嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研究，显示了很好的防治效 果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效 预防本病的发生。血清5型副猪嗜血杆菌致病力较强，在世界范围内流行最广，在我国也流 行最广泛，引起的危害也最大。同为5型的不同副猪嗜血杆菌菌株毒力不同，免疫原性也不 同，所以，通过动物试验筛选出一株毒力强、免疫原性好的菌株是制备副猪嗜血杆菌灭活疫 苗的关键技术。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株毒力强、免疫原性好 的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明首先提供一株血清5型副猪嗜血杆菌株JX1002,分类命名为副猪嗜血杆 菌（Haemophilus parasuis)(血清5型）（Serovar5),已于2〇14年4月 10 日保藏于中 国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072,保藏编号CCTCC M 2014127。
[0009] 该菌株是发明人于2010年2月在江西省南昌市一猪场发病猪分离获得的一株副 猪嗜血杆菌，经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清5型。培养该菌株，经甲醛灭活，与适 宜的佐剂混合，制成单价灭活疫苗，使疫苗中含菌量为2. 5X 109CFU/mL。经动物试验表明， 该菌株是一株强毒株，对仔猪具有很强的致病力和很好免疫原性。
[0010] 所述血清5型副猪嗜血杆菌株JX1002与其他5型副猪嗜血杆菌比较具有如下生 物学特性：
[0011] 1.致病力强用该菌腹腔注射攻击16g?20g健康Balb/c小鼠，剂量为 5. OXlO9CFU/只，可导致80%以上小鼠死亡。用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易 感仔猪，剂量为5. 0 X IO9CFU/只，可导致100%以上仔猪发病或死亡。
[0012] 2.免疫原性好灭活该菌，与白油佐剂1 :2乳化制成灭活疫苗，使每毫升疫苗中 含灭活前活菌数为2. OX IO9CFU,接种2?3周龄健康易感仔猪，首免2周后，以相同剂 量再接种一次，二免3周后，用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易感仔猪，剂量为 5. OX IO9CFU/只，免疫组猪80 %保护，而对照组至少80 %仔猪发病或死亡。
[0013] 3.繁殖滴度高该菌的培养液OD值与活菌数大致呈现一种线性关系，经过拟合，得 到菌液OD值与活菌数关系曲线Y = (15. 244X-0. 1959) X IO8CFUAiL (R = 0. 9862)。通过菌 液OD值与活菌数的关系曲线，在确定菌液中活菌数时，可以很方便的通过测定菌液的OD值 而得到。
[0014] 本发明还提供了所述血清5型副猪嗜血杆菌菌株JX1002在制备防治由血清5型 副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
[0015] 本发明进一步提供一种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，包含前述菌株或由前述菌株 制备。所述疫苗可为单价或多价疫苗。
[0016] 当其为单价疫苗时，可针对性较强的防治由血清5型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜 血杆菌病；当其为多价疫苗时，也可有效的防治由血清5型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血 杆菌病。
[0017] 作为优选，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活前述菌株。
[0018] 作为优选，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为I. 0-5. 0X109CFU/mL。
[0019] 更为优选，所述单价疫苗的含菌量为2. OX 109CFU/mL。
[0020] 所述单价疫苗的制备方法为：培养前述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价 灭活疫苗。
[0021] 所述佐剂可为本领域制备疫苗时常规选用的任何佐剂，为了更好的提高疫苗的免 疫效果，所述佐剂选自白油、铝胶、206和GEL中的一种。
[0022] 本发明还进一步提供用于扩增所述菌株0mpA5基因的引物对，所述引物对的核 苷酸序列为：
[0023] 上游引物：0mpA5F : CCACAAGCTAACAC ;
[0024] 下游引物：OmpA5R :AACTTCTTTTGAACCT。
[0025] 0mpA5蛋白是副猪嗜血杆菌一个外膜蛋白，具有种属特异性，而不具有型特异性， 是副猪嗜血杆菌一个主要免疫蛋白。通过该引物可以检测所有型的副猪嗜血杆菌，不具有 血清型特异性。
[0026] 以及用于扩增所述菌株16S rRNA基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
[0027] 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'
[0028] 下游引物 R:5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。
[0029] 该引物对可用于检测本发明所述菌株。
[0030] 本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明提供的血清5型副猪嗜血杆菌JX1002生物学性能稳定，对仔猪具有很强的 致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全 性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免 疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其免 疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例2中副猪嗜血杆菌活菌数与0D_值的相关性曲线。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 实施例1血清5型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
[0035] 1.病原菌的分离
[0036] 用无菌接种环从疑似病猪新鲜的肺脏、心包积液、关节液等病料中取样，在TSA培 养基（含终浓度5%血清和0. 001 %的NAD)上划线接种，37°C培养24h?48h后观察生长 情况，对疑似菌落进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落，在TSA固体培养基上采取分区划线 法，进行3?5次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。
[0037] 2.病原菌的鉴定
[0038] 2. I NAD依赖性试验
[0039] 在II级生物安全柜中，用接种环挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无 NAD的 TSA平皿上，在挑去金黄色葡萄球菌垂直于水平划线，37°C培养24h?48h，结果出现了"卫 星生长现象"，即在葡萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。
[0040] 2. 2 镜检
[0041] 挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰 氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具 有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。
[0042] 2. 3生化鉴定试验
[0043] 在II级生物安全柜中，用接种环分别挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌 落，水平划线于新的TSA培养基上，于37°C培养14h?16h。刮取多个菌落（成团状最佳）， 分别接种尿素酶、氧化酶、硝酸盐还原、蛋白胨水（吲哚）、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半 乳糖、麦芽糖和〇NPG( β -半乳糖苷）等微量生化鉴定管中，并在每个微量生化鉴定管中加 入3 μ 1?5 μ 10. 1 % NAD，并设置对照管。于37°C培养24 h?48 h，观察并参照厂家说明 书判定试验结果。结果为半乳糖、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、尿素、0NPG、硝酸盐还原、尿素 酶、麦芽糖为阳性，而阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、乳糖、山梨醇、硫化氢、Π 引哚为阴性。生化结果 表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。
[0044] 2. 4 PCR 鉴定
[0045] 将待检菌株菌液12, 000r/min离心3min，弃去上清液后，用无菌DEPC水悬浮，在 振荡器上涡旋lmin，于沸水中水浴20min，取出后置于-20°C冰箱中冻结。冻融后12, OOOr/ min离心Imin,上清液即为模板DNA。
[0046] 参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物，对分离的疑 似HPS菌株进行PCR鉴定。
[0047] 上游引物 F :5' -GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'
[0048] 下游引物 R :5' -GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3'
[0049] PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0050] 以菌液DNA为模板，反应体系（25 μ 1)如下：
[0051]
【权利要求】
1. 一株血清5型副猪嗜血杆菌菌株JX1002,其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为：CCTCC M 2014127。
2. 权利要求1所述的血清5型副猪嗜血杆菌菌株JX1002在制备防治由血清5型副猪 嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
3. -种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述菌株或由权利 要求1所述菌株制备。
4. 根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活的权利要 求1所述菌株。
5. 根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为 1. 0 ?5. 0X109CFU/mL。
6. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的含菌量为2. 5X 109CFU/mL。
7. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法为：培养权利要求1 所述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价灭活疫苗。
8. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂选自白油、铝胶、206和GEL中的 一种。
9. 用于扩增权利要求1所述菌株的OmpA5基因的引物对，其特征在于，所述引物对的核 苷酸序列为： 上游引物：0mpA5F :CCACAAGCTAACAC ; 下游引物：0mpA5R :AACTTCTTITGAACCT。
10. 用于扩增权利要求1所述菌株的16S rRNA基因的引物对，其特征在于，所述引物对 的核苷酸序列为： 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'; 下游引物 R : 5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 '。
【文档编号】C12N1/20GK104388340SQ201410588441
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】李晓成, 邵卫星, 吴发兴, 张志 , 刘爽, 董雅琴, 李鹏, 王佳, 于美芳 申请人:中国动物卫生与流行病学中心