一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，属于酶工程【技术领域】。本发明采用基因重组技术将葡萄糖氧化酶556位点的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸，并转化入毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，经筛选鉴定得到一株较原有菌株耐氧化性提高的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶相比于对照酶，耐氧化性在不同浓度的H2O2处理后剩余酶活均有不同程度的提高，在100mmol·L-1和500mmol·L-1 H2O2存在下是对照酶的2倍。
【专利说明】一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，简称G0D)是生物领域中最主要的工具酶之一， 自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面将其应用于血糖测定以来，GOD 被广泛应用于食品饲料医药等相关领域。国内外对葡萄糖氧化酶的研究主要集中产该酶的 新菌株的筛选，菌株的定向改良以及发酵工艺的优化等方面。
[0003] 在食品工业中，由于氧的存在引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微 生物生长创造了条件。目前许多国家已将GOD作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食 品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于将葡萄糖氧化形成过氧化氢和 葡萄糖酸。利用其专一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析仪能快速准确简易地测定各种 食品中的葡萄糖含量指导生产。在医药工业中GOD作为试剂盒酶电极等用于血清（浆）尿 液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑牙垢和 龋齿的形成，防止口腔疾病和牙病的发生。此外由于可以催化生成H 2O2，还可用于对H2O2敏 感的淋巴瘤的导向目标的治疗。GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环 境调节饲料消化促进动物生长。含葡萄糖氧化酶乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加 剂可用于预防牲畜胃肠道感染腹泻并有促进动物生长作用。从动植物组织中提取GOD有一 定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉和青霉属菌株作为GOD生产 菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产G0D，日本常用尼奇青霉，俄罗斯用生机青霉。 近年报道胶霉属（Clioctadium)、拟青霉属（Paecilomyces)和帚霉属（Scopulariopsis)也 能生产G0D。葡萄糖氧化酶主要来源是黑曲霉，由于黑曲霉所产葡萄糖氧化酶酶活低、催化 效率低和杂蛋白较多而使得其在实际应用中有一定的局限性。
[0004] GOD反应过程中产生过氧化氢，使得该酶具有抗菌杀菌的作用，但是过氧化氢的积 累会抑制GOD的活性而影响其本身的催化效率。研究发现，当过氧化氢浓度达到30mM时就 会对GOD活性产生抑制作用。因此提高GOD对氧的耐受性事目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，其特征在于，编码所述葡萄糖氧 化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
[0006] 编码所述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
[0007] 所述葡萄糖氧化酶是以SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列为出发序列，将第556位 的甲硫氨酸M突变为亮氨酸L ;所得突变葡萄糖氧化酶分别命名为M556L。
[0008] 编码SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 所述发生突变的第556位的甲硫氨酸位于葡萄糖氧化酶的催化活性中心。
[0010] 本发明还提供一种表达所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌。
[0011] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是以毕赤酵母（Pichia pastoris) GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO. 4所示序列的基因的工程菌。
[0012] 所述基因工程菌的构建方法，在本发明的一种实施方式中，是将序列如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸片段连接到表达载体pPIC9K上形成重组载体，在将重组载体转化 P. pastoris GS115,即获得基因工程菌。
[0013] 本发明还提供一种利用所述基因工程菌发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在 于，包括：（1)将基因工程菌活化后培养至〇D_ = 1. 6-1. 7,作为种子液；（2)种子液接种于 基础发酵培养基，于28°C -30°C培养至0D_ = 1. 2-1. 5 ; (3)收集菌体，将菌体转入诱导培 养基培养，诱导产蛋白。
[0014] 所述基本发酵培养基，在本发明的一种实施方式中为BMGY培养基。
[0015] 所述诱导培养基为，在本发明的一种实施方式中为BMMY培养基。
[0016] 本发明还提供一种测定权利要求1所述葡萄糖氧化酶的耐氧化性的方法，其特征 在于，是将葡萄糖氧化酶采用无载体交联固定化技术进行固定化之后，将固定化酶于不同 浓度的H 2O2中处理，处理后离心、弃去上清，用缓冲液洗沉淀直到上清中无法检测到H2O 2，计 算经H2O2处理与不经H2O2处理的固定化葡萄糖氧化酶的酶活比值。
[0017] 本发明的有益效果：该菌株表达的葡萄糖氧化酶M556L相比于对照酶，耐氧化性 在不同浓度的H 2O2处理后剩余酶活均有不同程度的提高，经50-500mmol ^r1H2O2处理后，突 变酶M556L的酶活约为对照酶的2倍。本发明提供的葡萄糖氧化酶，其氧化稳定性显著提 高，在工业上具有重大应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1 :葡萄糖氧化酶蛋白电泳（SDS-PAGE) ;M :蛋白质分子量标准；1 :突变株M556L 产酶纯化后；2 :对照菌株产酶纯化后；
[0019] 图2 :对照酶与突变酶的耐氧化性比较。
【具体实施方式】
[0020] 葡萄糖氧化酶酶活测定方法：G0D活性测定采用邻-联（二）茴香胺分光光度法。 在有氧的条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶（POD)作用下，氧供体邻-联 (二）茴香胺（DH2)被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果 计算葡萄糖氧化酶活力单位。1个葡萄糖氧化酶活力（IU)定义为：在30°C、pH6. 0的条件 下，Imin将1 μ mol的β -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个葡萄糖氧 化酶酶活力单位。
[0021] 实施例1重组菌的构建及鉴定
[0022] 将核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的基因片段连接到pPIC9K构成重组质粒，以 该重组质粒为模板，定点突变获得含有序列如SEQ ID NO. 4所示的GOD基因的重组载体 PPIC9K-G0D。所用定点突变引物为M556L-F(序列如SEQ ID NO. 5所示）、M556L-R(序列如 SEQ ID NO. 6 所示）：
[0023] M556L-F :5'CCTCCTACGCAACTGTCGTCCCATG3' ；
[0024] M556L-R :5'GTACCCTGCTGTCAACGCATCCTCC3' ；
[0025] PCR反应体系：0. 2mLPCR管中按顺序加入以下试剂：5XFD PCR buffer 5μ I ; DNTP Mixture 2 μ I ;模板DNA 1 μ I ;上游引物各1 μ I ;phusion酶0· 5 μ I ;加双蒸水至终 体积为 25μ 1。5XFD PCR buffer 5μ I ;DNTP Mixture 2μ 1 ;模板 DNA 1μ 1 ;下游引物各 1μ I ;phusion酶0. 5μ I ;DMS0 1.5μ 1加双蒸水至终体积为25μ 1。反应5个循环后，将对 应PCR反应液混合，继续反应25个循环。PCR扩增条件：98°C预变性3min ;98°C变性15s ; 53°C退火30s ;72°C延伸I Imin (5个循环）；72°C延伸IOmin。混合后扩增条件：98°C变预变 性 3min ;98°C变性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin(25 个循环）；72°C延伸 lOmin。
[0026] 限制性内切酶DpnI消化后，化学转化法转化宿主菌JM109,转化菌液涂布在含有 氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养。最终获得分别含有突变氨基酸GOD基因的载体 PPIC9K-G0D。
[0027] 或者直接采用化学合成的方法获得序列如SEQ ID NO. 4所示的基因片段，并连接 表达载体PPIC9K形成重组质粒pPIC9K-G0D。
[0028] 重组质粒线性化后电转入Pichia pastorisGS115感受态细胞。具体转化方法为： 毕赤酵母的转化采用电转法：P. Pastoris GSl 15于50mL YPD中培养至OD6tltl = L 2-1. 5离 心收集细胞；依次用400mL冰冷的无菌水洗两次细胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗 一次细胞，重悬细胞于ImL lmol/L的山梨醇中。100 μ L原生质体与5-10 μ g线性化质粒 DNA (MSSI切）混合转入冰冷的lmol/L山梨醇稀释菌体后涂布于固体MD培养基。30°C培养 4-6天后挑取单克隆。筛选正确的转化子即为重组基因工程菌。
[0029] 实施例2高表达菌株的筛选
[0030] 分别制备含 0mg/mL、lmg/mL、I. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL 遗传霉素的 YPD 平板，将 MD培养基上的单克隆依次点板到不同浓度的Yro平板上培养48小时后，挑取形态较大的菌 落进行下一步的发酵培养。
[0031] 实施例3重组菌产葡萄糖氧化酶的纯化和蛋白电泳鉴定
[0032] 采用实施例2中获得的酵母工程菌为生产菌株，活化后将在30°C、200rpm条件下 在YPD生长培养基（装液量50mL)培养到0D_ = L 6-1. 7的种子以10% (v/v)的接种量 转入基本发酵培养基（装液量50mL)，于3(TC、200rpm条件下发酵培养。在基本发酵培养 基中培养至OD 6tltl = 1. 2-1. 5时，离心收集全部菌体，生理盐水洗涤2次，将菌体全部转入 50mL(500mL三角瓶）液体诱导培养基BMMY中，置于30°C、200r/min摇床培养，每24h补加 发酵液体积1%的甲醇，诱导产酶。以表达野生型（即，未经突变的出发G0D)葡萄糖氧化酶 的P. pastoris GS115为对照菌株（即保藏于中国典型培养物保藏中心的编号为CCTCCN0 : M2012266 的菌株）。
[0033] 培养基：
[0034] 种子和斜面培养基为Yro培养基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖 2〇g ;斜面培养基添加琼脂20g。
[0035] 基本发酵培养基为BMGY培养基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL， YNB 13. 4g，IOOmM ρΗ6· 0 的磷酸缓冲液。
[0036] 诱导培养基为BMMY培养基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL， YNB13. 4g，IOOmM pH6. 0 的磷酸缓冲液。
[0037] 发酵结束后获得发酵液，离心获得发酵上清，对酶进行纯化，纯化方法是阴离子层 析，采用梯度洗脱的方法，最终获得较纯的葡萄糖氧化酶。
[0038] 突变前后的葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE图如图1所示，可看出得到一条分子量大小 约为68kDa的蛋白条带，该条带即为葡萄糖氧化酶。
[0039] 实施例4葡萄糖氧化酶的固定化方法
[0040] 采用无载体交联技术（CLEAs)固定化原酶与突变酶。取100 μ L酶液，加入等体 积的lOU/mL通用过氧化物酶，接着，缓慢滴加聚乙二醇2000至终浓度为75% (w/v)，然后 加入交联剂体积分数为25%的戊二醛，至终浓度为70臟〇1*171。将混合物放入摇床，301： 交联一段20h时间，取出混合物，用缓冲液（IOmM丙二酸钠缓冲液pH5. 0)洗涤，离心后收 集上清，并重复上述操作，直到上清中无法检测到酶活，将固定化酶放入缓冲液中（终体积 10mL)，4°C保存备用。
[0041] 实施例5酶的耐氧化性测定
[0042] 用Brandford试剂盒将原酶和突变酶的酶液统一到同一蛋白浓度，采用无载体交 联技术固定化原酶与突变酶。
[0043] 将固定化后的原酶和突变酶放在不同浓度H2O2 (10、20、50、100、500mM)处理，处理 温度为35°C，处理时间为2h，缓冲液为丙二酸钠缓冲液（pH5. 0, IOmM)。处理后，离心，倒掉 上清，并用缓冲液洗沉淀直到上清中无法检测到H2O2以彻底除去H 2O2。将沉淀用等体积的 缓冲液溶解，离心并充分重悬后测定剩余酶活。相对酶活是经H 2O2处理后的酶活与初始酶 活的比值，定义初始酶活力为100%。
[0044] 通过对不同浓度H2O2条件下葡萄糖氧化酶稳定性变化研究分析发现，如图2所 示，随着H 2O2浓度逐渐升高，葡萄糖氧化酶酶活残留逐渐降低。同时相比于对照酶，突变酶 M556L的耐氧化性在不同浓度的H2O2处理后剩余酶活均有不同程度的提高，在50mmol · Γ1 至500mmol .171的H2O2存在下，突变酶M556L的酶活约为对照酶酶活的2倍，且在 50mmol · L-1的H2O2下，突变酶M556L还能保持无 H2O2存在下的78%的酶活，而对照酶酶活 显著下降。突变酶相对于对照酶，耐氧化性显著提高。
[0045] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，其特征在于，编码所述葡萄糖氧化酶的氨基酸 序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
2. 根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，编码所述葡萄糖氧化酶的核苷 酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
3. 根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述氨基酸序列是将SEQ ID NO. 1所示的氨基酸的第556位的甲硫氨酸突变为亮氨酸。
4. 一种含有权利要求1所述葡萄糖氧化酶的表达载体。
5. -种表达权利要求1所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌。
6. -种权利要求5所述基因工程菌的构建方法，是将SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列 连接到表达载体PPIC9K上形成重组载体，在将重组载体转化P. pastoris GS115,即获得基 因工程菌。
7. -种利用权利要求5所示基因工程菌发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于， 包括：（1)将基因工程菌活化后培养至〇D_ = 1. 6-1. 7,作为种子液；（2)种子液接种于基 础发酵培养基，于28°C -30°C培养至OD6tltl = 1. 2-1. 5 ; (3)收集菌体，将菌体转入诱导培养 基培养，诱导产蛋白。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本发酵培养基为BMGY培养基；所 述诱导培养基为BMMY培养基。
9. 权利要求1所述葡萄糖氧化酶在食品、医药、生物领域的应用。
10. -种测定权利要求1所述葡萄糖氧化酶的耐氧化性的方法，其特征在于，是将葡萄 糖氧化酶采用无载体交联固定化技术进行固定化之后，将固定化酶于不同浓度的H 2O2中处 理，处理后离心、弃去上清，用缓冲液洗沉淀直到上清中无法检测到H2O 2，计算经H2O2处理与 不经H2O2处理的固定化葡萄糖氧化酶的酶活比值。
【文档编号】C12N9/04GK104312989SQ201410589628
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】陈坚, 闻一凡, 张娟, 堵国成, 顾磊 申请人:江南大学