一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法。该固定化漆酶的制备过程包括：首先利用酸酐对漆酶进行修饰，然后用海藻酸对修饰化后的漆酶进行包埋，得到固定化漆酶。本工艺所制备的固定化漆酶可对废水中2，4-二氯苯酚进行去除。本发明方法拓宽了漆酶的pH、温度适用范围，增加了重复使用次数。在废水处理方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方 法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶固定化及环境保护领域。具体涉及一种经酸酐修饰和海藻酸包埋联 用的固定化漆酶及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 酶的固定化研究始于20世纪60年代，是指将水溶性的游离酶通过物理或者化学 方法将其连接在一定的固相载体上，使其成为固定化酶。固定化酶在一定程度上弥补了上 述游离酶不容易重复使用、成本高的不足，增加了酶的实际应用性。酶的固定化方法主要 有：吸附法、包埋法、离子交换法、交联法、共价结合法等。遗憾的是，单一的固定化技术目前 在提高酶的耐用性方面仍然存在很多局限性。例如，包埋法操作简单、酶活性损失小、酶包 埋量大且固定化效率高，较适用于底物为小分子的酶的固定化。
[0003] 漆酶（Laccase)是一类含多个铜离子的多酚氧化酶。在氧气存在的条件下，漆酶 可以催化氧化多种底物，如酚类、芳香胺类、留体、金属有机物等物质，被广泛应用于环境 修复、造纸工业、能源领域、食品工业、生物检测等方面。例如，氯酚类物质2,4_二氯苯酚 (DCP)是一种合成多种溶剂、医药和农药的中间体，难降解，易挥发，有较强的腐蚀性。目前 DCP的去除主要有光降解、吸附、氧化还原、生物降解等方法。使用漆酶催化的生物降解DCP 具有操作简单、条件温和、无二次污染等优点，受到了人们的重视。
[0004] 根据漆酶来源的不同以及底物的不同，漆酶活性的最适pH差异较大。另一方面， 不同来源的工业废水PH差异也很大。由于目前工业上漆酶的主要来源为漆树漆酶和真菌 漆酶两大类，这两类漆酶的最适PH多在3?5,工业废水达标排放标准pH值在6?9。这 些特性促使研究者开发新技术以拓宽漆酶的PH适用范围。文献报道漆酶用丁二酸酐修饰 之后最适pH 向喊性偏移[Chinese Journal ofCatalysis 2011,32(10) :1584-1591];漆酶 经邻苯二甲酸酐修饰后，pH适用范围得到拓宽[中国科技论文在线，2007,2:870-874]。然 而，仅通过酸酐化学修饰漆酶仍然存在难以回收利用、不利于节约成本等不足。
[0005] 此外，文献报道了单一海藻酸包埋来源放线菌的漆酶可以用于苯酚的降解， 重复使用次数可以达到8次，主要用于造纸碱性废水的处理[World J Microbiol. Biotechnol. 2008,24 :1215-1222]。然而，由于海藻酸微球本身在碱性溶液中极易解离溶 解，该方法为了克服这个问题使用了铜离子交联的海藻酸微球增强海藻酸微球的耐用性， 但也导致了铜的二次污染。因此，开发稳定性更高（pH和温度适用范围更宽）、便于重复利 用的漆酶固定化技术具有重要的现实意义。将化学修饰与物理包埋联用的固定化技术通过 多重技术的互补结合，有可能弥补单一固定化技术的不足，有效提高酶的稳定性和循环使 用性能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种化学修饰与物理包埋联用的固定化漆酶及其制备方法。 具体涉及一种经酸酐修饰和海藻酸包埋联用的固定化漆酶及制备方法。
[0007] 本发明中，漆酶可以为漆树漆酶或平菇漆酶，酸酐可以为丁二酸酐、马来酸酐或邻 苯二甲酸酐。本发明制备固定化漆酶方法简单，只需两步：（1)利用酸酐修饰漆酶，得到羧 基化漆酶；（2)将步骤（1)所得的羧基化漆酶溶液与海藻酸钠溶液混合，滴入CaCl 2溶液中 进行交联，获得固定化漆酶微球。
[0008] 上述方法的步骤（1)中，漆酶分子上的氨基与酸酐发生反应，制得羧基化漆酶。控 制漆酶溶液浓度为〇. 5?50mg/mL，酸酐溶液浓度为5?500mM，反应时间为IOmin?24h。 为了尽量减少反应中的酶活损失，反应体系采用冰浴；为了加快反应速度，采用磁力搅拌； 反应时间优选为lh。反应结束后，利用pH为4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液在4°C下对产物 进行透析，除去未反应的酸酐分子。
[0009] 所述步骤（2)中，用海藻酸对第一步制备的羧基化漆酶进行包埋固定化。羧基化 漆酶与海藻酸钠混合均匀，所使用海藻酸钠浓度优选为2. 5%，羧基化漆酶和海藻酸钠的体 积比为1 : 2,混合液于4°C下静置2?3h，待到混合液无气泡后，用注射器将混合液滴入 CaCl2溶液中。所用CaCl2溶液的浓度优选为3%。钙离子与海藻酸分子上的羧基、漆酶分 子上修饰的羧基具有强的络合作用，不仅能生成不溶于水的海藻酸钙微球，还能更大程度 上有效包埋酶。研究发现，丁二酸酐修饰固定化漆酶微球的酶包埋率约为90%，未修饰微球 的包埋率约为85%。钙离子交联的海藻酸微球还能保证所制备的固定化漆酶微球有良好的 机械性能，不会出现酶泄露情况。在优化条件下所制备的固定化漆酶微球直径约为3mm。
[0010] 本发明固定化漆酶的制备原理满足以下三点：第一，漆酶经酸酐修饰后，漆酶分子 上带有较多的羧基，由于羧基与钙离子有较好的络合作用，从而能够有较多包埋在钙离子 交联的海藻酸微球中；第二，漆酶经酸酐修饰后羧基含量的大大增加，保证漆酶的最适PH 值向碱性偏移；第三，由于钙离子能够同时络合羧基化漆酶和海藻酸，提高了海藻酸在中性 PH下的稳定性，从而固定化酶的耐用性和重复使用次数得到提高。
[0011] 从上述操作步骤可知，本发明技术条件温和，不涉及苛刻的反应条件如高温高压 等，有利于保持酶的构象，不损失酶的活力。研究发现丁二酸酐修饰后漆酶酶活回收率约为 未修饰游离漆酶的1. 5倍，丁二酸酐修饰固定化漆酶的酶活回收率约为未修饰固定化漆酶 2?3倍。游离漆酶的pH和温度适用范围一般为pH 3?5, 30?40°C。利用本发明制备 的固定化漆酶有较宽的pH和温度适用范围，在pH 3?7、20?60°C范围内均有较高的活 性。
[0012] 氯酚类物质是废水中一类难降解的污染物。利用本发明的固定化漆酶微球对DCP 进行降解，降解性能主要体现在PH近中性条件下具有较好的循环使用性能。由于pH过高 会使微球溶解，使用此固定化漆酶时将pH控制在6左右。从图3可以看出，丁二酸酐修饰 的固定化漆酶微球在PH 6进行DCP降解，循环使用12次之后，降解率仍达到30%以上，去 除DCP性能优于其它对照体系。
[0013] 本发明的优点在于：1)制备工艺简单，条件温和，不引入二次污染；2)所制备的固 定化漆酶最适pH由酸性向碱性方向偏移，pH适用范围拓宽；3)所制备的固定化漆酶温度适 用范围拓宽；4)在pH 6下用于去除DCP，满足较理想的重复使用次数。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为实施例1中pH对游离漆树漆酶、丁二酸酐修饰漆酶、固定化漆酶活性的影 响
[0015] 图2为实施例1温度对游离漆树漆酶、丁二酸酐修饰漆酶、固定化漆酶活性的影响
[0016] 图3为实施例3中游离平菇漆酶和修饰平菇漆酶经固定化后DCP降解实验
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0018] 本发明中所用漆树漆酶（来源Rhus vernicifera)购自Sigma-Aldrich ;
[0019] 平燕漆酶（来源 Pleurotus ostreatus)购自 Sigma-Aldrich ;
[0020] 测定漆酶酶活的方法为2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2， 2' -Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6_sulphonate), ABTS)法。
[0021] 下述实施案例中，未修饰漆酶、被丁二酸酐（马来酸酐或邻苯二甲酸酐）修饰 的漆酶、未修饰的固定化漆酶、被修饰的固定化漆酶以下分别用Lac、Lac-SA(Lac-MA或 Lac-PA)、LacOALG、Lac-SAOALG (Lac-MAOALG 或 Lac-PAOALG)表示。
[0022] 实施例1
[0023] DLac-SA的制备：取0. Olg漆树漆酶于IOmL pH 7. 4磷酸盐缓冲溶液中，4°C下溶 解Ih后，在4°C、9000rpm下离心5min，得到漆酶溶液。取0. Olg 丁二酸酐（SA)溶于50mLpH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，得到2mM SA溶液。将漆酶溶液置于冰浴中，磁力搅拌下缓慢加入 IOmL SA溶液，反应lh。将反应后的溶液装于透析袋（截留分子量为3500)中，4°C下于醋 酸缓冲溶液中透析过夜，得到Lac-SA溶液。修饰率约为50%。
[0024] 2) Lac-SAOALG的制备：称取3g CaCl2溶于IOOmL水中，得到3% CaCl2溶液。称取 1.58海藻酸钠溶于6〇1^蒸馏水中，得到2.5%海藻酸钠。将1〇1^1^^4与2〇11^2.5%海 藻酸钠混合均匀，置于4°C冰箱中，当混合液中无气泡时方可进行下一步包埋。将Lac-SA与 海藻酸钠的混合液用注射器滴入3% CaCl2溶液中，4°C下交联2h，得到Lac-SAOALG微球。
[0025] 3) LacOALG的制备：与Lac-SAOALG的制备方法相同，仅将Lac-SA溶液换为Lac溶 液。
[0026] 4)以ABTS为底物测定漆酶活性。以37°C下420nm处每分钟生成1 μ mol底物作 为一个酶活力单位。
[0027] 效果评价：
[0028] I. pH值适用范围
[0029] 不同pH下测得相对酶活见图1，其中相对酶活是指不同pH条件下酶活，相对最适 pH下酶活的百分比。结果表明，游离Lac最适pH为4. 5,随着pH的增加，活性迅速减小，当 pH增大到7时，相对酶活仅为10%左右；Lac-SA最适pH偏移到6,当pH增大到7时，相对 酶活仍有80 %左右；LacOALG最适pH约为3. 5,随着pH的增加相对酶活逐渐减小，当pH增 加到7. 0时，相对酶活为60 %左右；Lac-SAOALG最适pH向碱性方向偏移到了 6. 4,当pH为 7. 0时，相对酶活仍有约87 %。
[0030] 温度适用范围
[0031] 不同温度下测得相对酶活见图2,其中相对酶活是指以各自条件下的酶活与最适 温度下酶活的百分比。结果表明，Lac、Lac-SA的最适温度均为35°C，LacOALG、Lac-SAOALG 的最适温度为45°C。Lac、Lac-SA随着温度的增加，酶活降低明显，Lac@ALG、Lac-SA@ALG活 性随温度改变没有太大变化。
[0032] 实施例2
[0033] 按照实施方案1的步骤，仅将原料中的丁二酸酐替换成马来酸酐或邻苯二甲酸 酐。或将漆树漆酶替换成平菇漆酶。以ABTS法对漆酶的催化活性进行测定，效果评价总结 为表1。
[0034] 表1酸酐修饰与海藻酸包埋联用固定化漆酶的性能结果
[0035]
【权利要求】
1. 一种酸酐修饰与海藻酸包埋联用的固定化漆酶及其制备方法，其特征在于化学修饰 与物理包埋的联用，包括以下两个步骤：（1)化学修饰是指酸酐与漆酶分子上的氨基在缓 冲溶液中反应，制备羧基化漆酶；（2)物理包埋是将羧基化漆酶与海藻酸钠溶液混合，然后 逐滴滴入CaC12溶液进行交联得到所述固定化漆酶。
2. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述步骤（1)中漆酶具体来自漆树和 平菇，所述酸酐为丁二酸酐、马来酸酐、邻苯二甲酸酐中的至少一种。
3. 根据权利要求1所述步骤（1)的方法，其特征在于：漆酶溶液浓度为0. 5?50mg/ mL，酸酐溶液浓度为5?500mM，反应时间为IOmin?24h，反应温度为0?40°C ;所述缓冲 溶液的pH为3.0?8.0。
4. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤（2)中所述物理包埋条件是羧基化 漆酶浓度为〇. 1?5. Omg/mL，海藻酸钠的浓度为1 %?5 %，CaCl2的浓度为1 %?5 %。
5. 根据权利要求1所述的固定化漆酶形态为水凝胶微球，微球直径范围为Imm? 10mnin
6. 根据权利要求1所述，制备的固定化漆酶微球可直接用于废水中2,4_二氯苯酚的降 解。
7. 根据权利要求6所述，固定化漆酶微球对2,4-二氯苯酚的降解在pH4?6溶液中进 行。
【文档编号】C12N9/96GK104313006SQ201410594454
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】李娟 , 刘芳, 刘又年, 陈倩, 孙晓毅 申请人:中南大学