耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突变，本发明在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。
【专利说明】耐热碱性木聚糖酶基因xyIGT优化序列及其高效表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别涉及耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其 高效表达方法。
【背景技术】
[0002] 现今木聚糖酶的应用领域不断扩大，已成功应用于食品、医药、造纸等工业中。在 造纸工业中有制浆这一工艺，在这步工艺中需要去除木质素达到漂白的目地，传统去除的 方法就是加强酸强碱，这对环境产生很大的污染。而用木聚糖酶进行辅助漂白，不仅可以提 高纸浆的白度，还可减少后续化学漂白剂的添加量，这样明显的降低漂白废水中有机污染 物氯代的产生；本研究发明涉及的耐热碱性木聚糖酶在纸浆造纸行业有很好的运用前景。
[0003] 在食品行业中，木聚糖酶不仅可以作为面包改良剂，可改善面团的稳定性和对过 度发酵的耐受性，聚糖酶还能够降解果汁和啤酒中的多糖，因而有利于饮料的澄清，木聚糖 酶可降解多糖来生产低聚木糖，低聚木糖是一种具有低热量和低糖度易吸收特性的重要的 食品添加剂。木聚糖酶在其它方面也具有很大的潜在价值，例如在果蔬制品的生产中，木聚 糖酶不仅能提高果蔬的汁浸出率及压榨能力，也可以降低了生产成本；在饲料中添加木聚 糖酶可消除或降低低阿拉伯木聚糖抗营养作用；在制药工业中，木聚糖酶可用来制作缓释 药物的原料。
[0004] 鉴于木聚糖酶具有重要的实际应用价值，人们希望能够将木聚糖酶投入实际应 用，现阶段必须克服的问题是怎样降低它的生产成本提高它的产量。为解决这个问题，人们 尝试通过诱变野生菌选育高产菌、利用基因工程手段构建重组工程菌、培养条件的优化等 等一些列手段来提高木聚糖酶的产量。
[0005] 在高产菌选育方面，人们一般通过过紫外（UV)，亚硝基胍（NTG)来诱变处理野生 菌以期得到产木聚糖酶最高的最佳突变菌株，该方法经济且快速。为了寻找适合工业应用 的木聚糖酶，人们从嗜极性生物中寻找能产木聚糖酶的微生物，目前在嗜碱性微生物中发 现了一些微生物可产生木聚糖酶，但大多数是细菌；在嗜热性微生物中发现细菌，真菌和放 线菌中都能产生木聚糖酶，这些酶在极端温度和pH下仍然有很高的活性，因此更具有广阔 的应用前景；在基因克隆方面，目前已发现的木聚糖酶基因有xynA, xynB, xynC, xynZ等，最 初是将它们克隆转到宿主大肠杆菌中，发现这些基因在大肠杆菌中虽然能够表达但表达的 蛋白不能分泌到胞外，必须破碎细胞才能检测到蛋白。人们将嗜热细菌的木聚糖酶基因克 隆到毕氏酵母分泌表达载体中，转化入宿主毕赤酵母中，将有活性的木聚糖酶分泌到胞外 来，便于后期分离纯化。
[0006] 在选择巴氏毕赤酵母为外源基因表达系统时，必须要考虑的问题就是该用什么样 的方法实现外源目的蛋白在该系统的高效表达，从一些报道可总结出大致从以下方面来进 行改进：1)首先从基因水平对其改造。外源基因必须重组到巴氏毕赤酵母的染色体上才能 在甲醇的诱导下表达出来，因此它自身的结构性质在很大程度上影响其在系统中的高效表 达。一般来说外源基因AT与GC的含量都要适宜，AT太高会直接导致提前终止基因的翻译 表达，有报道称AT含量在30% -55 %之间最有利于外源基因在毕赤酵母中的高效表达；如 果外源基因的GC含量过高则容易造成翻译能障过高，翻译过程很难进行下去，不利于外源 基因在毕赤酵母中的高效表达。另外在构建外源基因时要充分考虑到巴氏毕赤酵母密码子 的偏爱。所谓密码子偏爱性就是某物种高表达的基因会使用特定的同义密码子，这些密码 子则是该物种的优越密码子。研究发现毕赤酵母的优越密码子大约有25个，因此为了增加 外源蛋白的表达量，在构建外源基因的时候要尽量用到这25个密码子且尽量避免用稀有 密码子。2)适当增加目的基因拷贝数。研究表明适当增加拷贝数可以提高外源基因表达 量。但是，过多的外源基因的拷贝数也可能导致重组DNA不稳定造成外源目的蛋白表达量 的降低。外源基因拷贝数与对G418或zeocin的抗性成正比，因此可利用不同浓度的G418 或zeocin来鉴别拷贝数的多少。3)外源基因整合到酵母染色体上的方式。在将重组载体 整合到酵母染色体之前，一般会选着不同的酶切位点把重组载体线性化，选择不同的酶将 有不同的整合方式，挑选最有利于外源基因表达的整合方式。4)优化培养条件。一种微生 物能否正常代谢生长产酶，需要合适的外界培养条件。不同的培养条件对于巴氏毕赤酵母 表达系统高效表达外源蛋白有着举足轻重的影响例如温度、pH、溶氧等，这些培养条件一方 面作用于菌体的生长状况，另一方面也影响着外源蛋白的活性，最有利于菌体生长的条件 并不意味这是最有利于产酶的条件，在探究最优条件时要综合考虑这两方面。例如毕赤酵 母的最佳生长温度是30°C，但有研究表明15°C的诱导温度可以显著提高外源蛋白的表达； 毕赤酵母的最佳生长pH是3-7,假如培养基的pH不在这个范围，菌体的生长量没多大变化 但是对产生的蛋白质有很大影响。另外，培养基中的碳氮比以及诱导剂的添加量也对蛋白 的表达起到至关重要的作用，在优化培养条件时要充分考虑这两点。
【发明内容】
[0007] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供耐热碱性木聚糖酶基因 xylGT优化序列及其高效表达方法，使用DNAworks软件以及mRNA的稳定性分析软件RNA Structure 4. 3,将来源于 Geobacillus thermoleovorans 的 xylGT 基因（GenBank 登录号： JN680872)，按照毕赤酵母的密码子偏爱性，对出发菌株的木聚糖酶基因进行优化改良，将 优化后的xylGT基因序列进行优化而来。在其引物5'端添加了 EcoRI限制性酶切位点， 引物3'端引入了 Notl限制性酶切位点，经PCR扩增，连接转化，测序验证，得到碱性木聚 糖酶xylGT的优化基因序列。将优化后的木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母GS115的表达载 体PPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-xylGT，再将重组表达载体电转化到宿主毕赤酵母 中，通过在不含组氨酸的基础培养基（MD)以及菌落PCR初步筛选出阳性克隆，结合G418抗 性和含木聚糖的平板上水解圈大小筛选高拷贝菌株，并从中成功地筛选了一株高产木聚糖 酶的重组菌P. pastoris GS115/xyl。在此基础上，采用单因子实验、Plackett-Burman设计、 最陡爬坡实验、响应面设计相结合的方法，对重组菌株产xylanase在摇瓶水平上的发酵条 件进行优化，找到最优发酵条件以期提高xylanase的表达量，降低xylanase的生产成本。 在最优条件下，木聚糖酶活达到82. 24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了 1. 25倍。并在发 酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4. 779UAmL ? h)，酶活为454U/mL，比改良前 酶活提高了 1.36倍，同时产酶时间延长了 14h。
[0008] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] -种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列，其序列如SEQ ID NO. 1
[0010] 一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列的高效表达方法，包括如下步 骤：
[0011] 步骤一、根据毕赤酵母密码子偏爱将原始基因进行优化，PCR扩增合成全长木聚糖 酶基因xylGT ;
[0012] 步骤二、将优化的木聚糖酶基因xylGT与表达载体pPIC9K分别用酶EcoRI和 Not I进行双酶切，经连接得到重组质粒pPIC9K-xylGT ;
[0013] 步骤三、将经SalI酶切线性化后的pPIC9K_xylGT重组质粒电转化到毕赤酵母宿 主菌GS115中，在基本培养基（MD)平板上初步筛选到阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选 得到重组工程菌GS115/xyl ;根据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳 性转化子转移到含有0.05%木聚糖的缓冲甲醇培养基（BMMY)平板上，挑选产水解圈大的 阳性转化子作为高产木聚糖酶的出发菌开展研究；
[0014] 步骤四、对筛选到的产酶高的重组菌产的木聚糖酶进行了酶学性质的研究。该木 聚糖酶最适反应pH为8. 8,最适反应温度为78°C ;为了研究该木聚糖酶的温度稳定性和pH 稳定性将酶放在在高温或者强碱条件下一个小时后测定残留酶活性率较低，说明木聚糖酶 在强碱或者高温下不稳定；
[0015] 步骤五、在摇瓶培养基础上采用单因子实验确定了初始最优发酵产酶条件为： pH = 6. 9、大豆蛋白胨为1.5%、酵母浸膏为1.5 %、甲醇为1 %、硫酸镁为0. 1 %、硫酸钙 0. 05%、硫酸铵为0. 45%、28°C培养5天；利用Plackett-Burman设计筛选出影响产酶 的三个显著因素：甲醇、酵母浸膏、硫酸钙；用最陡爬坡路径逼近最大响应区域后，再结合 Box-Behnken设计和响应面分析法对筛选到的显著因素进行优化，得出显著因素的最优条 件为：甲醇12ml/L，酵母浸膏15g/L，硫酸钙1. 049g/L。
[0016] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0017] 本发明提高xylanase的表达量，降低xylanase的生产成本。在最优条件下，木聚 糖酶活达到82. 24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了 1. 25倍。并在发酵罐上对产酶条件 进行了试验，最大生产率为4. 779UAmL *h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了 1. 36倍， 同时产酶时间延长了 14h。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是本发明根据密码子偏好优化后的序列与原始序列的比较图；在1140个碱基 中，显示270个点突变的位置。
[0019] 图2为本发明RNA二级结果分析energy = -338. 3。
[0020] 图3为木糖标准曲线。
[0021] 图4为木聚糖酶酶活性与pH关系图。
[0022] 图5为木聚糖酶酶活性与温度关系图。
[0023] 图6为优化前后菌株在发酵培养基中的生长曲线。
[0024] 图7为6天取15 L电泳检测每天木聚糖酶的表达情况。
[0025] 图8为不同时间段木聚糖酶的活性性。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0027] 试验例：
[0028] 一利用overlap PCR合成全基因
[0029] 根据毕赤酵母密码子偏爱性以及通过RNA structure 4. 3软件预测mRNA的稳定 性来设计优化的木聚糖酶基因，在此基础上设计32条引物，通过overlap PCR合成全长木 聚糖酶基因：
[0030] (1)在50 i! L PCR反应体系中对全长木聚糖酶基因序列的5'上游部分序列进行克 隆
【权利要求】
1. 一种耐热碱性木聚糖酶基因 xylGT核苷酸优化序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1，在1140个碱基中，具有270个点突变。
2. -种耐热碱性木聚糖酶基因 xylGT核苷酸优化序列的高效表达方法，其特征在于， 包括如下步骤： 步骤一、根据毕赤酵母密码子偏爱将原始基因进行优化，PCR扩增合成全长木聚糖酶基 因 xylGT ; 步骤二、将优化的木聚糖酶基因 xylGT与表达载体pPIC9K分别进行双酶切，经连接得 到重组质粒pPIC9K-xylGT ; 步骤三、将经Sal I酶切线性化后的pPIC9K_xylGT重组质粒电转化到毕赤酵母宿主菌 GS115中，在基本培养基平板上初步筛选到阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选得到重组工 程菌GS115/xyl ;根据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳性转化子转 移到含有〇. 05%木聚糖的缓冲甲醇培养基平板上，挑选产水解圈大的阳性转化子作为高 产木聚糖酶的出发菌； 步骤四、在pH为8. 8,反应温度为78°C条件下对筛选到的产酶高的重组菌继续摇瓶培 养培养； 步骤五、在摇瓶培养基础上，发酵产酶条件选取：pH = 6. 9、大豆蛋白胨为1. 5%、酵母 浸膏为1.5%、甲醇为1 %、硫酸镁为0. 1 %、硫酸钙0.05%、硫酸铵为0.45%，于28°C培养 5天。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，用酶EcoR I和Not I进行 双酶切。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤五中，利用Plackett-Burman设 计筛选出影响产酶的三个显著因素：甲醇、酵母浸膏、硫酸钙；用最陡爬坡路径逼近最大响 应区域后，再结合Box-Behnken设计和响应面分析法对筛选到的显著因素进行优化，选取 显著因素的最优条件为：甲醇12ml/L，酵母浸膏15g/L，硫酸钙1. 049g/L。
【文档编号】C12N15/56GK104450758SQ201410679215
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】闫达中 申请人:武汉轻工大学, 桂林精成生物科技有限公司