一种利用亚麻刺盘孢霉高效合成15α-羟基-黄体酮的方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及一种新型利用亚麻刺盘孢霉（ Colletotrichum lini ）ST-1羟化黄体酮（progesterone）为15α-羟基-黄体酮（15α-OH-progesterone）的方法。采用乙醇诱导后的静息细胞转化，在黄体酮投料量为8 g/L的条件下，底物转化率高达90%，产物15α-羟基-黄体酮摩尔得率为70.32%。
【专利说明】一种利用亚麻刺盘孢霉高效合成15 a -羟基-黄体酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种高效利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum Iini)轻化黄体酮(progesterone)为 15 α -轻基-黄体酮(15 a -OH-progesterone)的方法。
【背景技术】
[0002]黄体酮(progesterone)是一种临床常用的孕激素类药物，影响排卵、妊娠的建立与维护，并且参与神经元的兴奋性和神经保护等方面。留醇羟化如黄体酮的羟化是留体药物和激素生产中最为重要的一步反应，羟化类留体化合物与他们极性较小的非羟化类似物相比，往往表现出较高的生物活性。与传统的化学合成方法相比，微生物转化技术具有反应条件温和、立体选择性高、大大缩短转化工艺以及环境友好等优势。利用微生物转化技术，可选择性的在黄体酮母核的不同位点引入一个或多个羟基，合成多种留体医药中间体，用于生产多种抗炎药物，如氢化可的松、强的松、地塞米松等。由于留体化合物独特的生物活性和药用价值，国家已把留体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。
[0003]目前，微生物羟基化甾体化合物的趋势是寻找对甾醇一系列的羟化位置具有高转化率、高选择性、高产物得率的优势菌株，生产有效治疗性能的新型羟化类固醇药物。近些年来，科研工作者已经找到了多株对黄体酮具有转化能力的菌株，包括Chaetomium sp.KCH 6651、Fusarium oxysporum、Ceratocystis paradoxa、Gelasinospora retispora>Vhetzelinia sclerot1rum ATCC及 PenicilliutnAMlll 等，其轻化位点主要集中在7 α，9α，11α，11β，16α，17α。关于黄体酮15 α羟化的报道十分鲜见，仅Vusarium.0xysporumvar.cMeflse菌株能在较低的底物投料浓度下合成少量15 α -轻基-黄体酮，同时还伴随一些副产物的形成。因此，利用高转化效率的菌株羟化黄体酮以形成具有生物活性的15 α -轻基-黄体酮(15 α -ΟΗ-progesterone)，不仅为留体药物合成提供了潜在的前体化合物，同时可为留体药物的合成开辟新途径，具有一定的理论研宄价值和市场经济价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种新型且高效的获得15 α -羟基-黄体酮(15 a -OH-progesterone)的方法，通过两步转化法，利用亚麻刺盘孢霉(ColletotrichumIinDH的静息细胞将黄体酮高效转化为15 α -羟基-黄体酮。
[0005]应用上述方法转化黄体酮生产15 α -轻基-黄体酮，其步骤如下:
(1)采用保藏号为CGMCC N0.6501 的 C.1ini ST-1 为生产菌种，25-40 °C，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；
(2)制备C.1ini ST-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(I)的PDA固体培养基上的C.1ini ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40°C，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C.1ini ST-1菌株的细胞液体培养物；
(3)乙醇诱导:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10% (v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在120-220 r/min的转速下培养12 h后加入0.6%的乙醇诱导，继续培养12 h得发酵液。
[0006](4)制备C.1ini ST-1菌株的静息细胞:将步骤(3)中培养好的菌体用0.2 M PBS缓冲液洗涤3次，然后重悬于新鲜的30 mL/250 mL PBS缓冲液。
[0007](4)生物转化:称取适量底物黄体酮，投入步骤(4)中的静息细胞，使其终浓度为5-8 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化48-60 h，即得转化液。
[0008](5)产物检测:将步骤(4)的转化液在8000-12000 r/min下离心5-10 min，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，菌体用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 y m的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析黄体酮、15 α -羟基-黄体酮的含量。
[0009]其中步骤(I)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200-500 g/L;葡萄糖20-50 g/L;酵母粉2-10 g/L;琼脂粉10-20 g/L ;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:花生饼粉10-20 g/L，淀粉15-30 g/L ；葡萄糖 20-50 g/L ;酵母粉 10-30g/L ；NH4NO3 5-10 g/L ；KC1 0.1-1 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0g/L ；MgS04*7H20 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.1 g/L g/L ;灭菌前调培养基的 pH 至6.0-6.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖 10-100 g/L;环糊精 10-30 g/L;酵母粉 5-50g/L;蛋白胨 5-50 g/L ; NaC I 0.2-2 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。
[0010]本发明所述的高效合成甾体化合物15 α -轻基-黄体酮的方法，是首次提出利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum Iini) ST-1轻化黄体酮为15 α-轻基-黄体酮。
[0011]
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明的亚麻刺盘孢霉(7i/?i)ST_l在发酵培养基中转化黄体酮为15 α -轻基-黄体酮的过程研宄。
【具体实施方式】
[0013]实施例1制备亚麻刺盘孢霉(oiricA-- Iini) ST-1菌株的种子液
(I)挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉菌株一环，接种在装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得C.1ini ST-1的种子液。
[0014](2)种子培养基的成分及配比为:花生饼粉10-20 g/L，淀粉15-30 g/L ;葡萄糖 20-50 g/L ;酵母粉 10-30g/L ；NH4NO3 5-10 g/L ；KC1 0.1-1 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04*7H20 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.1 g/L g/L ;灭菌前调培养基的 pH 至6.0-6.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0015]实施例2制备亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini) ST-1菌株的静息细胞
(I)将上述亚麻刺盘孢霉菌株的细胞液体培养物以8-10% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40°C条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵12 h后加入6%的乙醇诱导，继续培养12 h。然后，将培养好的菌体用0.2 M PBS缓冲液洗涤3次，最后重悬于新鲜的30 mL/250 mL PBS缓冲液，即得C.1ini ST-1菌株的静息细胞。
[0016](2)发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10-100 g/L;环糊精10-30 g/L ;酵母粉 5-50g/L ;蛋白胨 5-50 g/L ；NaCl 0.2-2 g/L ；Κ2ΗΡ04 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ；MgSO4 0.01-0.1 g/L ；FeS04*7 H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121°C高压蒸汽下灭菌 20min。
[0017]实施例3亚麻刺盘孢霉(lini) ST-1菌株转化黄体酮
精确称取适量黄体酮，投入C.lini ST-1菌株的静息细胞，使黄体酮终浓度为5-8 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化48-60 h。
【权利要求】
1.一种新型且高效的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum /ifli) ST-1轻化黄体酮为15 α -羟基-黄体酮的方法，其特征为:250 mL三角瓶装20-40 mL的PBS缓冲液重悬15g/L亚麻刺盘孢的静息细胞，同时投入适量黄体酮，在转化温度28°C，摇床转速180-220 r/min条件下转化48-60 h。
2.如权利要求1所述的C.1ini ST-1羟化黄体酮的方法，其特征在于，静息细胞的获得如下:将上述C.1ini ST-1的种子液以8-10% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40°C条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，待发酵12 h后加入6%的乙醇诱导，继续培养12 h ;然后，将培养好的菌体用0.2M PBS缓冲液洗涤3次，并重悬于新鲜的30 mL/250 mL PBS缓冲液，即得C.1ini ST-1菌株的静息细胞。
3.如权利要求1所述的C.7i/?i ST-1羟化黄体酮的方法，其特征在于，所用发酵培养基组成如下:葡萄糖10-100 g/L;环糊精10-30 g/L;酵母粉5-50g/L;蛋白胨5-50 g/L ；NaCl 0.2-2 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04 0.01-0.1 g/L ;FeS04.7H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。
【文档编号】C12P33/06GK104480179SQ201410683239
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】许正宏, 吴燕, 李会, 李恒, 史劲松, 张峥斌, 张汝金 申请人:江南大学, 浙江仙居君业药业有限公司