鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。本发明首先分离了一株鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9901。本发明进一步公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)培养鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；(2)灭活病毒液；(3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度适应，适合细胞培养；免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高并且节约生产成本等优点。
CGMCC No. 9901
20141022
【专利说明】鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鹅副黏病毒，尤其涉及一株分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应 株，本发明还涉及所述分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株在制备预防鹅副黏病毒病 的疫苗中的用途，属于鹅副黏病毒的分离及应用领域。
【背景技术】
[0002] 鹅副黏病毒（Goose paramyxovirus, GPMV)是副黏病毒科，副黏病毒亚科，腿腺炎 病毒属。鹅副黏病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染 病，一年四季均可发生，发病率为40% -100%，平均为60%左右，死亡率为30% -100%，平 均为40%左右。不同日龄的鹅均易感染，但日龄越小发病率和死亡率越高，其中15日龄以 内雏鹅的发病率和死亡率可高达100%。随鹅群日龄的增长，发病率和死亡率也随之下降， 部分病鹅可逐渐康复。种鹅感染发病后，除死亡外，产蛋量大大下降，受精率也很低。
[0003] 目前，部分养殖户用新城疫疫苗免疫鹅，以预防鹅副黏病毒。根据报道，新城疫病 毒一般不感染鹅，即使感染也不发病（Gagic et al，1999)。任涛等（2000)曾用国内NDV标 准强毒株F48E8攻击28日龄的鹅，发现NDV强毒株对鹅的发病率和死亡率均为0。鹅副黏 病毒病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法是疫苗的接种。目前，市售的 鹅副黏病毒疫苗绝大多数为鸡胚生产的组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质 量批间差较大等缺点。因此，分离一株鹅副黏病毒细胞适应毒株，对于降低鹅副黏病毒疫苗 的生产成本、稳定产品质量具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一株鹅副黏病毒（Goose paramyxovirus)鸡胚 成纤维细胞适应株DQ03株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性，免疫原性良好，产生 抗体效价高，且降低疫苗生产成本。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0006] 本发明首先分离了一株鹅副黏病毒株，其具有在鸡胚成纤维细胞上增殖的特性； 在此基础上，本发明进一步驯化分离出了一株细胞适应毒，命名为DQ03株。
[0007] 本发明将分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株提交专利认可的机构 进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 9901 ;分类命名是：鹅副黏病毒；保藏时间是： 2014年10月22日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地 址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0008] 本发明从黑龙江省大庆市郊某养殖场无菌采集病死鹅的肝脏、脾脏等组织中分离 出一株鹅副黏病毒。分离病毒能被ND阳性血清所抑制，HI效为2 8;不能被EDS 76阳性血清、 H5和H9禽流感阳性血清所抑制。分离毒株的EID5tl为10 81VO. lml，脑内致病指数（ICPI) 为0. 16,鸡胚平均致死时间（MDT)为114h，表明本发明分离的鹅副黏病毒毒株为低毒力病 毒。
[0009] 本发明将分离毒株接种在生长良好的鸡胚成纤维细胞（CEF)上，36h后开始出现 典型的细胞病变，病变初期表现为细胞聚缩，之后，合胞体数量逐渐增多、变大；60h时75% CEF出现细胞病变，细胞逐渐脱落，细胞之间的空白区逐渐增大，残留的细胞呈拉网状结构； 当细胞病变达70%时，测定细胞液的HA效价为1 : 512。表明，分离毒株具有CEF细胞适 应株的特性。
[0010] 本发明将分离病毒进行蚀斑纯化，挑选中等大小的5个蚀斑进行传代纯化，分离 得到5个病毒株，分别命名为DQOl株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株。分离到的5个 病毒株（DQ01?DQ05株）的HA及TCID5tl检测结果表明，病毒DQ03株性能最优，其对鸡胚 成纤维细胞高度适应，HA效价达1 :1024, TCID5tl达10 9_ 38TCID5tlA). lml，显著高于其他分离毒 株。
[0011] 本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株能够应用于制备预防鹅 副黏病毒病的疫苗。
[0012] 本发明进一步公开了一种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，包括：免疫有效量的 鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。
[0013] 本发明还公开了一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
[0014] (1)培养所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；（2)灭活病 毒液；（3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。
[0015] 其中，步骤（1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞培养或者经SPF鸡胚培养；优选为， 经鸡胚成纤维细胞培养。
[0016] 步骤（2)所述灭活是向病毒液中加入终浓度为0. 1 %甲醛溶液，37°C灭活24小时。
[0017] 步骤（3)所述离心是5000r/min离心30min ;所述病毒上清液与佐剂按照体积比 I :1. 5混合；所述佐剂优选为进口油佐剂。
[0018] 本发明所述方法制备得到的鹅副黏病毒灭活疫苗，能够有效预防鹅副粘病毒。
[0019] 本发明将分离的鹅副黏病毒DQ01-DQ05株分别制备油乳剂灭活疫苗；经鸡胚成纤 维细胞培养，病毒液半成品的HA及TCID 5tl测定结果表明，DQ03株HA效价达1 :1024, TCID 5Q 达IO9 38TCID5tlA). lml，高于鸡胚扩增的原始病毒液及其他分离株。动物免疫保护试验结果 表明，分离的鹅副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同时间抗体效价均高于其他实验 组，免疫后21天HI抗体效价达8. 51og2 ;与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并 且节约生产成本等优点。
[0020] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0021] 本发明分离的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株对鸡胚成纤维细胞高度 适应，适合细胞培养；免疫保护试验表明，分离的鹅副粘病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03 株免疫原性良好，与胚毒制备的疫苗相比，具有产生抗体效价高，并且节约生产成本、产品 质量稳定等优点。
[0022] 本发明所渉及到的术语定义
[0023] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0024] 术语"分离的"意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料 可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分（例如细胞质或膜 组分）。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。
[0025] 可互换使用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"指这样的药物组合物，其包括在动物 中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另 外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括 例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的 生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已 知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超 过一种上述组分。
[0026] 术语"佐剂"意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原 性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样 系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细 胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化 铝、表面活性物质。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖；其中，A为细胞接毒前形态；B为细胞接 毒产生病变。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0029] 实施例1鹅副黏病毒的分离和鉴定
[0030] 1、实验方法
[0031] 1.1病毒的分离
[0032] 病料来自黑龙江省大庆市郊某养殖场，无菌采集病死鹅的肝脏、脾脏等病料混合 剪碎并研磨，按I : 3(v/v)加入双抗含量为2000IU/mL的灭菌PBS，置4°C冰箱作用4h， 4000r/min离心5min ;取上清经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0. 2mL/枚，置37°C孵育 120h ;弃去24h内死亡鸡胚，以后每天照蛋两次，将死亡鸡胚放置4°C冰箱保存4-24小时； 收取48h?120h死亡鸡胚尿囊液及羊水,作为传代毒种，-20°C保存。
[0033] 1.2病毒的鉴定
[0034] I. 2. 1 血凝试验（HA)
[0035] 取鸡胚病毒液在96孔微量凝集板上用生理盐水作倍比稀释至212,同时设空白对 照及鸡新城疫L系毒（购自中国兽医药品监察所）阳性对照，再加等体积1 %鸡红细胞后于 震荡器上震荡2?3min，置室温25min后观察结果。
[0036] 1. 2. 2血凝抑制试验（HI)
[0037] 取25 μ 1鸡新城疫阳性血清、EDS76阳性血清、H5和H9禽流感阳性血清在96孔微 量凝集板上用生理盐水作倍比稀释至2 12,每孔加25 μ 1血凝价4个单位的分离毒，并设阳性 对照（鸡新城疫阳性血清，每孔加25 μ 1血凝价4个单位的鸡新城疫L系毒），同时设阴性 (阴性血清+鸡新城疫L系毒）及空白对照，再加1 %鸡红细胞25 μ 1后于震荡器震荡2? 3min，置室温25min后观察结果。
[0038] 1. 2. 3鸡胚血清病毒中和试验
[0039] 分别取收集的鸡胚病毒液作10倍稀释后与新城疫病毒阳性血清等量混合，感作 后，尿囊腔接种10日龄鸡胚，每组5枚胚，0. Iml/胚，同时设病毒对照组和空白对照组，观察 鸡胚死亡情况。
[0040] 1. 2. 4动物回归试验
[0041] 将鸡胚病毒液肌肉注射15日龄的鹅、鸡各5羽，每羽0. 5ml，同时分别设空白对照 组。严格隔离饲养，每天观察试验动物发病和死亡情况。
[0042] 1. 2. 5 病毒 EID5tl测定
[0043] 将分离病毒用灭菌生理盐水作KT1?KT9稀释，并设立空白对照组，每个稀释度接 种5枚10日龄非免疫鸡胚，弃24h死亡胚，于接种后120h4°C过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊 液，测定其HA效价，并参考Reed-Muench方法计算出病毒EID 5Q。
[0044] 1. 2. 6脑内致病指数（ICPI)的测定
[0045] 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定的方法测定ICPI。取1日龄SPF 雏鸡10只，各脑内注射KT1稀释的新鲜毒液50yL(接种针头直径0. 45mm，长5mm);另取2 只1日龄SPF雏鸡以同样方法注射生理盐水50 μ L。接种后，每天在相应接种的时间观察并 记录雏鸡的状态，分正常（活动灵活，行动无共济失调现象）、发病（包括麻痹、卧地不起，但 不包括只表现迟钝的鸡）和死亡，观察8d，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值 (正常为〇、发病为1、死亡为2)累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的 累计总数的平均值。
[0046] 1. 2. 7鸡胚平均致死时间（MDT)的测定
[0047] 将病毒用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，自KT4?KTltl分别接种9?10日龄 SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0. Iml/枚，剩余病毒液4°C保存，8h后再将每个稀释度接种 另外5枚鸡胚。接种鸡胚于37°C孵化7天，每天早晚各观察1次，记录使所有鸡胚死亡的最 高稀释度致死鸡胚的平均时间。OEI推荐的判定标准是MDT < 60h为强毒型；60?90h为 中等毒力型；90h以上为低毒力。
[0048] 1. 3分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖
[0049] (1)在无菌条件下取9日龄鸡胚，取出胚胎置于灭菌平皿中，除去头、爪、翅、内脏， 用Hanks液漂洗3次，去除血污，并剪成1?2mm 3大小的块，加入Hank' s液充分冲洗，并 静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加 Hank' s液，如此反复冲洗3遍后，吸弃上 清液；于沉淀组织块内加入约4倍量的0. 25%胰酶溶液，振荡混匀后置于37°C水浴中感作 5min，每隔Imin轻轻摇动一次。
[0050] (2)消化完毕后立即小心吸弃上层胰酶溶液，沿瓶壁加入5?6mLDMEM轻洗2次； 之后加入20mL I XDMEM营养液，用大口吸管吹打数十次，并静置几分钟，待组织块下沉，吸 取上层液体，用6层纱布过滤；沉淀组织块中再加20mL的I XDMEM营养液，如此反复进行3 遍。按每个鸡胚80mL的量补加 DMEM营养液。
[0051] (3)吸取细胞液用计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2X106个/mL，以每孔 4mL的量加入到6孔培养板中，将其置入CO 2培养箱中，37°C培养24h，将6孔细胞培养板中 已长成单层的鸡胚成纤维原代细胞中的营养液吸弃，用Hanks液反复冲洗单层细胞3次；之 后，用不含血清的IXDMEM培养液将分离病毒尿囊液作IXlO 4倍稀释，接种于单层细胞，每 孔接种量为500 μ L，置37°C感作lh，其间每隔20min轻轻晃动细胞培养板一次，使病毒与 细胞充分接触、吸附；吸附完毕后吸出病毒液，每孔补加4mL含新生牛血清为2%的I XDMEM 营养液，将其置〇)2培养箱中37°C培养；同时，设空白对照孔；每日观察记录CPE情况，当细 胞病变达70 %时，经3次冻融后收毒，分装于玻璃瓶内，留样检测HA ;按照上述方法，将分离 到的鹅副粘病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传8-10代，直至分离毒在鸡胚成纤维细胞上增 殖良好。
[0052] 1. 4分离毒蚀斑纯化
[0053] (1)按照鸡胚成纤维原代细胞培养所叙述的方法，制备鸡胚成纤维原代细胞并接 毒，接毒后置37°C感作lh，其间每隔20min轻轻晃动6孔细胞培养板一次，使病毒与细胞充 分接触、吸附；吸附完毕后，吸出病毒液，铺一层不含中性红的营养琼脂糖，厚度约2mm，待 琼脂糖凝固后倒置于37°C、5% CO2培养箱中进行培养；
[0054] (2)有细胞病变出现时滴加100 μ L含量为1/10000的中性红溶液，倒置于37°C、 5% CO2培养箱中继续避光培养并观察出斑情况。当细胞培养板上出现清晰可见的蚀斑时， 即可进行挑斑。选择蚀斑间间距明显的培养孔，从中挑取具有代表性的优势蚀斑，用200 μ L 去尖吸头吸取选定的蚀斑后连同琼脂糖一起放入500 μ L不含血清的I XDMEM培养液中。 将含有蚀斑及琼脂糖的DMEM培养液反复冻融三次，使病毒充分释放；之后再按上述方法将 其做连续的10倍稀释（一般为IO 1?1〇4)后接种鸡胚成纤维原代单层细胞，按上述方法挑 斑。
[0055] 2、实验结果
[0056] 2. 1病毒分离结果
[0057] SPF鸡胚尿囊腔接种，鸡胚在48?120h死亡；致死胚体充血，尿囊膜水肿出血。
[0058] 2. 2血凝、血凝抑制试验检测结果
[0059] 尿囊液的HA效价为1 : 128,随着代次增加，HA效价增大，最高达1 : 512。
[0060] 分离病毒能被ND阳性血清所抑制，HI效为28, HI试验呈阳性；不能被EDS76阳性 血清、H5和H9禽流感阳性血清所抑制，HI试验呈阴性。
[0061] 2. 3病毒中和试验结果
[0062] 试验组鸡胚IOd后全部存活，而对照组鸡胚在48?120h全部死亡。
[0063] 2. 4动物回归试验结果
[0064] 接种病毒分离物的鹅、鸡均于第2d开始发病。病禽精神萎顿，食欲与饮水减少直 至废绝。病程2?3d，至接种后第6d全部死亡。对照组均未受影响。
[0065] 病死鹅的临诊症状和剖检病变与自然感染相似，接种后5d左右死亡，剖检肠道可 见散在性淡黄色痂块，易剥离，剥离后见溃疡面，胰腺有灰白色坏死灶，腺胃及肌胃粘膜充 血、出血。病死鸡的临诊症状和剖检病变与鸡新城疫非常相似。
[0066] 2. 5EID5(^UlJ定结果
[0067] 用 Reed 和 Muench 法计算毒株 EID5tl，得出分离毒株 EID5tl= 10 81V〇. 1ml。
[0068] 2. 6脑内致病指数（ICPI)及（MDT)的测定结果
[0069] ICPI = 13/80 = 0. 16 ;鸡胚平均致死时间（MDT)为114h，确定分离的毒株为低毒 力病毒。
[0070] 2. 7分离毒在鸡胚成纤维细胞中增殖结果
[0071] 将分离株接种在生长良好的CEF上，36h后开始出现典型的细胞病变，病变初期表 现为细胞聚缩，之后，合胞体数量逐渐增多、变大；60h时75% CEF出现细胞病变，细胞逐渐 脱落，细胞之间的空白区逐渐增大，残留的细胞呈拉网状结构（图1);当细胞病变达70% 时，收集细胞连同细胞液反复冻融三次，测定细胞液的HA效价为1 : 512。结果表明，分离 株具有CEF细胞适应株的特性。
[0072] 2. 8分离毒蚀斑纯化结果
[0073] 分离株滴加中性红5?8h后形成无色、透明、清亮的圆形蚀斑；镜检发现蚀斑中 心为圆缩成葡聚团状的不着色的死细胞，周围被吞噬大量中性红颗粒的正常细胞所包围。 挑选中等大小的5个蚀斑进行传代纯化，将分离到的5个病毒株（DQ01-DQ05)蚀斑克隆作 5 X IO3倍稀释，接种鸡胚成纤维细胞后置37°C孵育72h ;当细胞病变达70%时，经3次冻融 后收毒，并进行杂菌检验。同时，测定其血凝价（HA)及TCID5Q。
[0074] 分离到的5个病毒株DQOl?DQ05株HA及TCID5tl检测结果见表1。
[0075] 表IDQO1?DQ05株HA及TCID5tl检测结果
[0076]
【权利要求】
1. 一株分离的鹅副黏病毒（Goose paramyxovirus)鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，其 特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No. 9901。
2. 权利要求1所述的鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株在制备预防鹅副黏病 毒病的疫苗中的用途。
3. -种预防鹅副黏病毒病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1 所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株和药学上可接受的佐剂。
4. 一种制备预防鹅副黏病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)培养权利要求1所述鹅副黏病毒鸡胚成纤维细胞适应株DQ03株，收集病毒液；（2) 灭活病毒液；（3)离心，取病毒上清液，与佐剂混合，乳化，即得。
5. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1)所述培养是经鸡胚成纤维细胞 培养或者经SPF鸡胚培养；优选为，经鸡胚成纤维细胞培养。
6. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2)所述灭活是向病毒液中加入终 浓度为〇. 1%甲醛溶液，37°C灭活24小时。
7. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3)所述离心是5000r/min离心 30min〇
8. 按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3)所述病毒上清液与佐剂按照体 积比1 :1. 5混合；所述佐剂优选为进口油佐剂。
9. 由权利要求4至8任何一项所述方法制备得到的鹅副黏病毒灭活疫苗。
【文档编号】C12N7/00GK104498440SQ201410707310
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】孙德君, 丁国杰, 杨万秋, 梁宛楠, 李来旭, 宋扬, 藏玉婷, 刘鑫莹, 张智明, 李鑫, 窦海艳 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司