本发明属于天然产物开发利用领域，特别涉及一种显齿蛇葡萄素复合包埋物及其制备方法和应用。
背景技术：
显齿蛇葡萄素，又称二氢杨梅素，多提取自葡萄科蛇葡萄属的一种木质藤本植物，是一种活性丰富的黄酮类化合物，其具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、抗炎等功效。但是显齿蛇葡萄素的水溶性较低，因此限制了对它的开发利用。
天然黄酮类化合物在一般条件下大多结构容易被破坏，不稳定。于是人们希望能通过结构修饰、微胶囊技术等途径提高天然黄酮类化合物物化性质的稳定、改善其溶解性能、控制其释放等以便于能将其应用到工业产品中。
微胶囊技术是如今发展迅速且应用广泛的高新技术之一。微胶囊技术是指将气体、液体或固体包埋在微小而密封的胶囊中，使其在特定条件下才会以控制速率进行释放的技术。微胶囊是一个小球体，它的周围是被材料均匀包裹。被包埋在里面的物质叫芯材，而包埋芯材形成微胶囊的材料称为壁材。微胶囊的大小和形状与原材料和制备方法有关。常用的壁材包括脂类、蛋白质、碳水化学物等，如直链淀粉、绿豆直链淀粉、壳聚糖、明胶、阿拉伯胶、麦芽糊精、乙基纤维素等。天然黄酮类化合物经过壁材包埋后，可以一定程度上避免光热的直接影响，并且有一定的缓释作用，是提高天然黄酮类物质稳定性的有效手段。微胶囊技术对提高天然黄酮类物质的稳定性有着重要的作用，该技术经济可行，但是制备出的粒子大小一般为几微米至几毫米不等，形状多样，不利于体内吸收，而且多采用喷雾干燥的方法进行，制备过程温度较高，会造成天然黄酮类类物质的损失。纳米技术的发展，填补了微胶囊技术的缺陷。与微胶囊技术相比，纳米包埋技术制备过程反应温和，粒子粒径小且可控，更易于人体吸收。直链淀粉是一种常用于包埋脂溶性食品材料的壁材，它是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键连接而成的直链分子，呈右手螺旋结构，螺旋内部只含氢原子，是亲油的，羟基位于螺旋外侧。这种“内腔疏水、外腔亲水”的特殊结构，使得直链淀粉可以作为一种主体分子，通过疏水相互作用与客体风味分子形成包合物，避免光、热、氧等的破坏作用，也可降低风味物质的损失。本项目通过制备绿豆直链淀粉/羧甲基壳聚糖纳米乳，包埋显齿蛇葡萄素，能够极大提高其稳定性，扩大其应用范围，提高其工业产品的货架期。
虽然直链淀粉作为一种非常常见的包埋壁材，但是它的水溶性还不足够好，使得局限了其在工业大规模产品生产中的应用。壳聚糖虽然可以包封亲水性活性物质，是一种优良的载体，但是其只能溶于酸性溶液中，不溶于中性和碱性溶液中，这使壳聚糖的应用受到了很大的限制。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种显齿蛇葡萄素复合包埋物的制备方法。本发明采用包埋的方法提高显齿蛇葡萄素的水溶性能，使得其工业应用扩大了可能性，并且使用绿豆直链淀粉和羧甲基壳聚糖作为包埋的壁材，绿色环保；本发明将绿豆直链淀粉进行改性，增大其亲水性，使用羧甲基壳聚糖作为复合材料原料，克服了酸溶性壳聚糖的不利因素。并且绿豆直链淀粉/壳聚糖作为天然生物复合材料，同时具备了直链淀粉和壳聚糖的特点，比单独使用直链淀粉或壳聚糖表现出更多优点。
本发明的又一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的显齿蛇葡萄素复合包埋物。
本发明的再一目的在于提供一种上述显齿蛇葡萄素复合包埋物的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种显齿蛇葡萄素复合包埋物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.5g的绿豆直链淀粉溶于5ml的无水二甲基亚砜和5ml的异丙醇混合液中，加入12.5ml浓度为1m的naoh水溶液，接着加入2ml的环氧氯丙烷；室温下，于氮气中搅拌48h；用盐酸调节反应溶液的ph值至7.0，用丙酮沉淀反应混合物，所得沉淀物用去离子水溶解，转移至透析袋中，以去离子水为透析介质在室温下进行透析纯化；透析结束后，收集透析袋中的样品进行冷冻干燥，得到纯化的改性绿豆直链淀粉；
(2)用去离子水制备1-4mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液，用质量分数0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液的ph值至中性；取5ml羧甲基壳聚糖溶液，加入改性绿豆直链淀粉，得到混合溶液，其中羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳与改性绿豆直链淀粉的重量比为1：1-4；在800rpm磁力搅拌下，向混合溶液中加1-3ml浓度为1-5mg/ml的cacl2溶液，继续搅拌30-120min，制得改性绿豆直链淀粉/羧甲基壳聚糖纳米溶液；
(3)用去离子水制备显齿蛇葡萄素溶液，加入同等质量的改性绿豆直链淀粉/羧甲基壳聚糖纳米溶液，搅拌，调节ph值至中性，得到显齿蛇葡萄素复合包埋物。
步骤(1)所述透析袋的截留分子量为1000da。
步骤(2)所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1mg/ml，cacl2溶液的浓度为1mg/ml，cacl2溶液的用量为2ml。
步骤(2)所述羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳与改性绿豆直链淀粉的重量比为1：1。
步骤(2)所述搅拌的时间为30min。
一种由上述的制备方法制备得到的显齿蛇葡萄素复合包埋物。
上述的显齿蛇葡萄素复合包埋物在制备功能性饮料中或天然产物药物领域中的应用。
所述功能性饮料为具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳功能的饮料。
步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液的浓度优选为1mg/ml，因为随着羧甲基壳聚糖浓度的增加，纳米粒的粒径具有明显增大的趋势，羧甲基壳聚糖的浓度的提高，混合液的粘度会增加，较大的粘度会导致溶液表面张力的增大，阻止其扩散过程快速进行，因此会形成的纳米颗粒会相互点附，形成了比较大的胶团微粒；
步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液中的羧甲基壳与改性绿豆直链淀粉的重量比优选为1：1，因为低浓度的绿豆直链淀粉能够促进自身合并进入羧甲基壳聚糖，从而形成较大粒径的颗粒，而高浓度绿豆直链淀粉，因其与羧甲基壳聚糖之间产生更多的氢键等分子间作用力，从而形成较小粒径纳米颗粒。当绿豆直链淀粉与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1时，比没有添加绿豆直链淀粉的纳米颗粒的粒径大，但其pdi(多分散性指数)变小，因此形成的纳米颗粒的分布和分散度更高，综合考虑，选1：1最优；
步骤(2)中cacl2溶液的浓度优选为1mg/ml因为随着cacl2浓度的增大，粒径和pdi都逐渐增大。这是因为大量的cmc分子链与cacl2交联在一起，更多的分子间氢键形成，使得粒径显著地增加，纳米颗粒容易聚集在一起，分散性降低；
步骤(2)中cacl2溶液的用量优选为2ml，因为当羧甲基壳聚糖与cacl2的质量比为5:1时，纳米粒径较大，可能是因为cacl2的质量较低，未能充分与羧甲基壳聚糖的-coo-作用，因此形成的粒子松散，且分散性较差；当羧甲基壳聚糖与cacl2的质量比为5:2时，羧甲基壳聚糖与cacl2交联比例恰当，使得纳米颗粒呈现紧密状态，粒径较小。；当羧甲基壳聚糖与cacl2的质量比为5:3时，纳米颗粒的粒径相应增大，这是因为羧甲基壳聚糖质量增大后，纳米颗粒发生的接触吸附机会增大，容易使得粒子发生聚集，另外，有可能是因为羧甲基壳聚糖的不断加入，包覆了之前已经形成的纳米颗粒或者团聚的纳米粒团，导致溶液体系的粒径分散不均匀，因而pdi也相应增加；
步骤(2)中选择搅拌时间优选为30min，因为随着搅拌时间的增加，纳米颗粒的粒径并没有发生很大的改变，但是其pdi呈现增大的趋势，这是因为在一定的搅拌转速下，溶液中纳米颗粒在剪切力的作用下，分散均匀，在30min的时候已经反应完全，形成大小均一的粒子。当搅拌时间延长到120min时，鉴于搅拌时间的增加，在剪切力不断作用下，溶质的分子运动会增强，液滴碰撞机会增多，机械搅拌时间过长会对纳米颗粒造成破损，以上因素都有可能导致纳米颗粒碎片的产生，而使pdi增大。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)绿豆直链淀粉是一种非常常见的包埋壁材，因为其拥有表面亲水，内空腔疏水的特殊结构，非常适合包埋一些天然的不稳定的疏水物质，比如显齿蛇葡萄素，包埋后使得显齿蛇葡萄素的产品能大大提高工业条件适应性。
(2)壳聚糖是一种环境友好型化合物，具有生物降解性和生物相容性，被广泛应用于纳米颗粒的制备。
(3)本发明绿豆直链淀粉/壳聚糖作为天然生物复合材料，同时具备了绿豆直链淀粉和壳聚糖的特点，比单独使用壳聚糖或绿豆直链淀粉表现出更多优点。绿豆直链淀粉/壳聚糖复合负载体系在活性物质载体方面表现出良好的性能，除了有良好的缓释效果外，对于提高活性物质的体内吸收利用率亦有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)改性绿豆直链淀粉的制备
将1.5g的绿豆直链淀粉溶于5ml的无水二甲基亚砜和5ml的异丙醇混合液中，加入12.5ml的1m的naoh水溶液，接着加入2ml的环氧氯丙烷。室温下，于氮气中搅拌48h。用盐酸调节反应溶液的ph值至7.0，用过量的丙酮沉淀反应混合物，所得沉淀物用少量的去离子水溶解，转移至透析袋(mwco，1000da)中，以去离子水为透析介质在室温下进行透析纯化。透析结束后，收集透析袋中的样品进行冷冻干燥，得到纯化的改性绿豆直链淀粉。
(2)改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备
用去离子水制备1mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液，用质量浓度0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液的ph值至中性，取5ml羧甲基壳聚糖溶液，加入与羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的重量比为1：1的改性绿豆直链淀粉，800rpm磁力搅拌下，向5ml的混合液滴加2mlcacl2溶液(1mg/ml)，继续搅拌30min，制得改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米溶液。
(3)用去离子水制备显齿蛇葡萄素溶液，加入同等质量的改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米溶液，搅拌，调节ph值至中性，得到显齿蛇葡萄素复合包埋物。
实施例2
(1)改性绿豆直链淀粉的制备
将1.5g的绿豆直链淀粉溶于5ml的无水二甲基亚砜和5ml的异丙醇混合液中，加入12.5ml的1m的naoh水溶液，接着加入2ml的环氧氯丙烷。室温下，于氮气中搅拌48h。用盐酸调节反应溶液的ph值至7.0，用过量的丙酮沉淀反应混合物，所得沉淀物用少量的去离子水溶解，转移至透析袋(mwco，1000da)中，以去离子水为透析介质在室温下进行透析纯化。透析结束后，收集透析袋中的样品进行冷冻干燥，得到纯化的改性绿豆直链淀粉。
(2)改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米溶液的制备
用去离子水制备1mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液，用质量分数0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液的ph值至中性，取5ml羧甲基壳聚糖溶液，加入与羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的重量比为1：2的改性绿豆直链淀粉，800rpm磁力搅拌下，向5ml的混合液滴加2mlcacl2溶液(1mg/ml)，继续搅拌60min，制得改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米溶液。
(3)用去离子水制备显齿蛇葡萄素溶液，加入同等质量改性绿豆直链淀粉羧甲基壳聚糖纳米溶液，搅拌，调节ph值至中性，得到显齿蛇葡萄素复合包埋物。
对比例1
(1)羧甲基壳聚糖纳米溶液的制备
用去离子水制备1mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液，用质量浓度0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液的ph至中性，取5ml羧甲基壳聚糖溶液，800rpm磁力搅拌下，向5ml的混合液滴加2mlcacl2溶液(1mg/ml)，继续搅拌30min，制得羧甲基壳聚糖纳米溶液。
(2)显齿蛇葡萄素负载羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备
用去离子水制备显齿蛇葡萄素溶液，加入同等质量步骤(1)所得羧甲基壳聚糖纳米溶液，搅拌，调节ph值至中性，得到显齿蛇葡萄素负载羧甲基壳聚糖纳米溶液。
对实施例1和2所得显齿蛇葡萄素复合包埋物和对比例1所得显齿蛇葡萄素负载羧甲基壳聚糖纳米溶液进行效果验证：
各取7ml实施例1和2所得显齿蛇葡萄素复合包埋物和对比例1所得显齿蛇葡萄素负载羧甲基壳聚糖纳米溶液高速低温离心(120000rpm；30min；4℃)，取上清液体，转移至10ml容量瓶，加入0.5ml甲酸，定容。用hplc测定上清液中显齿蛇葡萄素的含量，按照一下公式计算显齿蛇葡萄纳米的包封率和负载率。
式中：m1为显齿蛇葡萄素投入量，m2为上清液中显齿蛇葡萄素的量，m为显齿蛇葡萄素纳米颗粒的重量。
发现使用改性绿豆直链淀粉/羧甲基壳聚糖复合纳米乳比单独使用羧甲基壳聚糖纳米乳，对于显齿蛇葡萄素的包封率和负载率都可以提高10％左右。并且能够与显齿蛇葡萄素产生包合作用，从而一定程度上阻隔了光热对显齿蛇葡萄素的损失，提高显齿蛇葡萄素的光热稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。