一种抑制低密度脂蛋白氧化的乳饮料及其制备方法与流程

本发明属于食品工程领域，具体涉及一种抑制低密度脂蛋白ldl氧化的乳饮料及其制备方法。

背景技术：

在正常生理活动中，机体内自由基的产生与清除处于一种动态平衡状态，不会对机体造成损害。但是随着年龄的增长以及生理机能的衰退，机体正常的氧化还原平衡将被破坏，体内会积累过量的活性氧自由基(ros)，同时导致脂质、蛋白质和dna氧化性退化、激活致癌原、抑制细胞内抗氧化系统等氧化损伤。这些氧化损伤又会引起机体一系列慢性疾病的发生，例如糖尿病，癌症，神经组织退化紊乱，心血管疾病等。其中，动脉粥样硬化类心血管疾病是人类死亡的主要杀手。动脉粥样硬化主要是由低密度脂蛋白(ldl)氧化引起的。血管壁处的氧化应激会引起低密度脂蛋白(ldl)的氧化，氧化性的低密度脂蛋白(ox-ldl)不能被ldl受体识别、代谢，而是被单核巨噬细胞通过细胞膜上的清道夫受体摄取，形成泡沫细胞和脂质斑块，从而形成动脉粥样硬化。为了预防动脉粥样硬化，抑制ldl氧化，机体可以通过膳食摄取具有抗氧化活性和明显清除ros能力的化合物，提高机体的抗氧化能力。

抗氧化肽，是来源于蛋白质的一类具有清除自由基、供氢/供电子、螯合金属离子、淬灭单线态氧、分解过氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化等功效的活性肽。近年来，天然的抗氧化肽因其蛋白来源丰富及自身的天然性和安全性而在抗氧化领域备受瞩目，已成为药品和食品领域的研究热点。目前已有大量研究报道了动植物来源的蛋白质酶解物或生物活性肽中的抗氧化成分，如大豆、玉米、荞麦、鸡蛋、牛奶等。

近年来，随着人们生活水平的提高，饮食观念的变化，人们对饮料的营养性、保健性的要求越来越高。蛋白饮料以其独有特性渐露头角，其中活性肽由于具有低过敏性以及各种特殊的生理活性而逐渐受到关注。目前，活性肽抑制ldl氧化的研究大多数停留在实验室阶段，还没有专门的抑制ldl氧化的活性肽乳饮料。

本发明以脱脂牛奶为原料，经蛋白酶适当水解后制备具有较好的抑制ldl氧化的功能性乳饮料。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种具有抑制低密度脂蛋白ldl氧化的乳饮料及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种抑制低密度脂蛋白氧化的乳饮料的制备方法，包括以下步骤：

1)将低脂牛奶和/或脱脂牛奶进行离心处理，取上清液；

2)将上清液采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶的复合物在ph为7～9，50～60℃条件下水解1.5～4h，获得水解液；

3)将水解液进行钝化处理，获得钝化处理的水解液；将钝化处理的水解液与饮料添加剂混合，杀菌，获得抑制低密度脂蛋白氧化的乳饮料。

步骤1)中所述离心的转速为6000～10000r/min；离心的时间为10～15min；所述上清液在进行水解之前进行预热处理，预热的温度为45～60℃，预热的时间为5～10min；

步骤2)中所述复合物的添加量为上清液质量的0.5％～4％，优选为2％；所述碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为(1.5～4)：1，优选为3:1。

步骤2)中所述ph优选为8。

步骤3)中所述钝化处理是指灭酶处理，即煮沸5～10min。

步骤4)中所述饮料添加剂为蔗糖，原味酸奶香精和天然牛奶香精。

所述蔗糖与钝化处理的水解液的质量体积比为(7.5～12.5)g:100ml；所述原味酸奶香精与钝化处理的水解液的体积比为(0.25～1.25):100；天然牛奶香精与钝化处理的水解液的体积比为(0.125～0.625):100。

所述杀菌为巴氏杀菌；杀菌温度为60℃～80℃，时间为10～30分钟。

步骤(2)中水解的温度优选为55℃，水解的时间为2小时。

步骤(4)中蔗糖的添加量优选为10％(w/v)。

原味酸奶香精的添加量优选为0.5％(v/v)。

天然牛奶香精的添加量优选为0.375％(v/v)。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以脱脂牛奶为原料制备附加值更高的功能乳饮料，成本低廉，方法操作简单。

(2)本发明制得的乳饮料均匀一致、酸甜适口，具有较好的抗氧化能力以及抑制ldl氧化的功能，能够有效预防动脉粥样硬化的发生。

(3)本发明的方法能够获得更多含有碱性氨基酸的多肽，而肽序列中碱性氨基酸含量高，活性肽带有正电荷，抑制ldl氧化的效果更好。

附图说明

图1为对比例及实施例1～3乳饮料的感官评分结果柱状图；

图2为对比例和实施例1～3中乳饮料的抗氧化能力柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但本发明的实施方式不限于以下实施例。

实施例1

一种抑制ldl氧化的的乳饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)牛奶前处理：将低脂牛奶在6000rap/min条件下离心15分钟，取上清液，随后在55℃水浴中预热10分钟；

(2)蛋白酶水解：向预热后的牛奶上清液中添加2％(w/v)(是指100ml预热的牛奶上清液中加入2g蛋白酶复合物)复合物(碱性蛋白酶(2×10⁵u/g，河南金诚生物科技)和风味蛋白酶(8×10⁵u/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)，两者的质量比为4:1)，然后在ph为8，55℃条件下振荡水解2小时得到牛奶水解液，其中肽的含量为58％，分子量在1000-3500da之间；

(3)钝化蛋白酶：将步骤(2)中得到的牛奶水解液在100℃条件下煮沸10分钟，使其中的蛋白酶钝化；

(4)饮料调配：将步骤(3)中的牛奶水解液冷却至室温后，向其中添加10％(w/v)的蔗糖(是指100ml牛奶水解液中加入10g蔗糖)、0.25％(v/v)的原味酸奶香精和0.125％(v/v)的天然牛奶香精，充分搅拌混匀；

(5)巴氏杀菌：将调配好的混合液进行巴氏杀菌，杀菌温度为65℃，时间为30分钟；

(6)无菌灌装：巴氏杀菌后的混合液经冷却、无菌灌装后，即得能够抑制ldl氧化的乳饮料。

实施例2

一种抑制ldl氧化的的乳饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)牛奶前处理：将低脂牛奶在6000rap/min条件下离心10分钟，取上清液，随后在45℃水浴中预热5分钟；

(2)蛋白酶水解：向预热后的牛奶上清液中添加0.5％(w/v)的复合物(碱性蛋白酶(2×10⁵u/g，河南金诚生物科技)和风味蛋白酶(8×10⁵u/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)，两者的质量比为2.5:1)，然后在ph为7，50℃条件下振荡水解1.5小时得到牛奶水解液，其中肽的含量为42％，分子量在2500-7000da之间；

(3)钝化蛋白酶：将步骤(2)中得到的牛奶水解液在100℃条件下煮沸5分钟，使其中的蛋白酶钝化；

(4)饮料调配：将步骤(3)中的牛奶水解液冷却至室温后，向其中添加7.5％(w/v)的蔗糖、0.5％(v/v)的原味酸奶香精和0.375％(v/v)的天然牛奶香精，充分搅拌混匀；

(5)巴氏杀菌：将调配好的混合液进行巴氏杀菌，杀菌温度为65℃，时间为30分钟；

(6)无菌灌装：巴氏杀菌后的混合液经冷却、无菌灌装后，即得能够抑制ldl氧化的乳饮料。

实施例3

一种抑制ldl氧化的的乳饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)牛奶前处理：将低脂牛奶在6000rap/min条件下离心10分钟，取上清液，随后在55℃水浴中预热10分钟；

(2)蛋白酶水解：向预热后的牛奶中添加4％(w/v)的复合物(碱性蛋白酶(2×10⁵u/g，河南金诚生物科技)和风味蛋白酶(8×10⁵u/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)，两者的质量比为1.5:1)，然后在ph为9，55℃条件下振荡水解4小时得到牛奶水解液，其中肽的含量为34％，分子量在5000-8000da之间；

(3)钝化蛋白酶：将步骤(2)中得到的牛奶水解液在100℃条件下煮沸5分钟，使其中的蛋白酶钝化；

(4)饮料调配：将步骤(3)中的牛奶水解液冷却至室温后，向其中添加12.5％(w/v)的蔗糖、1.25％(v/v)的原味酸奶香精和0.625％(v/v)的天然牛奶香精，充分搅拌混匀；

(5)巴氏杀菌：将调配好的混合液进行巴氏杀菌，杀菌温度为65℃，时间为30分钟；

(6)无菌灌装：巴氏杀菌后的混合液经冷却、无菌灌装后，即得一种能够抑制ldl氧化的乳饮料。

对比例

一种抑制ldl氧化的的乳饮料的制备方法，包括以下步骤

(1)牛奶前处理：将低脂牛奶在6000rap/min条件下离心10分钟，取上清液，随后在55℃水浴中预热10分钟；

(2)蛋白酶水解：向预热后的牛奶上清液中添加4％(w/v)的木瓜蛋白酶，然后在ph为7，55℃条件下振荡水解4小时得到牛奶水解液，其中肽的含量为17％，分子量在5500-10000da之间；

(3)钝化蛋白酶：将步骤(2)中得到的牛奶水解液在100℃条件下煮沸5分钟，使其中的蛋白酶钝化；

(4)饮料调配：将步骤(3)中的牛奶水解液冷却至室温后，向其中添加12.5％(w/v)的蔗糖、1.25％(v/v)的原味酸奶香精和0.625％(v/v)的天然牛奶香精，充分搅拌混匀；

(5)巴氏杀菌：将调配好的混合液进行巴氏杀菌，杀菌温度为65℃，时间为30分钟；

(6)无菌灌装：巴氏杀菌后的混合液经冷却、无菌灌装后，即得能够抑制ldl氧化的乳饮料。

效果测试：

分别对实施例1～3以及对比例中制备的乳饮料的色泽、口感滋味及组织状态进行感官评分，同时对乳饮料的抗氧化能力(teac和orac)以及抑制ldl氧化的能力进行测定，测定方法如下：

teac法测定抗氧化能力：abts·+母液的配制：以去离子水配制abts·+母液，使其浓度为7mmol/l，然后加入过硫酸钾，并使过硫酸钾的浓度为2.45mmol/l。充分混匀后，在室温下，将混合液置于黑暗环境中放置12-16h。

abts·+工作液的配制：用75mm，ph7.4磷酸盐缓冲液(pbs)在避光条件下稀释abts·+母液，使其在414nm处的吸光值为1.1±0.02，得到abts·+工作液。工作液现配现用。

样品测量：取10μl待测样品溶液和50μlpbs缓冲溶液于白色96孔板样品孔中，随后向其中添加100μlabts·+工作液，充分振荡后在黑暗条件下反应6min。反应结束后采用多功能酶标仪(infinite200pro，tecantradingag,switzerland)读取414nm出的吸光值。

trolox标准曲线制作:分别配制浓度为0-0.34mmol/l的trolox溶液作为标准品。然后采用与样品相同的测量方法测定不同浓度的trolox溶液在414nm处的吸光值，然后以trolox浓度对abts·+自由基清除率做标准曲线。

abts·+清除率计算公式为：abts·+清除率(％)＝(a0-a1)/a0*100

其中，a0为对照组在414nm波长处的吸光度值；a1为待测样品在414nm波长处的吸光度值。

orac法测定抗氧化能力：orac的测定方法以荧光素钠盐作为荧光物质，所有反应试剂均用75mmol/l，ph7.4的磷酸缓冲液溶解并配置。20μl待测样品与120μl荧光工作液(70nmol/l)先后加入黑色96孔板内，混合液在37℃条件下孵育12min，然后用多通道加液器迅速加入60μlaaph溶液(12mmol/l)于96孔板各个反应孔中。最后将黑色96孔板放入多功能酶标仪中进行测定。

测定参数：激发波长：485nm，发射波长：520nm，反应温度：37℃。每次读数之前微孔板振荡2s，每1min测定一次荧光值，连续测定120min。

netauc＝aucsample-aucblank

式中：aucsample代表样品的荧光衰退面积，aucblank代表空白对照的荧光衰退面积。

其中auc的计算公式为：

f0代表反应0min时的初始荧光值，fi代表反应imin时的荧光值。

标准曲线制作：以trolox作为标准品，浓度范围为10-80μmol/l，以75mmol/l，ph7.4的磷酸缓冲液作为空白对照，采用相同的测定方法，监测120min内，荧光值的变化。以trolox浓度为横坐标，netauc为纵坐标，绘制标准曲线。

抑制ldl氧化：将ldl用75mmol/l，ph7.4的磷酸缓冲液稀释至250μg/ml。取20μl稀释后的ldl(250μg/ml)加入uv-96孔板中，再分别加入20μl待测样品于uv-96孔板对应的孔内，随后采用多通道加液器分别加入140μl磷酸缓冲液，之后将uv-96孔板置于37℃的环境中预热10min。随后利用多通道加液器迅速向96孔板内加入20μl浓度为25μmol/mlcuso4溶液，引发氧化反应。实验中以磷酸缓冲液代替样品和cuso4溶液作为空白组，以磷酸缓冲液代替样品作为对照组。

测定参数：测定波长：234nm，反应温度：37℃，每10min测定一次吸光值，连续测定600min。最终将测得的各点的吸光值连成平滑曲线即为ldl氧化曲线，延滞时间定义为氧化曲线的最大斜率与平行于x轴的初始吸光值轴的截距所得的时间。

对比例和实施例1～3测定结果如下。表1为乳饮料感官评分标准。图1为对比例及实施例1～3乳饮料的感官评分结果柱状图；图2为对比例和实施例1～3中乳饮料的抗氧化能力柱状图；表2为对比例和实施例1～3中乳饮料抑制ldl氧化的效果。

表1乳饮料感官评分标准

表2对比例和实施例1～3中乳饮料抑制ldl氧化的效果

从图1～2以及表2中结果可以看出：本发明制备的乳饮料符合大众口味，且具有较好的抗氧化和抑制ldl氧化的能力，能够起到预防动脉粥样硬化的作用。