一种富硒双歧杆菌微胶囊的制作方法

本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种富硒双歧杆菌微胶囊。
背景技术：
：双歧杆菌是人体肠道内重要的生理性益生菌之一，对人体健康十分有益，主要有调节肠道菌群、抗氧化、增强机体免疫力等功效，富硒双歧杆菌是指通过在培养双歧杆菌的培养基中加入硒元素而得到的一种富硒益生菌，可以将硒元素和益生菌的功效结合，在此前的公开专利(cn107164295a、cn108721337a)中，已分别详细阐述了具体的制备过程和突出的预防肿瘤化疗肠道毒性的功效。由于双歧杆菌是一类生长在ph为4.5～8.5之间的严格厌氧的革兰氏阳性细菌，对外界的不利环境如氧气、湿度、温度以及胃肠道内的胃酸、胆盐等比较敏感，因此在加工成各种制剂，常温运输、和通过胃肠道的过程中其活菌数会大量的减少，因此寻找一种能够保护双歧杆菌的制剂手段是十分有必要的。微囊化技术是一种包埋益生菌的有效手段，采用天然或合成的高分子材料为囊材，通过化学、物理或物理化学法将活性物质即囊芯包裹起来，从而形成具有半透性或密封囊膜的微型胶囊，将益生菌微囊化之后，能在一定程度上使其与外界环境隔离，提高其对不利环境的耐受性，此外，可以通过选择具有特殊性能的壁材，赋予微囊化后的益生菌在肠道内定位、缓慢释放的能力。现有技术在益生菌微囊化制备工艺中，微囊包埋率和菌体的存活率是考察制剂质量的重要指标，同时制剂工艺的繁简以及成本等因素也是是否符合工业化大规模生产的考察因素。中国发明专利申请cn105105144a公开了一种制备益生菌微胶囊的方法，该方法主要采用的菌种为乳杆菌，使用乳化法，以牛乳蛋白作为壁材，利用凝乳酶降解酪蛋白，在ca2+的存在下与酪蛋白发生交联，从而形成微胶囊，然而该方法工艺复杂，壁材成本如凝乳酶较昂贵，并且包埋率和冻干存活率低，微囊的常温储存稳定性较差。文献《microencapsulationinalginateandchitosanmicrogelstoenhanceviabilityofbifidobacteriumlongumfororaldelivery》(yeungtw,eliff,tianika,etal.[j].frontiersinmicrobiology,2016,7(e43928).)公开了一种制备长双歧杆菌微胶囊的方法，采用特殊的微胶囊装置通过挤压的形式制备得到粒径在200～300μm左右的长双歧杆菌微胶囊。这种制备益生菌微胶囊的方式受装置效率的影响不易放大生产，并且制备得到的微胶囊不耐胃酸和胆盐的侵害。目前开发包埋率高、存活率高、制备流程简单的双歧杆菌微胶囊工艺是本领域技术人员的开发重点。技术实现要素：本发明针对现有技术不足，提供了一种富硒双歧杆菌微胶囊，通过使用高分子成膜材料作为囊材，使用相分离法，利用内源乳化技术和静电吸附原理，显著增加了微胶囊对富硒双歧杆菌的包埋率，提高了富硒双歧杆菌的耐酸耐胆盐性质，延长了富硒双歧杆菌在常温下的保存时间。进一步的，通过使用冻干保护剂，显著提高富硒双歧杆菌的冻干存活率。本发明具体技术方案如下：一种富硒双歧杆菌微胶囊，采用海藻酸钙作为囊材，采用相分离法制得，具体方法为：将海藻酸钠溶液与富硒双歧杆菌菌泥、碳酸钙粉末混合均匀，滴加到含有乳化剂的植物油(优选大豆油)中，搅拌形成乳状液，再依次加入含有冰醋酸的植物油和乳化剂溶液，搅拌后静置，分离油相，将水相离心，得到微胶囊。本发明所述的富硒双歧杆菌可通过在培养双歧杆菌的培养基中加入硒元素而得到的一种富硒益生菌。本发明优选的一种双歧杆菌，所述双歧杆菌的16srdna核苷酸序列如seqidno：1所示。所述双歧杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏时间2018.10.11，保藏编号为cgmccno.16573。优选的，富硒双歧杆菌菌泥的菌密度为1010～1011cfu/g。本发明所述的微胶囊，优选所述海藻酸钠溶液浓度为1.5％(w/v)。优选碳酸钙与海藻酸钠质量比为1:6。优选碳酸钙与冰醋酸摩尔比为1:2.8。优选乳化剂为吐温80，更优选浓度为1％(w/v)。优选加入含有冰醋酸的植物油和乳化剂溶液前、后的搅拌时间各为15min。搅拌速度为600rpm。优选所述菌泥与海藻酸钠质量比为20:3。本发明所述的微胶囊，还可以进一步将微胶囊进行包衣。优选包衣材料为壳聚糖。制备方法包括将未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊重悬于壳聚糖溶液中，搅拌，待包衣完成后，离心得到包衣的富硒双歧杆菌微胶囊。本发明所述微胶囊可使用冻干保护剂冷冻干燥制得，所述冻干保护剂包括海藻糖、脱脂奶粉和vc-na，优选所述海藻糖、脱脂奶粉、vc-na和富硒双歧杆菌菌泥的质量比为10:20:2:100。优选的，本发明使用的冻干工艺为：第一阶段：-40℃，4h，预动结束后抽真空；第二阶段：5℃，10h；第三阶段：15℃，10h。本发明将菌液与壁材溶液混合，然后与植物油如大豆油以及乳化剂再混合，充分搅拌均匀后形成w/o型乳状液，然后再向体系中加入硬化剂，水溶性多聚物因交联作用在油相中形成微小的不可溶的胶珠颗粒，最后利用离心或膜过滤技术收集微胶囊，可以得到粒径小于200μm的粒子，不影响益生菌微囊加入到食品或饮料中的口感，通过对微胶囊以及包衣制备工艺中的试剂、材料及其用量比例的筛选，提高了富硒双歧杆菌微胶囊的包埋率并且实现工业化生产。进一步的，本发明利用微胶囊包衣技术又在益生菌微囊化之后，通过静电吸附法或凝聚法在其表面进行包衣(涂层)，减少益生菌在高氧、高ph环境中的暴露，提高其稳定性。本发明通过对冻干保护剂的筛选，提高富硒双歧杆菌的存活率，最终获得理想的富硒双歧杆菌微胶囊制剂(制备示意图如图1所示)。本发明优点：1.本发明的操作步骤和需要的设备简单，容易实现工业化放大生产；2.本发明使用的材料均为食品级材料，制备过程快速温和，包埋率高达98％，粒径小于200μm，具有很好的分散性，不会影响加入到饮料、酸奶、牛奶中的口感；3.本发明制备得到的微胶囊能够显著提高富硒双歧杆菌的耐酸和耐胆盐性质，能够保证足够数量的富硒双歧杆菌通过胃部到达肠道内发挥作用；提高富硒双歧杆菌在常温环境下的储存稳定性，因此可以延长富硒双歧杆菌制品的保存期，降低冷链运输成本；4.本发明采用的冻干保护剂可以显著的提高富硒双歧杆菌的冻干存活率，冻干存活率高达85％。常温稳定性结果显示，在180d内，富硒双歧杆菌微胶囊的活菌数仍在108cfu/g左右。附图说明图1为富硒双歧杆菌微胶囊制备示意图。图2为富硒双歧杆菌微胶囊冻干后的扫描电镜图。图3为富硒双歧杆菌微胶囊的耐胃酸和耐胆盐结果图。图4为富硒双歧杆菌微胶囊的耐常温贮藏结果图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但是本发明不限于所给出的例子。下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实例。实施例1富硒双歧杆菌的制备本发明所用长双歧杆菌dd98(拉丁名bifidobacteriumlongum)，16srdna核苷酸序列如seqidno：1所示。所述双歧杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.16573。rcm培养基的主要组成为牛肉膏，蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，淀粉，氯化钠，乙酸钠，l-半胱氨酸盐酸盐，各个成分的含量可以依据本领域的常规知识进行调整。优选地，每10份rcm培养基按重量份数组成为：牛肉膏0.1份，蛋白胨0.05份，酵母粉0.03份，葡萄糖0.05份，淀粉0.01份，氯化钠0.05份，乙酸钠0.03份，l-半胱氨酸盐酸盐0.005份，ph6.8±0.2，其余为水。培养方法：将长双歧杆菌接种于rcm液体培养基中，接种量体积比，即种子液与rcm液体培养基的体积比为1％，37±1℃厌氧培养8h，为一级种子，将一级种子液按接种量体积比5％接种于3l连续培养装置中，培养基装液量为50％，连续通氮气保持厌氧，37±1℃培养16h后，开始使用含有一定浓度硒(亚硒酸钠)的培养基进行连续补料(na2seo3中se质量分数为45.7％，即含100μg/ml的na2seo3培养基中折合se的含量为45.7μg/ml)，补料次数为2-4次，补料速度为1500ml/24h～1500ml/12h，每次补料量为3l，补料终点时硒浓度在20～200μg/ml之间。在补料终点时放出全部富硒双歧杆菌发酵液，于10000rpm的条件下离心10min(allegratm25rcentrifuge,beckman)，弃去上清，离心得到的菌体用无菌的nacl溶液(9.0g/l)洗涤两次后，得到浓缩富硒双歧杆菌菌泥，此时浓缩菌液的菌密度大概在1010～1011cfu/g，最后利用平板计数法对该浓缩菌液进行精确计数。硒含量的检测方法参考文献《gb5009.93-2010食品中硒的测定》。实施例2富硒双歧杆菌微胶囊制备将海藻酸钠溶液与富硒双歧杆菌菌泥、碳酸钙粉末混合均匀，然后将上述混合液逐滴滴加到含有乳化剂的大豆油中，搅拌，再向不断搅拌的乳状液中加入含有冰醋酸的大豆油，搅拌，向其中加入乳化剂溶液，搅拌后静置，待微囊沉到水相底部，吸去油相，将水相离心(3800r/min，离心2min)，得到微胶囊，然后使用洗涤介质(1％乳化剂溶液)洗涤微囊2次，除去残余的油相，最后用无菌生理盐水洗涤2次，得到未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊。按照表1对各工艺参数进行筛选以上研究结果表明：1.吐温80作为乳化剂时，微囊的包埋效率更高。2.随着乳化剂浓度升高，油水表面张力逐渐降低，微囊粒径逐渐减小，但由于高浓度乳化剂降低了冰醋酸进入体系的速度及量，导致包埋率先升高后降低，所以选择tween80浓度为1％。3.随着水相油相体积比的减小，微胶囊平均粒径逐渐减小，但粒径分散度逐渐增大，此外四种条件下包埋率并没有发生较大的改变，因此综合考虑选择5:25作为水相油相体积比。4.海藻酸钠的浓度会对微胶囊的粒径和包埋率产生较大影响，超过2％以上时，海藻酸钠溶液过于黏稠，粒径增大，包埋率也随之降低。因此选择1.5％海藻酸钠作为后续实验条件。5.随着碳酸钙和海藻酸钠质量比增加钙离子的释放增多，使凝胶微球的结构更加致密，粒径逐渐减小，但是钙离子过多又会使包埋率下降，综合考虑，选择caco3与海藻酸钠质量比为1:6作为后续实验条件。6.当冰醋酸从1.4：1增加到2.8：1时，包埋率大大增加，这是因为当增加到2.8:1时，钙离子的释放量才足以释放全部的钙离子从而发生交联，使包埋率增加，但如果再增加冰醋酸的量，则会使体系的ph值降低，从而降低包埋率。因此选择caco3与ch3cooh质量比为1：2.8作为后续实验条件。7.随着搅拌速度的升高，微胶囊的粒径和粒径分散度减小，但过高速度的搅拌会影响益生菌的存活，因此综合考虑选择搅拌速度为600r/min。8.搅拌时间过短过长都会影响微囊最终的粒径和包埋率，合适的搅拌时间可以得到最小的粒径和最大的包埋率，综合结果选择加入冰醋酸前后搅拌时间均为15分钟左右较合适。9.菌泥与海藻酸钠的质量比为20:3能够达到最好的包埋效果。最终确定微胶囊的制备工艺为：将1.5％的海藻酸钠溶液与富硒双歧杆菌菌泥、碳酸钙粉末混合均匀，其中海藻酸钠，富硒双歧杆菌，碳酸钙三者的质量比为6：40：1，然后将上述混合液逐滴滴加到含有1.0％tween80的大豆油中，大豆油与海藻酸钠的质量比为5：1，600r/min搅拌15min，再向不断搅拌的乳状液中加入含有冰乙酸的大豆油，此处大豆油体积为上一步加入大豆油体积的的20％，冰乙酸与碳酸钙的摩尔比为2.8：1，搅拌15min后，向其中加入2倍大豆油体积的1.0％tween80溶液，100r/min搅拌2min后静置，待微囊沉到水相底部，吸去油相，将水相离心(3800r/min，离心2min)，得到微胶囊，然后使用洗涤介质(1％tween80溶液)洗涤微囊2次，除去残余的油相，最后用无菌生理盐水洗涤2次，得到未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊。实施例3微囊包衣将制备好的未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊重悬于一定体积的纯化水中，然后重悬于0.2％包衣材料溶液中搅拌，待包衣完成后，离心收集微胶囊，并用无菌生理盐水洗涤两次，得到包衣后的富硒双歧杆菌微胶囊。参照表2考察包衣过程中不同条件对包埋率和粒径的影响。表2为微胶囊包衣过程中不同条件对包埋率和粒径的影响结论：1.使用壳聚糖包衣后虽然增大了微胶囊的粒径，但是包埋率显著高于乳清蛋白和多聚赖氨酸，选择壳聚糖作为包衣材料。2.搅拌速度的增加，使包衣后微囊发生相互凝聚，因此会大大的增加微囊的粒径和分散度，选择100r/min作为最优包衣时间。3.搅拌速度的增加，使包衣后微囊发生相互凝聚，因此会大大的增加微囊的粒径和分散度。随着包衣时间从5分钟到10分钟的延长，微囊的包埋率轻微升高，在后续增加到20min的过程中包埋率没有明显变化，但粒径在不断地升高，因此选择10min作为最优包衣时间。最终确定的微胶囊的包衣工艺为：将制备好的未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊重悬于一定体积的纯化水中，然后重悬于0.2％壳聚糖溶液中，在100r/min下搅拌10min，待包衣完成后，(6000r/min，离心5min)离心收集微胶囊，并用无菌生理盐水洗涤两次，得到包衣后的富硒双歧杆菌微胶囊。实施例4微囊冻干将微胶囊与保护剂水溶液按质量比1：1混合后置于真空冷冻干燥机中(lgj-22d型冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司)，冻干工艺为：第一阶段：-40℃，4h(预动结束后抽真空)；第二阶段：5℃，10h；第三阶段：15℃，10h，真空度为10pa，厚度约为0.5cm。冻干结束后，取出西林瓶，对西林瓶内菌粉通过平板计数法进行准确计数，计算冻干存活率。冻干保护剂的筛选如下：(1)脱脂奶粉添加量筛选取5个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～5的保护剂水溶液分别是0、5、10、15、20％的脱脂奶粉，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。脱脂奶粉筛选结果如表3所示：表3：由上述结果知，当脱脂奶粉超过10％以上时，冻干存活率不再增加，10％脱脂奶粉冻干存活率为35.7％，相比不加保护剂直接冻干的菌泥冻干存活率提高了10.7倍。(2)糖类保护剂的筛选取8个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～8的保护剂水溶液是10％的脱脂奶粉再分别加入10％葡萄糖、水苏糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、乳果糖、纯化水，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。糖类保护剂筛选结果如表4所示：表4：编号种类冻干存活率(％)1葡萄糖37.22水苏糖41.33蔗糖42.54海藻糖48.15乳糖40.76甘露醇38.27乳果糖39.58空白对照35.7由上述结果知，海藻糖对富硒双歧杆菌的冻干保护效果最好，相比单纯的10％脱脂奶粉，冻干存活率提高了12.4％。因此对海藻糖的添加比例进行了筛选，分别是10％、15％、20％、25％，具体步骤同上，筛选结果如表5所示：表5：编号海藻糖比例冻干存活率(％)110％48.1215％56.3320％67.5425％70.2由上述结果知，海藻糖的添加量为25％时，保护效果最好，但是25％的海藻糖相对难分散，浓度过高，流动性差，考虑进冻干箱的可操作性，选择20％作为海藻糖的最优添加比例。(3)抗氧化剂的筛选取4个灭菌过的西林瓶，向各瓶中加入保护剂水溶液和菌泥，按质量比1：1均匀混合，编号1～4的保护剂水溶液是10％的脱脂奶粉、20％的海藻糖再分别加入1％的vc-na、谷氨酸钠、l-半胱氨酸盐酸盐和纯化水，将西林瓶置于冷冻干燥箱中冻干。抗氧化剂筛选结果如表6所示：表6：编号种类冻干存活率(％)1vc-na82.42谷氨酸钠72.33l-半胱氨酸盐酸盐47.54空白对照67.5由上述结果知，额外添加vc-na可以增加富硒双歧杆菌的冻干存活率，因此对vc-na的添加比例进行了筛选，结果如表7所示：表7：编号vc-na比例冻干存活率(％)11％82.422％85.533％85.244％85.5由结果知，vc-na的添加比例在2～4％之间时对富硒双歧杆菌的保护效果几乎不存在差异，因此考虑成本选择2％的vc-na作为最优的添加量。总结：通过对冻干保护剂的筛选，得出最优冻干保护剂水溶液配方为：10％脱脂奶粉、20％海藻糖、2％维生素c钠，68％纯化水。保护剂水溶液与菌泥的重量添加比为1：1.冻干工艺为：第一阶段：-40℃，4h(预动结束后抽真空)，第二阶段：5℃，10h；第三阶段：15℃，10h，真空度为10pa，厚度约为0.5cm。冻干存活率在85％以上，活菌数在5×1010cfu/g以上。实施例5.微胶囊包埋率和冻干存活率测定本发明制备的微胶囊的解囊液是0.2mol/l碳酸氢钠和0.06mol/l柠檬酸三钠的混合溶液。微胶囊中活菌数的测定是通过将1g微胶囊置于9g解囊液中，涡旋震荡1min左右，待微囊完全溶解至肉眼不可见时，吸取液体进行梯度稀释，稀释液为无菌的生理盐水(9g/l)，待稀释至合适梯度时吸出100μl均匀的涂布于已灭菌冷却的rcm固体培养基上，每个稀释度涂布三块平板，选取菌落数在30～300左右的稀释度，进行活菌计数(活菌数单位cfu/g)。包埋产率(ey)＝包埋于微囊中的活菌总数/制备微囊时加入的活菌总数×100％。冻干存活率＝冻干后总活菌数/冻干后活菌数×100％。结果表明，本发明所述方法制得的益生菌包埋率达到98.2％，冻干存活率达85.5％。实施例6.微胶囊粒径测定用吸管吸取少量分散均匀的微胶囊溶液，逐滴加入样品池中，以水为分散剂，采用激光粒度分析仪(la-920激光粒度仪，horiba)进行粒径测量，结果表明本发明制备的富硒双歧杆菌微胶囊粒径为198.8±3.5μm，粒径分散度为1.44±0.08。实施例7.微胶囊形态测定在扫描电子显微镜的样品台上贴上一层双面胶，将经冷冻干燥后的微胶囊粉末样品轻轻撒于上方，用洗耳球吹去多余粉末后，在样品上喷洒金粉，后置于低真空高分辨扫描电子显微镜上观察。结果表明本发明制备的富硒双歧杆菌微胶囊表面光滑，结构致密，粒径分散均匀，如图2所示。实施例8.耐胃酸性检测人工胃液的配制：用浓盐酸将0.5％nacl溶液的ph值调至2.5±0.02，然后加入一定量的胃蛋白酶并使其终浓度为3g/l，最后用0.22μm的膜进行过滤除菌。称取1.0g微胶囊置于9ml人工胃液中，37℃，100r/min的摇床中震荡温育，分别于0、5、30、60、120min时取样，然后将0.1g样品加入到相应的解囊液中，进行活菌计数。结果如图3所示，结果表明，本发明制备的微胶囊可以提高富硒双歧杆菌的耐胃酸性质。实施例9.耐胆盐性检测人工肠液的配制：取磷酸氢二钾6.8g，加水250ml使溶解，加0.2mol/lnaoh溶液77ml和500ml水，再加胰酶10g和牛胆盐10g使溶解后，用0.2mol/lnaoh溶液或0.2mol/l盐酸溶液调节ph值至6.8±0.02，再加水稀释至1000ml，即得。称取1.0g微胶囊置于9ml人工肠液中，37℃，100r/min的摇床中震荡温育，分别于0、5、30、60、120min时取样，进行活菌计数。结果如图3所示，结果表明，本发明制备的微胶囊可以提高富硒双歧杆菌的耐胆盐性质。实施例10.耐贮藏性测试将制备得到的微胶囊及未微囊化的长双歧杆菌菌粉分别置于4℃下、25℃下储藏六个月，期间在0、15、30、60、90、180d时取样，测定样品中活菌数变化。结果如图4所示，本发明制备的微胶囊可以提高富硒双歧杆菌的耐常温贮藏性质，在180d内，富硒双歧杆菌微胶囊的活菌数仍在108cfu/g左右。对比例1外源乳化法制备微胶囊菌体收集方式如实施例1，微囊制备方法如下：首先将1.5％的海藻酸钠溶液与富硒双歧杆菌菌泥混合均匀，其中海藻酸钠，富硒双歧杆菌的质量比为6：40，然后将上述混合液逐滴滴加到含有1.0％tween80的大豆油中，大豆油与海藻酸钠的质量比为5：1，600r/min搅拌15min，然后将上述混合液中加入到2倍大豆油体积的0.1m的氯化钙溶液中，600r/min搅拌15min左右后静置，待微囊沉到水相底部，吸去油相，将水相离心(3800r/min，离心2min)，得到微胶囊，然后使用洗涤介质(1％tween80溶液)洗涤微囊2次，除去残余的油相，最后用无菌生理盐水洗涤2次，得到未包衣的富硒双歧杆菌微胶囊。通过肉眼观察，粒径测定，包埋率测定后发现，使用此方法制备得到的微胶囊表现出大幅度的聚集现象，多成簇存在，水中分散性差。粒径显示为358.8±5.1μm，粒径分散度为2.25±0.70。微囊包埋率仅为1.7％。与内源乳化法制备的微囊相比，此法制备的微囊包埋率低，分散性差，多聚堆存在。序列表<110>江苏德禧生物科技有限公司上海医药工业研究院<120>一种富硒双歧杆菌微胶囊<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1227<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cggagtctacttagacggctcatcccacaaggggttaggccaccggcttcgggtgctgcc60cactttcatgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgcattcaccgcgacgtt120gctgattcgcgattactagcgactccgccttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccg180aactgagaccggttttcagggatccgctccgcgtcgccgcgtcgcatcccgttgtaccgg240ccattgtagcatgcgtgaagccctggacgtaaggggcatgatgatctgacgtcatcccca300ccttcctccgagttaaccccggcggtcccccgtgagttcccggcataatccgctggcaac360acggggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgac420gacgaccatgcaccacctgtgaacccgccccgaagggaagccgtatctctacgaccgtcg480ggaacatgtcaagcccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccg540ccgcttgtgcgggcccccgtcaatttctttgagttttagccttgcggccgtactccccag600gcgggatgcttaacgcgttagctccgacacggaacccgtggaacgggccccacatccagc660atccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttc720gctcctcagcgtcagtaacggcccagagacctgccttcgccattggtgttcttcccgata780tctacacattccaccgttacaccgggaattccagtctcccctaccgcactcaagcccgcc840cgtacccggcgcggatccaccgttaagcgatggactttcacaccggacgcgacgaaaccg900cctacgagccctttacgcccaataattcccggataacgcttgcaccctacgtattaccgc960ggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcaacgggtaaactcactctcgcttgctc1020ccgataaaagaggttacaacccgaaggcctccatccctcacgcggcgtcgctgcatcagg1080cttgcgcccattgtgcaatattcccccactgctgcctcccgtagagtctggacgtattcc1140tcagtccatgtgacatcgcccctcttcagtcggctacgttcgaagcctacgggtgggccg1200tagccggcgttcaagcctggtatatag1227当前第1页12