一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及功能性食品生产工艺技术领域，尤其涉及一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

姜黄素(curcumin，cur)是从姜科植物姜黄根茎中提出的多酚类化合物,具有β-二酮的庚二烯与两个邻甲基化的酚相连组成的对称分子结构，粉末呈橙黄色结晶状，味稍苦。着色力强，毒性小，长期以来作为一种常用的天然色素被广泛应用于食品、纺织、化妆品等领域。近年来许多学者研究表明姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、抗病毒、抗病毒、心血管保护、修复脑部损伤、缓解帕金森症状等多种药理和保健作用。但由于姜黄素难溶于水，溶于乙醇、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂，易受光、温度、金属离子、ph值等外界因素影响,容易失去其显色能力，尤其是光敏性高。王雪梅等人研究了姜黄素类化合物的光稳定性，并采用高效液相色谱法对光照前后的姜黄素类化合物溶液进行分析，发现室外光照下，姜黄素的溶液极不稳定，而姜黄素固体粉末则较为稳定。

近年来关于姜黄素纳米化研究已有较多报道，刘延敏等人通过熔融速冷及室温冷却的方法,制备了姜黄素的固体分散体，发现姜黄素固体分散体的体外溶出度远远高于纯姜黄素。葛云龙等人通过反溶剂法制备的姜黄素纳米粒冻干粉可以改善姜黄素水溶性,有利于提高姜黄素的生物利用度。此外还有脂质体、胶束、微乳等姜黄素纳米颗粒制备方法。

姜黄素具有多种药理和保健作用，人们希望将其作为功能性色素应用在于功能性食品开发上，但由于姜黄素难溶于水，且易受光、温度、金属离子、ph值等外界因素影响,容易失去其显色能力。特别是在室外光照下，姜黄素水溶液及其不稳定，发生降解反应，失去原来的药理作用和颜色，这就限制了姜黄素的使用领域，尤其是在液体食品中产业化开发与应用。目前针对提高姜黄素溶解性和生物利用度有较多的研究报告，例如，将其制成纳米脂质体后，可显著改善其水溶性，提高生物利用度；通过添加稳定剂、微胶囊化、色素分子结构修饰、改善天然色素加工储存条件等改善其天然色素的稳定性，而改善其光敏性的研究却鲜见报道。随着社会经济的高速发展，科技的快速进步，当人们的温饱问题得到解决后，人们对于饮料的需求不再仅仅只是为了追求口感和视觉，现在人们更注重的是饮料本身的营养与健康，已经从以前最原始的止渴功能，到现在的追求营养、健康和保健。近年来市场上出现很多具有营养、健康等特点且具有抗衰老、美容等多种功效性功能性饮料，逐渐受到消费者的喜爱。根据大量的数据显示，近几年国内饮料企业的保健型功能性饮料总产量和销售额逐年递增，从长远的发展趋势来看，保健型功能性饮料在未来我国的发展趋势良好。如果能解决姜黄素的光敏性问题并将其应用在饮料中，将会丰富营养保健饮料市场，并具有很高的经济价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种姜黄素纳米颗粒及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种姜黄素纳米颗粒，以姜黄素为芯材，阿拉伯胶和玉米醇溶蛋白为壁材；所述芯材与壁材的质量比为5.5-7.5：100；所述阿拉伯胶和玉米醇溶蛋白的质量比为1-5:5。

所述姜黄素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)醇相的制备：将玉米醇溶蛋白溶解于85％乙醇中，磁力搅拌1h，离心去除不溶物作为玉米醇溶蛋白液，加入姜黄素于玉米醇溶蛋白液中搅拌30min，得到醇相；

2)水相的制备：将阿拉伯胶溶解于0.3g/l硫酸锌溶液(水浴加热60℃溶解)，搅拌至完全溶解，得到水相，且所述水相与步骤1)所述醇相的体积比为1.5-3.5:1；

3)反溶剂共沉淀：将步骤1)得到的醇相细流状的加入步骤2)得到的水相中并进行搅拌30min，得到姜黄素纳米颗粒分散液；

4)旋转蒸发：将步骤3)得到的姜黄素纳米颗粒分散液通过旋转蒸发去除乙醇和水，得到姜黄素纳米颗粒浓缩液；

5)干燥：将步骤4)得到的姜黄素纳米颗粒浓缩液进行冷冻干燥后得到姜黄素纳米颗粒；

所述姜黄素、阿拉伯胶和玉米醇溶蛋白的添加量按照所述的质量比进行添加。

进一步地，步骤2)所述水相与步骤1)所述醇相的体积比为2:1；所述阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白的质量比为4:5；所述芯材与壁材的质量比为7.5：100。

本发明的第二个目的是提供一种延缓衰老的姜黄素饮料及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种延缓衰老的姜黄素饮料，以质量百分比计，所述饮料包含：皇帝柑浓缩液15％、黄原胶0.05％-0.25％、姜黄素纳米颗粒0.2％-1％、辛烯基琥珀酸淀粉钠0.2％-1％、羧甲基纤维素钠0.05％-0.25％、柠檬酸0.1％和木糖醇10％，其余为水；所述姜黄素纳米颗粒由上述制备方法得到。

进一步地，以质量百分比计，所述饮料包含：皇帝柑浓缩液15％、黄原胶0.15％、姜黄素纳米颗粒0.8％、辛烯基琥珀酸淀粉钠0.4％、羧甲基纤维素钠0.15％、柠檬酸0.1％和木糖醇10％，其余为水。

所述延缓衰老的姜黄素饮料的制备方法，包括以下步骤：

1)皇帝柑浓缩液的制备：将皇帝柑去皮去核后用榨汁机榨汁并用双层纱布过滤两次，然后将汁液浓缩到原体积的1/2，得到皇帝柑浓缩液；

2)混合：在高速搅拌下加入所述质量百分比的姜黄素纳米颗粒和辛烯基琥珀酸淀粉钠，与皇帝柑浓缩液混合；

3)均质：将步骤2)配制好的混合液倒入高压均质机中进行均质；

4)调配：在步骤3)的产物中，加入所述质量百分比的羧甲基纤维素钠、黄原胶、柠檬酸和的木糖醇；

5)二次均质：将步骤4)配制好的混合液倒入高压均质机中进行均质；

6)脱气:利用水浴加热将步骤5)的产物进行脱气处理；

7)灌装、杀菌：将步骤6)的产物进行趁热灌装、杀菌，得到所述延缓衰老的姜黄素饮料。

进一步地，步骤3)所述均质的压力为25mpa。

进一步地，步骤5)所述二次均质的压力为5mpa。

进一步地，步骤7)所述杀菌条件为，在121℃中杀菌10min。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明所述的姜黄素纳米颗粒的制备方法改善了其在溶液中光不稳定性的问题，使其可作为功能性色素加入功能性饮料中制备成延缓衰老功能饮料。

2、本发明所述的姜黄素饮料酸甜适口，并带有姜黄素气味，能提高sod酶活性，降低丙二醛mda含量，具有抗氧化和延缓衰老作用。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是姜黄素吸收曲线。

图2是姜黄素标准曲线。

图3是锌离子最适浓度筛选。

图4是水相与醇相体积比。

图5是阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比。

图6是姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比。

图7是姜黄素纳米颗粒与纯姜黄素自然光下的姜黄素保留率。

图8是实验1条件处理下100倍显微镜拍照图片。

图9是实验2条件处理下100倍显微镜拍照图片。

图10是实验3条件处理下100倍显微镜拍照图片。

图11是cmc-na添加量对自由基清除率的影响。

图12是cmc-na添加量对姜黄素饮料的影响。

图13是黄原胶添加量对自由基清除率的影响。

图14是黄原胶添加量对姜黄素饮料的影响。

图15是辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量对自由基清除率的影响。

图16是辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量对姜黄素饮料的影响。

图17是姜黄素冻干粉添加量对自由基清除率的影响。

图18是姜黄素冻干粉添加量对姜黄素饮料品质的影响。

具体实施方式

本发明采用的材料和试剂如表1所示。

表1试验所用材料和试剂

本发明所采用的设备如表2所示：

表2试验所用设备一览表

本发明采用的数据处理软件分别为graphpadprism7.04、origin9、ezomnic、正交设计助手。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1

姜黄素纳米颗粒的制备试验方法

1.姜黄素原料分析

1.1姜黄素最大吸收波长及回归方程

最大吸收波长：准确称取0.01g姜黄素粉末样品于100ml容量瓶中，用95％的乙醇定容，得到浓度为0.1mg/ml的姜黄素溶液，从中移取500ul用95％乙醇溶液定容到100ml，得到浓度为0.5ug/ml的姜黄素溶液，调节波长测定在不同的波长下姜黄素的吸光值，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，确定最大吸收波长。

回归方程：准确称取姜黄素标准品25mg于50ml容量瓶中，用95％的无水乙醇定容，分别稀释到0、15、30、45、60、75ug/ml的标准溶液，425nm处测定吸光度，以浓度x对吸光度y进行线性回归。

由图1、图2可知：姜黄素的最大吸收波长为425nm，标准曲线的回归方程为y＝0.3168x+0.6349，r²＝0.9974，姜黄素浓度在0～75μg/ml范围内，线性关系良好。

1.2姜黄素矿物元素含量分析

微波消解法：参照《gb5009.268-2016食品中多元素的测定》；称量姜黄素固体0.3g(实际称量0.2824g)于微波消解内罐中，加入8ml硝酸，加盖放置1h或过夜，旋紧罐盖，按照微波消解仪的标准操作步骤进行消解。消解完毕后，待冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，用少量水冲洗内盖，将消解罐放在控温电热板上进行排酸，直至近干，之后再用超纯水定容在25ml容量瓶中，混匀备用，同时做相同数量的空白试验。

由表3可知，姜黄素的化学组成中含有较少的锌元素，这对姜黄素的稳定性有一定的影响。

表3姜黄素矿物元素含量

2.稳定剂锌离子最适浓度筛选

2.1样液的配制

姜黄素母液的配制：称取0.175g姜黄素溶解于280毫升的无水乙醇中，搅拌至姜黄素粉末完全溶解。

不同锌离子浓度储备液的配制：分别称取硫酸锌0.03g、0.06g、0.09g、0.12g、0.15g、0.18g溶解与100ml蒸馏水中，搅拌均匀，配置成0.3g/l、0.6g/l、0.9g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l硫酸锌储备溶液，保存好备用。

2.2锌离子最适浓度筛选试验

将姜黄素母液分装成40ml的7份样液，在1—7号样液中分别加入10ml,0.0g/l、0.3g/l、0.6g/l、0.9g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l硫酸锌储备液，搅拌均匀得到硫酸锌浓度分别为0.0g/l、0.06g/l、0.12g/l、0.18g/l、0.24g/l、0.3g/l、0.36g/l的样液，室温放置。每隔12小时在425nm波长处用酶标仪测定吸光度，平行三次取平均值。

2.3结果分析

由图3可知，不同浓度的锌离子加入姜黄素溶液中在0到48小时内，姜黄素都在褪色，但比不加锌离子的稳定。48到60小时，加入不同浓度的锌离子姜黄素溶液的吸光度都增加，60小时后0.3g/l的锌离子浓度斜率最小且吸光度较为稳定，0.36g/l锌离子浓度虽然吸光度较为稳定，但是总体仍然呈现下降趋势。因此0.3g/l锌离子浓度提高姜黄素光稳定性效果最好。

3.姜黄素纳米颗粒制备工艺流程：

1)醇相的制备：将玉米醇溶蛋白溶解于85％乙醇中，磁力搅拌1h，离心去除不溶物作为玉米醇溶蛋白液，加入姜黄素于玉米醇溶蛋白液中搅拌30min，得到醇相；

2)水相的制备：将阿拉伯胶溶解于0.3g/l硫酸锌溶液(水浴加热60℃溶解)，搅拌至完全溶解，得到水相，且所述水相与步骤1)所述醇相的体积比为1.5-3.5:1；

3)反溶剂共沉淀：将步骤1)得到的醇相细流状的加入步骤2)得到的水相中并进行搅拌30min，得到姜黄素纳米颗粒分散液；

4)旋转蒸发：将步骤3)得到的姜黄素纳米颗粒分散液通过旋转蒸发去除乙醇和水，得到姜黄素纳米颗粒浓缩液；

5)干燥：将步骤4)得到的姜黄素纳米颗粒浓缩液进行冷冻干燥后得到姜黄素纳米颗粒。

3.1姜黄素纳米颗粒制备单因素实验

以包埋率为考察指标，分析水相与醇相体积比、阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比、姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比对姜黄素纳米颗粒制备的影响，从而确定三个因素的最适添加量。

3.1.1水相与醇相体积比

玉米醇溶蛋白1g，姜黄素0.02g，阿拉伯胶1g，85％乙醇50ml，硫酸锌0.3g/l(以总体积算)，蒸馏水与乙醇体积比为1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1，按上述工艺操作制备姜黄素纳米颗粒，根据包埋率确定水相与醇相体积的最适比例。

由图4可知，水相与醇相的体积比从1.5:1到2.5：1时，包埋率从85.4％上升到93.2％，当体积比从2.5:1增加到3.5:1时，包埋率从93.2％下降到84.6％。可能是随着水相与醇相的体积比增加，醇相的浓度下降，姜黄素溶解达到过饱和状态，在沉积过程中，姜黄素析出导致游离的增多，包埋率下降。确定最适水相与醇相体积比为2.5:1。

3.1.2阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比

玉米醇溶蛋白1g，姜黄素0.02g，蒸馏水75ml，85％乙醇50ml，硫酸锌0.3g/l(以总体积算)，阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比为2:10、4:10、6:10、8:10、10:10，按上述工艺操作制备姜黄素纳米颗粒，根据包埋率确定阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量的最适比例。

由图5可知，随着阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比增加，包埋率先增加后下降，当质量比为6:10时，包埋率最大，为87.1％，可能此时阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白所带的电荷完全中和，包埋率最大，之后比例的增加导致电荷失衡，包埋率下降。确定最适阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比为6:10。

3.1.3姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶总质量比

玉米醇溶蛋白1g，阿拉伯胶1g，85％乙醇50ml，硫酸锌0.3g/l(以总体积算)，蒸馏水75ml，姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶总质量比5.5:100、6:100、6.5:100、7:100、7.5:100，按上述工艺操作制备姜黄素纳米颗粒，根据包埋率确定姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶总质量的最适比例。

由图6可知，当姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比从5.5:100到6.5:100时，包埋率从97.1％上升到97.6％，当比值从6.5：100到7.5：100时，包埋率下降。可能是当姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比6.5:100时，壁材的荷载量达到最大负荷，之后比例增加导致游离的姜黄素的量增加，包埋率下降。确定最适姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比为6.5:100。

3.2姜黄素纳米颗粒制备正交实验

3.2.1正交实验方法

在单因素试验考察基础上，采用l9(3⁴)正交表对水相与醇相体积比、壁材组分质量比(阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比)、芯壁质量比(姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶总质量质量比)三个因素进行优化，如下表所示；以包埋率、光稳定性分、粒径分为考察指标，进行多指标综合平衡法选择。光稳定性分＝(1-(a7-a1)/a7)，粒径分＝(1-粒径)，其值越大越好。

表4姜黄素纳米颗粒制备l9(3⁴)正交试验因素水平设计表

3.2.1.1姜黄素纳米颗粒包埋率的测定

移取1ml负载姜黄素的纳米颗粒、4ml95％乙醇置于烧杯中，超声15min萃取得游离的姜黄素，用0.22μm有机膜过滤，重复萃取3次。合并萃取液，以95％乙醇作为空白对照，在425nm下测定样品的吸光度，根据姜黄素在95％乙醇中的标准曲线方程，计算出游离姜黄素后，按照下式计算包埋率和载药量：

3.2.1.2姜黄素纳米颗粒粒径测定

将样品稀释一定的倍数，置于样品池中，使用激光粒度仪测量其粒径。

3.2.1.3姜黄素纳米颗粒光稳定的观察

将样品稀释4倍，室温放置，每24小时使用酶标仪测量一次吸光度值，观察微胶囊技术对姜黄素光敏性的影响。以反应时间t为横坐标，以保留率ln(at*/a0*)为纵坐标，分别绘制(玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶-姜黄素)纳米体系和未包埋的姜黄素的保留率图，观察姜黄素纳米颗粒对姜黄素光敏性的影响。

样品分组情况：样品1是工艺条件为水醇体积比(水相与醇相体积比)2:1，壁材质量比(阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比)4:10，芯壁质量比(姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶总质量质量比)6:100；样品2是工艺条件为水醇体积比2:1，壁材质量比6:10，芯壁质量比6.5:100；样品3是工艺条件为水醇体积比2:1，壁材质量比8:10，芯壁质量比7:100；样品4是工艺条件为水醇体积比2.5:1，壁材质量比4:10，芯壁质量比7:100；样品5是工艺条件为水醇体积比2.5:1，壁材质量比6:10，芯壁质量比6:100；样品6是工艺条件为水醇体积比2.5:1，壁材质量比8:10，芯壁质量比6.5:100；样品7是工艺条件为水醇体积比3:1，壁材质量比4:10，芯壁质量比6.5:100；样品8是工艺条件为水醇体积比3:1，壁材质量比6:10，芯壁质量比7:100；样品9是工艺条件为水醇体积比3:1，壁材质量比8:10，芯壁质量比6:100；空白是纯姜黄素0.02g。

由图7可知，样品1到样品9，总的来看，当过了48h后，所有样品的保留率趋于稳定，姜黄素纳米颗粒的姜黄素保留率都比未包埋的要大，因此姜黄素纳米颗粒包埋的姜黄素光解反应比未包埋的要慢。水醇体积比(水相与醇相体积比)为3:1，壁材质量比(阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比)为4:10，芯壁质量比(姜黄素与阿拉伯胶-玉米醇溶蛋白总质量比)为6.5:100制得的样品7在144h后姜黄素保留率最大，姜黄素光解反应最慢。

由上可知，姜黄素纳米颗粒的光解反应比未包埋的姜黄素的光解反应要慢，姜黄素包埋后其对光的稳定性提高了。

3.2.2正交实验结果如下：

表5姜黄素纳米颗粒制备工艺l9(3⁴)正交试验结果表

3.2.3考察指标方差分析结果如下：

表6以包埋率为考察指标的方差分析结果表

表7以粒径为考察指标的方差分析结果表

表8以吸光度降解率为考察指标的方差分析结果表

注：*表示显著性p<0.05

表9不同指标最优组合比较表

由表5、表6、表7、表8、表9可得，因素a对包埋率有高度显著影响，根据r值，以包埋率为指标时优选a1；因素b对包埋率有高度显著影响，根据r值故选择b3，因素c对三个指标都无显著影响，但因为制备的是纳米颗粒，粒径需要较小，根据r值选择c3。通过综合平衡法分析得出姜黄素纳米颗粒制备的最优水平为a1b3c3，即水相与醇相体积比2:1，阿拉伯胶与玉米醇溶蛋白质量比为8:10，姜黄素与玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶质量比7.5:100，经验证试验得在最适作用条件时姜黄素纳米颗粒包埋率为96.730％，载药量为62mg/g，粒径为0.940um，吸光度下降斜率为0.73。

实施例2

延缓衰老的姜黄素饮料研制试验方法

1.姜黄素饮料的制备工艺流程：

1)皇帝柑浓缩液的制备：将皇帝柑去皮去核后用榨汁机榨汁并用双层纱布过滤两次，然后将汁液浓缩到原体积的1/2，得到皇帝柑浓缩液；

2)混合：在高速搅拌下加入所述质量百分比的姜黄素纳米颗粒和辛烯基琥珀酸淀粉钠，与皇帝柑浓缩液混合；所述姜黄素纳米颗粒由实施例1制得；

3)均质：将步骤2)配制好的混合液倒入高压均质机中进行均质；

4)调配：在步骤3)的产物中，加入所述质量百分比的羧甲基纤维素钠、黄原胶、柠檬酸和的木糖醇；

5)二次均质：将步骤4)配制好的混合液倒入高压均质机中进行均质；

6)脱气:利用水浴加热将步骤5)的产物进行脱气处理；

7)灌装、杀菌：将步骤6)的产物进行趁热灌装、杀菌，得到所述延缓衰老的姜黄素饮料。

1.1均质压力的确定

均质次数为两次，将饮料分别在均质压力25mpa一次均质，5mpa二次均质，和一次均质压力为5mpa和二次均质压力25mpa下进行均质，并以未均质的饮料作为对照，考察均质压力对粒径大小的影响，下表为均质压力结果。

表10均质压力结果

由粒径大小可知，实验3＞2＞1，结合显微拍照图片可知(附图8-10)，一次压力为25mpa，二次均质压力为5mpa时，大颗粒物质更充分被破碎成小分子物质，有利于饮料的储藏稳定性，一次压力为5mpa，二次压力为25mpa时，能使大物质破碎，但效果不如实验1的均质条件但是优于未均质的效果。故实验采用一次均质压力为25mpa，二次均质压力为5mpa。

1.2杀菌方式的确定

姜黄素饮料的ph为6，为低酸性食品，可采用高温高压杀菌，在121℃灭菌10分钟，也可加入柠檬酸，酸化饮料，将其ph调为4.6，采用巴氏杀菌，在80℃杀菌20min，及采用冷杀菌以用0.22μm有机膜过滤，以未杀菌饮料作为对照。以dpph清除自由基能力为指标，确定杀菌条件。

1.3分析样品的制备

饮料样液：以姜黄素纳米颗粒冻干粉、辛烯基琥珀酸淀粉钠为原料，黄原胶、cmc-na为稳定剂，按照上述工艺制成姜黄素饮料，此饮料中姜黄素含量为100mg/ml。然后用蒸馏水稀释至浓度为20、40、60、80、100μg/ml；

以抗坏血酸溶液为阳性对照，称取2、4、6、8、10mg抗坏血酸用蒸馏水溶解并定容至100ml，抗坏血酸溶液的浓度为20、40、60、80、100μg/ml。

表11杀菌条件

由11表可知，样品ic50值大小为2＞3＞1＞4，vc阳性对照ic50值大小为2＞1＞3＞4，ic50值越低，dpph·自由基清除率越高，样品的抗氧化性越好，所以样品1的抗氧化性最高。杀菌后，三中杀菌方式的ic50值均上升，而样品2由于酸化了，ph为4.6，酸根离子对超氧阴离子有抑制作用，故其ic50值最高，dpph·自由基清除率最低，抗氧化性最低。按照gb7101-2015食品安全国家标准(饮料)，样品1、2、3杀菌后菌落总数均符合国家标准，未杀菌样品菌落总数则不符合国家安全标准。综合上述结果，故本实验采用121℃/10min为杀菌条件。

2.姜黄素饮料品质的评价方法

2.1感官评分标准

本实验感官评价由8名成员组成，对姜黄素饮料各项指标进行感官品尝打分。

表12感官评分标准

2.2吸光稳定性

称取一定量样品,加水稀释20倍，将稀释液混匀后，放入离心机以4000r/min离心15min.在样品最大吸收波长下测定其离心前后的吸光值ao和a，待测样品的吸光稳定性用a/ao来表示。

2.3离心沉淀率

分别称取样品和离心管总重、离心管重,以4000r/min离心15min,弃去上清液,准确称量离心管和剩下沉淀的总量。

计算公式为：沉淀率＝沉淀质量/样液质量×100％

2.4dpph·自由基清除能力的测定

(1)样品制备，同1.3。

(2)dpph·自由基清除能力的测定

在96孔板中分别加入0.2mmol/l的dpph乙醇溶液100μl。再分别加入100μl不同浓度梯度的姜黄素饮料样液，混合均匀，在漆黑处室温下反应30min，于517nm波长处测定吸光值a1，对照组以等体积无水乙醇代替dpph乙醇溶液(a2)，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液(a0)，以抗坏血酸为阳性对照。

计算公式为：清除率％＝〔1-(a1-a2)/a0〕×100

式中：

a0：100μl蒸馏水与100μlldpph乙醇混合溶液的吸光度；

a1：100μl样品液与100μldpph乙醇混合液的吸光度；

a2：100μl样品液与100μl无水乙醇混合液的吸光度。

2.5abts⁺·自由基清除能力的测定

(1)样品制备，同1.3。

(2)abts⁺·自由基清除能力的测定

量取5ml2.6mmol/l的k2s2o8溶液和10ml7.4mmol/l的abts+·溶液，并对其混合均匀，置于室温避光条件下存放反应12h，稀释40～50倍，用磷酸盐缓冲液(ph6.6)将abts+·溶液稀释至吸光度为0.70±0.02得到工作液。取40μl姜黄素延缓衰老饮料样液于96孔板中，加入abts⁺·工作液160μl，混合摇匀并避光静置6min后，于波长734nm处测定吸光度。按下式计算各待测样品对abts⁺·自由基的清除率。以蒸馏水作为空白对照，测吸光度a0。以抗坏血酸为阳性对照。

计算公式为：清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100％

式中：

a0为40μl蒸馏水与160μlabts+·溶液反应后的吸光度值；

a1为40μl样品液与160μlabts+·溶液反应后的吸光度值；

a2为40μl样品液与160μl无水乙醇混合后的吸光度值。

2.6综合评分法

采用综合评分法，确定姜黄素延缓衰老饮料的配方。本实验中确定感官评价，吸光稳定性，离心沉淀率、清除dpph·自由基能力，abts⁺·自由基清除能力，这五个为评价指标。总分＝感官评价分值x感官评价权重+吸光稳定性分值x吸光稳定性权重+离心沉淀率分值x离心沉淀率权重+dpph·自由基清除率分值xdpph·自由基清除率权重+abts⁺·+自由基清除率分值xabts⁺·+自由基清除率权重。下列为等级分配、排名分值和权重分配见表1、2、3。

表13等级分配表

表14排名分值表

表15权重分配表

2.7姜黄素含量检测

2.7.1标准溶液配置

准确称取5mg姜黄素标准品，用甲醇定容至100ml,分别配制成0.05mg/ml的标准液。精确量取标准溶液0.2、0.4、0.8、1、2ml于10ml容量瓶中，然后用甲醇定容，用微孔滤膜过滤，收集滤液在5℃冰箱避光储存。

2.7.2样品制备

于50ml离心管中放入5ml样品，加入90％乙醇25ml，用超声波提取15min，然后用4000r/min离心15min，取上清液于50ml容量瓶中，用90％乙醇定容，用0.45μm的滤膜过滤待测样品，待分析。

2.7.3色谱条件

色谱柱：hypersilodsc18(150nm×4.6nm，5μm)；流动相：a：甲醇，b：5％冰醋酸缓冲液(a:b＝65：35v/v)；流速：1ml/min；检测波长：420nm；柱温为30℃，进样量20μl。

2.7.4hplc分析

按2.7.3中的色谱条件，进行hplc分析，以姜黄素质量浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标创建线性方程，绘制标准曲线图，并将样品峰面积带入标准曲线，得出姜黄素含量。

3.姜黄素饮料配方单因素试验

3.1cmc-na添加量对姜黄素饮料品质的影响

依次添加0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％的cmc-na，姜黄素纳米颗粒添加量为0.4％，辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％，黄原胶添加量为0.1％，木糖醇添加量为10％，柠檬酸添加量为0.1％，按照上述制备工艺进行，以感官评价、吸光稳定性、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts⁺·自由基清除能力为考察指标，确定最优cmc-na添加量，结果如下表所示。

表16cmc-na添加量对姜黄素饮料品质的影响

由表16可知，随着cmc-na添加量的增加，感觉评分呈现先增加后下降的趋势，在cmc-na添加量为0.1％时，感官评分最高。这是因为cmc-na添加量为0.1％，饮料无分层，无沉淀，口感最好。随着其量增加，口感逐渐变差。且在cmc-na添加量为0.1％时，溶液体系处于稳定状态，吸光稳定系数最高和离心沉降率最低，随着cmc-na添加量继续增加，溶液稳定状态被破坏，吸光稳定系数减少和离心沉降率增加。由图11可知，cmc-na添加量对dpph·自由基清除率％和abts⁺·自由基清除率％影响不大。综合表16和图11、图12，当cmc-na添加量为0.1％综合评分最高，由此确定cmc-na最适添加量为0.1％。

3.2黄原胶添加量对姜黄素饮料品质的影响

依次添加0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％的黄原胶，姜黄素纳米颗粒添加量为0.4％，辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％，cmc-na添加量为0.1％，木糖醇添加量为10％，柠檬酸添加量为0.1％，按照上述制备工艺进行，以感官评价、吸光稳定性、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts·自由基清除能力为考察指标，确定最优黄原胶添加量，结果如下表所示。

表17黄原胶添加量对姜黄素饮料品质的影响

由表17可知，随着黄原胶添加量的增加，感觉评分呈现先增加后下降的趋势，在黄原胶添加量为0.15％时，感官评分最高。这是因为黄原胶添加量为0.15％，饮料无分层，无沉淀，口感最好，随着其添加量增加，饮料变得粘稠，影响口感。且在黄原胶添加量为0.15％时，溶液体系处于稳定状态，吸光稳定系数达到最高，离心沉降率最低，当黄原胶添加量继续增加，溶液稳定状态被破坏，吸光稳定系数减少和离心沉降率增加。由图13可知，黄原胶添加量对dpph·自由基清除率％和abts⁺·自由基清除率％影响不大。综合表17、图13和图14，当黄原胶添加量为0.15％综合评分最高，由此确定黄原胶最适添加量为0.15％。

3.3辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量对姜黄素饮料品质的影响

分别添加依次设为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％五个水平，姜黄素纳米颗粒添加量为0.4％，cmc添加量为0.1％，黄原胶添加量为0.1％，木糖醇添加量为10％，柠檬酸添加量为0.1％，按照上述制备工艺进行，以感官评价、吸光稳定性、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts⁺·自由基清除能力为考察指标，确定最优辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量，结果如下表所示。

表18辛烯基琥珀酸淀粉钠添加影响量对姜黄素饮料的影响

由表18可知，随着辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量的增加，感官评分呈现先增加后下降的趋势，在辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％时，感官评分最高。这是因为辛烯基琥珀酸淀粉钠为0.4％时，饮料中烯基琥珀酸淀粉钠的气味和姜黄素气味最足。当辛烯基琥珀酸淀粉钠量继续增加时，辛烯基琥珀酸淀粉钠气味过浓，掩盖姜黄素气味，且口感下降。故感官评分下降。而吸光稳定系数最高和离心沉降率分别随着辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量的增加分别下降和增加。由图15可知，辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量对dpph·自由基清除率％略微提高，对abts⁺·自由基清除率％影响不大。综合表18、图15和图16，当辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％综合评分最高，由此确定辛烯基琥珀酸淀粉钠最适添加量为0.4％。

3.4姜黄素纳米颗粒添加量对姜黄素饮料品质的影响

姜黄素纳米颗粒依次设为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％五个水平，辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％，cmc添加量为0.1％，黄原胶添加量为0.1％，木糖醇添加量为10％，柠檬酸添加量为0.1％，按照上述制备进行，以感官评价、吸光稳定性、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts⁺·自由基清除能力为考察指标，确定最优姜黄素纳米颗粒的添加量，结果如下表所示。

表19姜黄素纳米颗粒添加量对姜黄素饮料品质的影响

由表19可知，随着姜黄素纳米颗粒添加量的增加，感官评分呈现先增加后下降的趋势，在姜黄素纳米颗粒添加量为0.8％时，感官评分最高。这是因为姜黄素纳米颗粒添加量为0.8％时，饮料中姜黄素气味最浓郁。当添加量超过0.8％，姜黄素气味过于浓郁，影响感官评价。而吸光稳定系数最高和离心沉降率分别随着姜黄素纳米颗粒添加量的增加分别下降和增加。由图17可知dpph·自由基清除率％和abts⁺·自由基清除率％随着姜黄素纳米颗粒添加量的增加而增加。综合表19、图17和图18，当姜黄素纳米颗粒添加量为0.8％综合评分最高，由此确定姜黄素纳米颗粒最适添加量为0.8％。

4.姜黄素饮料配方正交优化实验

4.1正交实验方法

以单因素实验结果为基础，以羧甲基纤维素钠添加量(a)、黄原胶添加量(b)、姜黄素冻干粉添加量(c)、辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量(d)为实验因素，以感官评价、吸光稳定系数、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts⁺·自由基清除能力为考察指标，采用综合评分法，选用l9(3⁴)正交实验优化延缓衰老的姜黄素饮料配方，设计表如下所示。

表20姜黄素饮料配方l9(3⁴)正交实验因素水平设计表

表21实验组考察指标分值

4.2正交实验结果与分析

表22l9(3⁴)正交试验结果

以综合评分法进行正交试验设计，结果如表22所示，由r值可知，各因素对姜黄素延缓衰老饮料影响程度的主次顺序为d>c>b>a，即姜黄素纳米颗粒冻干粉添加量为主要影响因素，其次为辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量，再次为黄原胶添加量，cmc-na添加量影响最小。又由k值可知，最佳方案为a3b2c2d2，即cmc-na添加量0.15％、黄原胶添加量为0.15％、辛烯基琥珀酸淀粉钠添加量为0.4％、姜黄素纳米颗粒添加量0.8％。

对正交试验结果进行方差分析见下表。

表23正交试验方差分析

结果如表23所示，结果表明：姜黄素纳米颗粒和辛烯基琥珀酸淀粉钠对该姜黄素延缓衰老饮料为显著影响因素，且姜黄素纳米颗粒显著性大于辛烯基琥珀酸淀粉钠，而cmc-na、黄原胶均为不显著因素。

4.3验证实验

正交最优组为a3b2c2d2，验证试验重复3次试验，结果如表24所示，姜黄素延缓衰老饮料综合评分为98.64分，试验结果稳定可靠，所以a3b2c2d2为综合评分高的较优组合。

表24验证试验

综上，姜黄素饮料的最优配方为：0.15％黄原胶，0.15％cmc-na，0.4％辛烯基琥珀酸淀粉钠、0.8％姜黄素纳米颗粒冻干粉、0.1％柠檬酸添加量和10％木糖醇，在此条件下，产品综合评价分最高，为98.64±0.05；感官评分为93.33±0.24，吸光稳定系数为0.518±0.005，离心沉降率为37.8％±0.4％，姜黄素饮料对dpph·自由基清除率为82.86％±0.00％，对abts+·自由基清除率为85.33％±0.00％，姜黄素饮料具有一定的抗氧化性。产品中姜黄素含量为4mg/ml。饮料为橙黄色，酸甜适口，有姜黄素特征气味。

4.4对比试验

配制与正交实验用同浓度锌离子结合的姜黄素、纳米颗粒的姜黄素、纯姜黄素，以它作对照。与正交最优组(a3b2c2d2)做的饮料做对照，从感官评价、吸光稳定性、离心沉降率、清除dpph·自由基能力、abts⁺·自由基清除能力方面比较。比较在制作成姜黄素饮料后各方面指标的变化。结果如下表所示。

表25对比试验

由表25可知，纯姜黄素溶液，结合zn²⁺姜黄素溶液、姜黄素纳米乳液、延缓衰老的姜黄素饮料，dpph·自由基清除率％与abts⁺·自由基清除率％依次下降，而稳定性依次上升，而纯姜黄素溶液、zn²⁺姜黄素溶液、姜黄素纳米颗粒溶液由于姜黄素不溶于水而析出，影响组织形态，且姜黄素气味过于浓郁，影响感官评分，因为姜黄素纳米颗粒在水溶液中的溶解性大大增强，有利于饮料的感官评价。因此延缓衰老的姜黄素饮料综合评分最高，为98.64分。

5.延缓衰老的姜黄素饮料的功效研究

以果蝇为模型，以半数死亡天数、平均寿命和平均最高寿命等果蝇生存实验指标反映姜黄素饮料延长果蝇寿命的功效；通过分析果蝇体内生化指标sod、mda水平变化初步探究姜黄素饮料延缓衰老的作用机制。

5.1果蝇培养基的制备

基础培养基：a液：蔗糖20g、琼脂3g、蒸馏水300ml、充分搅拌溶解，加热煮沸至琼脂完全融化。b液：玉米粉33g、葡萄糖21.24g、大豆粉4.5g、蒸馏水200ml，充分的搅拌混溶；将b液缓慢的倒入a液中，并且不断的搅拌，煮沸至糊状，停止加热，用1.25ml无水乙醇将0.125g对羟基苯甲酸酯溶解加入；待a、b混合液温度下降至约75℃时，加入酵母粉12.5g，充分搅拌后加入3.5ml的丙酸，搅拌均匀后立即倒入干净的培养管中，每管培养基高度1.5-2ml，完全凝固后，将培养基倒置于操作台内24h后可接种果蝇。

5.2姜黄素饮料剂量梯度选择

按国家食品药品监督管理局保健食品要求的模型，由人的推荐剂量(0.0033g/kg·bw·d)，体重60kg的人每日食物加饮水的量定为3000g，来推算出实验中间浓度，在此浓度上下按3倍组距各设1～2个浓度组，即四个剂量组，并设1个空白对照组。

5.3果蝇生存试验方法

收集8h内新羽化的果蝇雌雄各300，用乙醚麻醉区分雌雄，随机分为5组，每个剂量组雌雄各60只，分装于2.5cm×20cm的试管内，每管20只，置于相对湿度为45％～75％温度为25±1℃的恒温培养箱内，且每四天更换一次培养基，防止果蝇因食物黏连而死。每天观察果蝇的生存活动情况和死亡数量，直至果蝇全部死亡。并计算平均寿命、平均最高寿命(以最后死亡的10只果蝇的寿命计算)和半数死亡天数等指标，进行统计。

5.4数据分析

数据使用spss17统计分析软件进行统计分析，以p＜0.01，p＜0.05判定为差异具有统计学意义。

5.5实验结果分析

5.5.1姜黄素饮料对果蝇寿命的影响

通过半数死亡天数、平均寿命和平均最高寿命等指标反应姜黄素饮料延长果蝇寿命的功效，结果见表26。

表26姜黄素饮料对果蝇寿命的影响

*.均值差的显著性水平为0.05，极显著水平为0.01.

由表26结果可知，空白组和剂量组间平均寿命和平均最高寿命均存在显著性差异。当姜黄素饮料添加量为0.0201％时，雌雄果蝇的平均寿命和平均最高寿命均达到最高值。

雌性果蝇中，0.0201％剂量组的果蝇平均寿命和平均最高寿命分别为43.87±7.97和52.01±1.23均高于空白组，并且显著高于其他组，其延寿率分别达到13.95％和8.81％，0.0022％、0.0067％和0.0603％三组的平均最高寿命均高于空白组；雄性果蝇中，0.0067％和0.0201％剂量组的平均寿命和平均最高寿命均分别为38.83±9.77和48.20±1.29均高于空白组，其平均延寿率为14.17％和9.10％与16.67％和10.80％，4个剂量组的平均最高寿命均显著高于空白组，其中，0.0201％剂量组与其他各组的平均最高寿命也均存在显著差异。因此，本实施例所述的姜黄素饮料具有延长果蝇寿命的作用。

5.5.2姜黄素饮料对果蝇抗氧化酶活性的影响

表27姜黄素饮料对果蝇抗氧化酶活性的影响

*.均值差的显著性水平为0.05，极显著水平为0.01.

由表27结果可知，剂量组与空白组间sod活性和mda含量均存在差异。当姜黄素饮料浓度的增加，雌雄果蝇体内的sod活性也增加，当姜黄素饮料浓度0.0201％时，雌雄果蝇体内的sod活性达到最高值。雌雄果蝇体内的mda含量随着培养基中姜黄素饮料浓度的增加，雌雄果蝇体内的mda含量也减少。当姜黄素饮料浓度为0.0201％时，雌雄果蝇体内的mda含量达到最小值。因此，雌性果蝇中，0.0201％剂量组体内的sod活性极显著高于其他组，而mda含量显著低于其他剂量组。雄性果蝇中，0.0201％剂量组体内的sod活性和mda含量与空白组差异明显。

蝇果蝇生存实验中，对于雌雄果蝇，它们的平均寿命、平均最高寿命、半数死亡时间都随姜黄素饮料浓度增加而延长，在0.0201％剂量组达到最大，并且高于其他剂量组和空白组，姜黄素饮料可延长果蝇寿命，具有延缓衰老功效；随着姜黄素饮料添加量的增大，sod酶活性提高，mda含量下降，在姜黄素饮料添加量为0.0201％时，sod酶活性最高，mda含量最低。说明姜黄素饮料是通过提高sod酶活性、降低丙二醛mda含量的内在机制发挥延缓衰老作用的。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。