专利名称：非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA及抗原多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA及一种非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽。更具体地说，本发明涉及一种可用于生产非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽的非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，及其表达产物非甲非乙型肝炎抗原多肽。本发明的非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA还可用于以遗传学方法诊断非甲非乙型肝炎。此外，本发明的非甲非乙型肝炎抗原多肽可用于生产非甲非乙型肝炎疫苗、免疫球蛋白、多克隆或单克隆抗体、免疫学诊断剂、筛选输血用血液的试剂、以及用于亲和层析以从输血用血液中除去非甲非乙型肝炎病毒的试剂。
非甲非乙型肝炎病毒的定义病毒性肝炎是一种由于肝炎病毒感染而引起的肝脏疾病。迄今为止已分离并鉴定出了甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丁型(δ)肝炎病毒。丁型肝炎病毒(δ肝炎病毒)是一种缺陷型病毒，它不能自我增殖，其增殖要求有作为辅助病毒的乙型肝炎病毒同时存在。因此，丁型肝炎病毒只存在于乙型肝炎患者体内。1974年报导了许多患者的肝炎是由于甲型或乙型肝炎病毒感染以外的因素引起的。这种肝炎称为“非甲非乙型肝炎”，全世界都已对非甲非乙型肝炎病毒进行了广泛而深入的研究。迄今已发现有多种类型的非甲非乙型肝炎病毒存在。目前的研究结果表明，非甲非乙型肝炎病毒按其感染途径可分为两类，即流行性肝炎病毒，即经肠道传染的非甲非乙型肝炎病毒，它是通过水和食物传播的;经血液传染的非甲非乙型肝炎病毒，它是由于输血等而通过血液传播的。在非甲非乙型肝炎病毒中，只用病毒学方法鉴定出了在非洲、印度和东南亚地区传播的经肠道传染的非甲非乙型病毒，还尚未鉴定出血液传染的非甲非乙型肝炎病毒。
以下常把血液传染的非甲非乙型肝炎简称为“NANB肝炎”，常把血液传染的非甲非乙型肝炎病毒简称为“NANBV”。NANB肝炎研究的现状和问题有关于NANB肝炎的流行病学、临床检查、诊断、治疗和预防，世界上已进行了多种病毒学研究，其研究方法是根据诊断学、组织病理学、免疫学、分子生物学等方面的知识把NANBV与其它肝炎病毒进行比较(Japan Medical Journal，33203-10，1987;Igaku-no Ayumi(医学进展)，151(13)735-923，1989;Kan Tan Sui(肝、胆囊、胰)，21(1)5-113，1990;Jikken Igaku(实验医学)，8(3)201-233，1990)。关于NANB肝炎，已报导了下列发现。
(1)流行病学据日本厚生省的估计，日本约有60%的慢性肝炎患者(即大约七十二万患者)、约有40%的肝硬变患者(即大约十万患者)、约有40%的肝癌患者(即大约七千患者)，为NANB肝炎患者。此外，由上述NANB肝炎造成的死亡达每年一万六千人。在美国，输血后肝炎患者的人数达每年十五万至三十万，并且有90%的输血后肝炎患者为NANB肝炎患者。另外据认为，有1-6%的供血者为NANBV携带者。另据估计，其它国家NANB肝炎的发病率和NANBV携带者的比例也与美国和日本相同或更高。因此，NANB肝炎的预防、早期诊断和早期治疗具有全球重要性。
(2)病毒学迄今报导的NANBV都包含一个被膜和一个直径约50nm的球形病毒颗粒。分类学观察表明，已知的NANBV是一种与外衣病毒或黄热病病毒类似的病毒，或者是一种不同于外衣病毒或黄热病病毒的新型病毒。此外，给许多黑猩猩注射NANBV肝炎患者的血清，并对其肝细胞的细胞质进行病理学观察，结果表明，某些黑猩猩的肝细胞质内形成了管状结构，而在其它黑猩猩的肝细胞质内没有形成此结构，并且，在某些黑猩猩的肝细胞质内还形成了核内颗粒。这些结果以及流行病学观察结果、有无氯仿敏感性的测试结果、免疫学诊断结果，表明有多种类型的NANBV存在(参见例如Science，205197-200，1979;Journal of Infectious Disease，148254-265，1983;Biseibutsu(微生物)，5(5)463-475，1989)。存在于NANB肝炎患者血液中的NANBV的量，无论与存在于甲型肝炎患者粪便中的甲型肝炎病毒量相比，还是与存在于乙型肝炎患者血液中的乙型肝炎病毒量相比，都是极少的。例如，乙型肝炎患者血液中的病毒量按黑猩猩感染剂量(CID)计算为每毫升108-109个，而NANB患者血液中的病毒量按CID计算仅为每毫升104-105个(Bradley，D.W.输血后非甲非乙型肝炎研究展望，见《感染、免疫和输血》一书，Dodd，R.Y.和Barker，L.F.编，Alan R.Liss公司出版，New York，1985，第81-97页)。另外，已知除人外，动物中只有黑猩猩对NANBV敏感，而且在其肝细胞的细胞质中偶尔会由于NANBV感染而形成典型的管状结构。由于只有黑猩猩可以作为NANBV感染的实验动物使用，所以需要有大量的黑猩猩用于NANBV研究。但黑猩猩不易得且昂贵，因而必定会限制和延缓NANBV的研究，例如NANBV的实验性感染、NANBV的鉴定、以及寻找NANBV的有用标记等研究。为解决这些问题，已为NANBV的研究做了各种尝试。例如，曾试图从患NANB肝炎黑猩猩的血浆中克隆出NANBV基因组cDNA〔称为“丙型肝炎病毒(HCV)”〕(Science，244359-362，1989)，并证实，由该cDNA的表达所获得的抗原(称为“C-100”)与NANB肝炎患者血液中的抗体呈现出抗原抗体反应(Science，244362-364，1989)。另外还曾试图不用黑猩猩而从NANB肝炎患者的血浆中克隆出了NANBV基因组cDNA，并证实，由该cDNA的表达所获得的抗原与NANB肝炎患者血清中的抗体呈现出抗原抗体反应(Gastroenterologia Japonica，241120-1124和1130-1133，1989)。
(3)临床观察一般来说，肝炎既可按肝炎发病人数和发病率分成流行性肝炎和偶发性肝炎，也可按肝炎患者的严重程度和发病阶段分成急性肝炎、暴发性肝炎、亚急性肝炎、持续性肝炎和慢性肝炎。NANB肝炎的潜伏期为2-26周。NANB肝炎的早期症状比乙型肝炎要轻。例如，NANB肝炎患者只是发热并自诉疲倦。此外，有70%的患者有无黄疸症状。因此NANB肝炎常被人忽视。但NANB肝炎非常危险，因为NANB肝炎可能会转成慢性并因而发展成肝硬变。具体说，在血清转氨酶活性增加了的NANB肝炎患者中，有40-50%发展成慢性肝炎。慢性肝炎病例中有10-20%患有肝硬变。此外，每年有0.5-1%的受血者转变为肝硬变患者而无自觉症状。更为严重的是，肝硬变可能进一步发展成肝癌或肝肿瘤。因此，为预防由输血和流血引起的生物危害，从公共卫生的观点看，根除NANB肝炎是一件具有全球重要性的事情。
(4)诊断如前面所提到的，NANBV(血液传染型)尚未得到鉴定，也不了解可用于诊断NANB肝炎的病毒标记，如NANBV抗原。因此诊断NANB肝炎的方法一直是检查患者血清中特异于每一种已知致炎病毒(例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、细胞肥大病毒、EB病毒、水痘病毒和单纯性疱疹病毒)的抗体的效价，并将其血清中特异于任何上述病毒的抗体为阴性的患者诊断为患有NANB肝炎;或者通过肝脏的活组织检查进行组织病理学检查(《肝胆系统疾病》，第8版，S.Shenlock编，第326-333页，1989，Blackwell Scientific Publications)。同时还曾使用过另一种诊断方法。例如，曾使用过的一种方法是测定血清中一种酶的活性，例如GPT〔谷丙转氨酶，也称为“ALT”(丙氨酸氨基转氨酶)〕、GOT〔谷草转氨酶，也称为“AST”(天冬氨酸转氨酶)〕和鸟嘌呤脱氨酶(也称为“鸟嘌呤酶”)〔Kan Tan Sui(肝、胆囊、胰)，14519-522，1987)。关于前面提到的血清中的GPT或GOT，日本采用了一种NANB肝炎的诊断标准，其中采用持久的、异常高的GPT和GOT活性作为NANB肝炎的诊断标准(Journal of Blood Transfusion Society in Japan，31(4)316-320，1985;Nippon Rinsho，462635，1988)。关于免疫学诊断，目前的状况下难于分离和鉴定NANBV，因而利用NANBV cDNA克隆(已用遗传工程技术和免疫学知识分离出来)表达得到的抗原与NANB肝炎患者血清之间的抗原抗体反应作为诊断标准。已知抗原的例子包括由NANB肝炎患者的血浆制得的NANBV cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开363025)、由有NANB肝炎症状黑猩猩的血浆制得的“HCV”cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开318216和日本专利申请公开说明书2-500880)、由NANBV感染黑猩猩的肝脏得到的NANBV cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开293274;日本专利公开说明书64-2576;日本专利申请公开说明书1-124387)。作为一种测定抗原抗体反应的方法，通常采用RIA(放射免疫测定法)和EIA(酶免疫测定法)。但这些表达产物的抗原性不同。作为HCV cDNA表达产物的抗原(即前面提到的C-100抗原)，对由HCV感染引起的慢性肝炎的诊断来说可以是某种标准或尺度。但由于该抗原(C-100)表现其抗原性的区域有限(Biseibutsu(微生物)，5463-475，1989;Kan Tan Sui(肝、胆囊、胰)，2047-51，1990;Igaku-no Ayumi(医学进展)，151871，1989)，因此，从准确诊断NANB肝炎和NANBV感染的角度，以及从准确确定慢性肝炎和急性肝炎患者的发展以进行治疗的角度看，这种抗原不能令人满意。因此，一直需要获得一种对NANB肝炎进行诊断和预后的可靠方法。
(5)治疗和预防最近报导了α-干扰素和β-干扰素可用于治疗慢性NANB肝炎(Kan Tan Sui(肝、胆囊、胰)，2059-64，1990;Igaku-no Ayumi(医学进展)，151871-876，1989)。但α-干扰素和β-干扰素的合适剂量和合适服用时间尚未确定。
另一方面，为预防NANB肝炎而采用了各种疫苗，这些疫苗中使用上述的NANBV cDNA或HCV cDNA常规表达产物作为抗原(欧洲专利申请公开363025和欧洲专利申请公开318216)。但是，在完成本发明之前NANBV本身尚未得到分离和鉴定，从这一事实可明显看出，不可能从各具多种抗原决定基的上述表达产物中指定一种用于NANBV疫苗的抗原，并确定这种特异性抗原的有效性和安全性使其能够临床应用。因此，并没有能够便利地投入实际应用的NANBV疫苗。
本发明人作了广泛深入的研究发展出一种新的NANBV基因组cDNA，以解决上述问题。结果，本发明人竟成功克隆出一种NANBV基因组cDNA，它不仅与已知的NANBV cDNA相比具有优异的可靠性，而且其长度比任何已知的NANBV cDNA都要大，并含有NANBV基因组的完整开放读码区;本发明人还成功表达了这种NANBV cDNA，从而获得了一种NANBV抗原肽，这种肽能可靠地呈现出一种抗原抗体反应，这种反应不仅特异于慢性NANB肝炎患者的血清，而且特异于急性NANB肝炎患者的血清。这一成功归因于本发明人的一种独特技术，即，为获得真正的NANBV基因组，直接从NANB肝炎患者的全血或者从同时患NANB肝炎和肝癌的患者的切除肝脏中所含的NANBV颗粒提取NANBV RNA，尽管血液或切除肝脏中所含的NANBV的含量极少，即少到甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒的大约1/10，000。这种方法无需使NANBV在带有许多未知因子的黑猩猩体内增殖(这些未知因子被认为会使NANBV难于分离)，而只需在操作程序中稍加注意，就可以在贮存供提取NANBV基因组用的新鲜材料的过程中，使NANBV及其基因组不致因体液或血液酶类的作用而发生断裂和/或分解。然后利用反转录酶，将这样由新鲜人体材料制得的RNA转化成双链cDNA，得到一个cDNA文库。为从该cDNA文库中筛选出一个NANBV基因组，把cDNA分别插入λgt11噬菌体载体中，然后在噬菌斑上以高浓度进行表达，接着通过反复进行酶免疫测定(EIA)来筛选NANBV基因组cDNA，进行EIA时，既使用恢复期急性NANB肝炎患者的血清，也使用慢性NANB肝炎患者的血清。这样便通过以DNA重组技术表达本发明的cDNA，首次实现了以低成本大规模地安全生产高纯度的NANBV抗原多肽而不造成生物危害。根据以上叙述，本发明业已完成。
因此，本发明的一个目的是提供一种NANB肝炎病毒基因组cDNA。
本发明的另一个目的是提供一种NANB肝炎病毒抗原多肽，它可作为NANB肝炎的诊断剂和疫苗中的活性成分使用。
本发明的另一个目的是提供一种生产NANBV抗原多肽的方法。
本发明的另一个目的是提供一种NANB肝炎的诊断剂。
本发明还有一个目的是提供一种NANB肝炎的疫苗。
参照附图阅读了以下详细叙述和所附的权利要求书之后，本发明的上述目的和其它目的、特征和优点将是显而易见的。
附图中
图1(1)和图1(2)图示了本发明NANBV基因的各cDNA克隆之间相对于整个NANBV基因组区的相互关系;
图2(1)至图2(16)显示了本发明的整个NANBV基因组cDNA区的核苷酸顺序，以及该核苷酸顺序所编码的氨基酸顺序;
图3图示了本发明NANBV和日本脑炎病毒(JEV)的疏水性分布，其中把NANBV的疏水性指数与JEV做了比较。
本发明主要提供了一种分离的脱氧核糖核酸，它包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少一部分;另一个核苷酸顺序与所述核苷酸顺序互补，或者包含由所述核苷酸顺序按遗传密码的筒并性置换至少一个核苷酸所获得的至少一个核苷酸顺序。
本发明的另一方面提供一种分离的抗原多肽，该多肽包含至少一个氨基酸顺序，该顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，该脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序中333至9362位核苷酸的编码区。
在本发明中，除非特别指明，脱氧核糖核苷酸顺序的左端和右端分别为5′端和3′端。另外，除非特别指明，肽类氨基酸顺序的左端和右端分别为N端和C端。
本发明的NANBV基因组cDNA及其表达产物NANBV抗原多肽，可以按下列步骤(Ⅰ)至(Ⅷ)进行制备和鉴定。
步骤(Ⅰ)提取NANBV RNA所用材料的选择和收集。
作为提取NANBV RNA的材料，可以采用例如，NANBV携带者或患NANB肝炎的人或黑猩猩的血液、淋巴、腹水和肝细胞，以及同时患有NANB肝炎和肝癌或肝肿瘤患者的肝细胞。与由人体得到的材料相比，由黑猩猩得到的材料的NANBV含量可能比较低，而且黑猩猩有一些未知的因子，而这些未知因子被认为会使NANBV难于分离，因此，优选采用由人体得到的材料。在人的血液、淋巴、腹水和肝细胞中，血液最容易大量得到。例如，可从血库中得到大量不宜作输血用的血液。这种血液能便利地作为提取NANBV RNA的材料使用。用血液作材料时，把血液分成血浆和红细胞。对所得到的血浆进行检查，以确定该血浆对乙型肝炎病毒表面抗原是否呈阴性(世界卫生组织病毒性肝炎专家委员会病毒性肝炎的进展，世界卫生组织技术报告系列，60228-33，1977)，以及对乙型肝炎病毒基因组DNA是否呈阴性(Brechot，C.，Hadchouel，M.，Scotto，J.，Degos，F.，Charnay，P.，Trepo，C.，Tiollais，P.肝和血清中乙型肝炎病毒DNA的检测慢性携带者状态的一种直接评定法。Lancet 2765-768，1981)。此外还检查该血浆中被用来作为NANB肝炎诊断标准的酶活性，例如GPT(Wroblewski，F.& LaDue，J.S.心脏和肝脏疾病中的血清谷丙转氨酶，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，91569，1956)、GOT、鸟嘌呤酶等的活性。上述的把血液分成血浆和红细胞的方法及检查血浆的方法，是对不同批次的血液进行的。收集对乙型肝炎病毒的表面抗原和基因组cDNA都呈阴性，并表现出极高的上述酶活性(如GPT活性为35IU/ml或更高)的血浆。
与前述的乙型肝炎病毒颗粒相比，血液中NANB肝炎病毒颗粒的数目极少。由感染实验的结果估计，血液中NANB肝炎病毒颗粒的数目约为乙型肝炎病毒颗粒数目的1/10，000(Bradley，D.W.，(1985)输血后非甲非乙型肝炎研究展望，见《感染、免疫和输血》，Dodd，R.Y.和Barker，L.F.编，Alan R.Liss公司出版，New York，81-97页)。因此，对RNA的提取来说，优选采用大量的血液，例如大到约3-10升的量。将作为从NANBV颗粒中提取NANB RNA的材料使用的新鲜全血，在1-5℃下储存，以防止NANBV及其基因变性，并防止其基因由于酶的作用而断裂或分解。从新鲜全血的采集开始，还需要在48-72小时内以步骤(Ⅱ)完成NANBV RNA的制备。用肝细胞作材料时，可以从由于慢性NANB肝炎而并发肝肿癌或肝癌的患者体内切除肝组织，从该组织的非癌部分或癌部分取约1-3g使用较为有利。将作为材料使用的肝细胞以冰冻状态储存于-70℃。
步骤(Ⅱ)NANBV RNA的制备可以用常规方法从步骤(Ⅰ)获得的材料中提取并纯化出RNA。例如，用新鲜全血作材料时，取大约2-10升新鲜全血进行低速离心，收集作为上清液的血浆部分。通过纯化从血浆中得到病毒部分，用于后续的RNA提取和纯化程序。
另一方面，用肝细胞作提取NANBV RNA的材料时，取大约5-30倍体积的含核糖核酸酶抑制剂的稀释剂加到肝组织中。然后按常规方法用匀浆器等将肝组织破碎，得到肝细胞的匀浆液。作为稀释剂，可以采用10-150mM的常规缓冲液。然后对该匀浆液进行低速离心收集上清液。所收集的上清液作为提取和纯化NANBV RNA的原始溶液使用。NANBV RNA的提取和纯化可以用常规方法来进行，例如，有一种提取方法是采用核糖核酸酶抑制剂(如肝素、焦碳酸二乙酯和硫氰酸胍)与能促进蛋白变性的表面活性剂、螯合剂或还原剂的混合物;一种方法是用密度梯度离心法进行分级分离，采用蔗糖、氯化铯、三氯乙酸铯、菲科尔(Pharmacia Fine Chemicals AB，Sweden)等作为梯度的溶质;一种方法是用亲和柱利用mRNA特有的3′端多聚A链进行分离;一种分离方法是用免疫沉淀法利用特异于多核糖体上合成的蛋白的抗体来得到键接mRNA的多核糖体;一种基于双相分离原理的苯酚提取法;一种采用聚乙二醇、硫酸葡聚糖、醇类等的沉淀法。上述方法可以分别使用或配合使用。上述提取和纯化NANBV RNA的方法最好在pH3-10下进行，以防止RNA的不可逆变性。
步骤(Ⅲ)由NANBV RNA制备双链cDNA。
利用前面得到的NANBV RNA作为模板，可以用通常方法制得cDNA。即，利用一种寡聚脱氧胸苷和一个无规六核苷酸引物作为引物，并利用一种反转录酶，以NANBV RNA作模板合成与NANBV RNA互补的cDNA，得到一条双链，其中包含彼此互补键合的cDNA和NANBV RNA。然后使所得到的双链与核糖核酸酶H反应，使NANBV RNA分解并从cDNA中除去。这样便得到单链cDNA。用所得到的单链cDNA作模板，利用DNA合酶合成出双链cDNA。双链cDNA的合成可以很容易地利用市售的cDNA合成试剂盒来进行，例如利用cDNA Synthesis System Plus(英国Amersham公司制造并销售)、cDNA System Kit(瑞典Pharmacia LKB公司制造并销售)、cDNA Synthesis Kit(西德Boehringer Mannheim GmbH公司制造并销售)等。如果合成出的cDNA的量很小，该cDNA可利用常规方法进行扩增，例如利用PCR(聚合酶链反应)法(《PCR技术》，H.A.Erlich编，Stockton Press出版，1989)，用PCR试剂盒如AmpliTaq(美国Perkin Elmer Cetus公司制造并销售)进行。
步骤(Ⅳ)cDNA文库的制备利用步骤(Ⅲ)制得的cDNA，以通常方法制备cDNA文库。即，把步骤(Ⅲ)制得的cDNA切成若干长度不同的片段，将得到的各cDNA片段分别连接到可复制的克隆载体中，从而得到一个cDNA文库。作为可复制的克隆载体，可以采用任何已知的或市售的载体，如噬菌体基因、粘粒、质粒和动物病毒基因。用噬菌体基因或粘粒作可复制载体时，为使载体在每个cDNA片段分别插入其中后达到高稳定性和高转化能力，用通常方法对每个插入了cDNA的载体进行体外包装。这样就使所得到的插入了cDNA的载体为重组噬菌体颗粒的形式。所得到的噬菌体颗粒作为cDNA文库用于cDNA的克隆。另一方面，用质粒作可复制载体时，把上述cDNA片段分别插入到质粒载体中，然后按通常方法，把所得的插入了cDNA的载体分别导入宿主细胞中，例如导入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母等细胞中。所得到的转化体作为cDNA文库用于cDNA的克隆。另外，用动物病毒基因作可复制载体时，把上述cDNA片段分别插入到病毒基因载体中，然后按标准方法把所得的重组病毒分别转染到敏感型动物细胞中并使其在该细胞中增殖。在重组病毒的情况下，所得的重组病毒不经处理即作为cDNA文库使用。
cDNA文库的制备可以很容易地用市售试剂盒进行，例如用cDNA克隆系统λgt10和λgt11(英国Amersham公司、美国BRL公司和美国Stratagene公司制造并销售)、体外包装系统(英国Amersham公司、美国BRL公司和美国Stratagene公司制造并销售)等进行。
步骤(Ⅴ)由cDNA文库克隆含NANBV基因的cDNA。
此步骤得到一个含有NANBV基因的cDNA克隆。如果cDNA文库由转化体组成，则在标准琼脂培养基上培养这些转化体而形成集落。另一方面，如果cDNA文库由重组噬菌体颗粒或重组病毒组成，则用这些噬菌体颗粒或重组病毒来感染已知的敏感型宿主细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、动物细胞培养物等，并进行培养以形成噬菌斑或使感染细胞增殖。利用至少一种标准方法，分别用恢复期急性NANB肝炎患者的血清、慢性NANB肝炎患者的血清、和感染了NANBV的黑猩猩的血清，对上面得到的转化体集落、噬菌斑或感染细胞进行免疫测定，而不管NANBV是否属于能使黑猩猩的肝细胞质内形成管状结构的类型，从而选择并分离出所产生的NANBV抗原能与至少一种上述血清特异反应的集落、噬菌斑或感染细胞。为严格选择集落、噬菌斑和感染细胞，最好反复进行上述程序。按照T.Maniatis等人所述的标准方法(《分子克隆操作指南》，美国冷泉港实验室1982年版，第309-433页)，分别从所选择和分离出的集落、噬菌斑或感染细胞中分离出含有NANBV的cDNA克隆。进行免疫测定的方法可以是，例如酶标抗体技术，其中使用用酶如过氧化物酶和碱性磷酸酯酶标记的抗体;以及荧光抗体技术，其中使用用荧光素异硫氰酸酯、铕等标记的抗体。用上述技术进行免疫测定时，优选采用间接法，因为间接法即使采用极少量的患者血清也能实现高灵敏度免疫测定。作为间接法中所要采用的初级抗体，可以优选采用NANB肝炎患者的血清或患NANB肝炎黑猩猩的血清，因为这些血清中含有较大量的特异于NANBV抗原的抗体。作为间接法中所要采用的二级抗体，可以采用用酶、荧光物质等标记的市售抗人Ig(免疫球蛋白)抗体。
进行免疫测定的样品可按常规方法制备，例如用吸印法，这种方法是使集落、噬菌斑和感染细胞的核酸和蛋白质吸附在滤膜上;采用微量滴定板或显微载玻片的方法;等等。吸印法与间接酶标抗体技术并用时，能够容易而迅速地从极大量的原始集落、原始噬菌斑或原始感染细胞中选择出所要的集落、噬菌斑或感染细胞。在这种情况下进行吸印时，是使由硝酸纤维素、乙酸纤维素、尼龙等制成的市售滤膜与集落、噬菌斑或感染细胞接触。
上面得到的cDNA克隆是NANBV基因的一部分。因此，为获得覆盖整个NANBV基因区的cDNA克隆，必须用一种方法使该cDNA克隆伸长，这种方法是用该cDNA克隆的3′和5′端作探针分离出与该cDNA克隆相邻的cDNA片段。在这种情况下，可以采用称为“基因行走”(也称作“基因组行走”或“染色体行走”)的技术(《DNA克隆》第Ⅲ卷，D.M.Glover编，第37-39页，IRL Press，1987;《分子克隆操作指南》第二版，T.Maniatis等，3.21-3.23，1989)。重复克隆程序和基因行走，即可以cDNA克隆形式得到整个NANBV基因区。
在这一步骤中，最好测定所得到的每个cDNA克隆的核苷酸顺序。cDNA克隆核苷酸顺序的测定一般可按常规方法进行，例如Maxam-Gilbert法、双脱氧链终止法(Analytical Biochemistry，152232-238，1986)等。
根据测得的核苷酸顺序，可以确定氨基酸顺序。氨基酸的测序从起始密码子的位置(cDNA上的ATG或mRNA上的AUG)开始进行。该氨基酸顺序中的重要部分，例如被认为是构成了一个抗原决定基的亲水部分，可用如下方法来鉴定合成相应于每个亲水部分的肽并用高效液相色谱(HPLC)纯化该合成多肽，然后用纯化的肽进行酶免疫测定(EIA)或放射免疫测定(RIA)。
最好按照由cDNA克隆编码的NANBV抗原多肽各自的性质，把cDNA克隆分为几类，以便彼此区分这些克隆。在此，可以用每个cDNA克隆在NANBV基因限制图谱上的位置作为分类的尺度〔见图1(1)和图1(2)〕。另外，发现有些NANBV具有使黑猩猩肝细胞质内形成管状结构的能力，而有些NANBV则没有这种能力(Science，205197-200，1979)。所以，cDNA克隆可如下进行鉴定和分类分别取两种类型的NANBV各感染一只黑猩猩，这两种类型的NANBV分别能够和不能够使黑猩猩肝细胞质内形成管状结构，然后用分别取自这两只黑猩猩的血清检查上述的每个cDNA克隆与这些血清的血清学反应性。这种血清学反应性的检查可以用上述免疫测定法进行。
如图1(1)和1(2)所示，本发明中，本发明NANBV基因的cDNA克隆用前缀“BK”来标明。
图1(1)图示了本发明NANBV基因的各cDNA克隆之间相对于整个NANBV基因区的相互关系，图1(2)图示了由基因行走得到的各cDNA克隆之间相对于整个NANBV基因区的相互关系。
这些BK NANBV cDNA克隆包括，例如大肠杆菌BK 108(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2971)、大肠杆菌BK 129(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2972)、大肠杆菌BK 138(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2973)、大肠杆菌BK 153(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM 2974)、大肠杆菌BK 157、大肠杆菌BK 166(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2975)、大肠杆菌BK 172(保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2976)。这七个BK NANBV cDNA克隆被认为至少覆盖了NANBV基因的整个开放读码区，有可能覆盖了整个NANBV基因区。
由上述BK NANBV cDNA克隆覆盖的整个NANBV基因区的核苷酸顺序，以及由此核苷酸顺序编码的氨基酸顺序，示于图2(1)至图2(16)。根据图2(1)至图2(16)所示的整个NANBV核苷酸顺序和整个NANBV氨基酸顺序，可以对NANBV基因的核苷酸顺序和氨基酸顺序与其它病毒基因的同源性、疏水性指数(疏水性/亲水性分布)、NANBV基因的结构、抗原决定基区等，进行各种研究和观察。
同源性的研究可如下进行把NANBV基因的核苷酸顺序和氨基酸顺序与其基因已公知的各种病毒(日本专利申请公开说明书62-286930;Virology，161497-510，1987)及其它病毒进行比较。其它病毒的例子有牛病毒腹泻-粘膜病病毒(Virology，165497-510，1988)、猪霍乱病毒(Virology，171555-567，1989)、烟草叶脉斑纹病毒(Nucleic Acid Research，1655417-5430，1986)等。
关于疏水性指数的分析，可以用各种技术进行研究，例如利用遗传信息处理软件、SDC-Genetyx(日本SDC软件株式会社制造并销售)、Doolittle程序(Journal of Molecular Biology，157105-132，1982)等。
图3图示了本发明NANBV和日本脑炎病毒(JEV)的疏水性分布，其中把这两种病毒各自的疏水性指数彼此作了比较。发现NANBV基因和JEV基因的基因结构之间有明显的相似性。如图3所示，本发明的NANBV多肽含有三个结构蛋白，即核心蛋白(C)、前基质蛋白(前M)，后者进一步加工成基质蛋白(M)和被膜(E);以及七个非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。这些蛋白分别由下列核苷酸顺序编码。
C蛋白333至677位核苷酸。
M蛋白678至905位核苷酸。
E蛋白906至1499位核苷酸。
NS1蛋白1500至2519位核苷酸。
NS2蛋白2520至3350位核苷酸。
NS3蛋白3351至5177位核苷酸。
NS4a蛋白5178至5918位核苷酸。
NS4b蛋白5919至6371位核苷酸。
NS5蛋白6372至9362位核苷酸。
这些核苷酸顺序可用于NANB肝炎的诊断。分别由这些核苷酸顺序编码的多肽作为抗原不仅可用于疫苗，而且可用于NANB肝炎的诊断剂。
图2(1)至图2(3)所示的第1位(Met)至第389位(Gly)氨基酸代表了上述的三个结构蛋白。第1位的甲硫氨酸残基为由起始密码子编码的残基。
本发明人经过进一步的研究发现，下列核苷酸顺序含有能与抗NANBV抗体反应的抗原决定基这些核苷酸顺序分别为333至422位核苷酸、333至1499位核苷酸、333至6371位核苷酸、474至563位核苷酸、906至953位核苷酸、1020至1046位核苷酸、1020至1121位核苷酸、1194至1232位核苷酸、1209至1322位核苷酸、4485至4574位核苷酸、5544至5633位核苷酸。
如下所述，上述核苷酸顺序或含有这些核苷酸顺序作为其整个顺序一部分的核苷酸顺序，不仅可以有效地用于由DNA重组技术或化学合成法生产NANBV抗原多肽，而且可以有效地用于利用杂交法或聚合酶链反应(PCR)来诊断NANB肝炎。
此外还发现，包含图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸整个区域中的至少六个核苷酸的核苷酸顺序，在NANB肝炎的诊断中可用作杂交探针或聚合酶链反应的引物;还发现，如果一个多肽包含由一个核苷酸顺序编码的至少四个氨基酸，而该核苷酸顺序为333至9362位核苷酸顺序中的至少十二个核苷酸，则所述多肽作为抗原不仅可有效地用作疫苗，而且可有效用作NANB肝炎的诊断剂。另外如本领域所公知的，与该核苷酸顺序互补的核苷酸顺序也可以在NANB肝炎的诊断中用作杂交探针或聚合酶链反应的引物。另外，在NANBV核苷酸顺序编码区的至少一部分中按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸，所得到的核苷酸顺序也可用于由DNA重组技术生产本发明的抗原多肽。
因此，本发明的分离的脱氧核糖核酸包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少一部分;另一个核苷酸顺序与所述核苷酸顺序互补，或者包含由所述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸所获得的至少一个核苷酸顺序。
在本发明就脱氧核糖核酸而言的一个优选方案中，脱氧核糖核酸包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少6个核苷酸。
在本发明就脱氧核糖核酸而言的另一个优选方案中，脱氧核糖核酸包含选自以下核苷酸顺序的至少一个核苷酸顺序333至422位核苷酸、333至677位核苷酸、333至1499位核苷酸、333至6371位核苷酸、474至563位核苷酸、678至905位核苷酸、906至953位核苷酸、906至1499位核苷酸、1020至1046位核苷酸、1020至1121位核苷酸、1194至1232位核苷酸、1209至1322位核苷酸、1500至2519位核苷酸、2520至3350位核苷酸、3351至5177位核苷酸、4485至4574位核苷酸、5178至5918位核苷酸、5544至5633位核苷酸、5919至6371位核苷酸、6372至9362位核苷酸、1至9416位核苷酸。
本发明的分离的抗原多肽包含至少一个氨基酸顺序，该顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，该脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序中333至9362位核苷酸的编码区。
在本发明就抗原多肽而言的一个优选方案中，抗原多肽包含由至少4个氨基酸组成的至少一个氨基酸顺序，该氨基酸顺序由333至9362位核苷酸顺序中至少12个核苷酸的核苷酸顺序编码。
在本发明就抗原多肽而言的另一个优选方案中，抗原多肽所包含的氨基酸顺序由选自如下顺序的核苷酸顺序编码333至422位核苷酸、333至677位核苷酸、333至1499位核苷酸、333至6371位核苷酸、474至563位核苷酸、678至905位核苷酸、906至953位核苷酸、906至1499位核苷酸、1020至1046位核苷酸、1020至1121位核苷酸、1194至1232位核苷酸、1209至1322位核苷酸、1500至2519位核苷酸、2520至3350位核苷酸、3351至5177位核苷酸、4485至4574位核苷酸、5178至5918位核苷酸、5544至5633位核苷酸、5919至6371位核苷酸、6372至9362位核苷酸、333至9362位核苷酸。
此外应当注意，因为由图2(1)至图2(16)所示的NANBV整个编码区所编码的多肽或整个编码区的表达产物含有NANBV的所有蛋白颗粒，所以，这样一种多肽与只含单一抗原决定基的抗原相比，其抗原抗体反应谱较宽，因而能与由于NANB肝炎病毒感染而产生的多种抗体发生反应，这就使它在检测NANB肝炎时灵敏度很高，正如实施例2所表明的。
步骤(Ⅵ)NANBV基因组cDNA克隆的表达和NANBV抗原多肽的大量生产。
为了表达NANBV抗原基因的克隆cDNA，从而以工业规模生产NANBV抗原多肽，从可复制克隆载体中取出存在于cDNA克隆中的部分或全部克隆cDNA，并将其与一个可复制的表达载体重组。举例来说，用一种限制酶切下每个cDNA克隆的部分或全部cDNA，得到含有NANBV抗原基因的DNA片段(以下称为“NANBV DNA片段”)。然后用通常方法把NANBV DNA片段插入一个可复制的表达载体中。如果把一个DNA片段插入表面载体，就可通过基因表达而产生一种类型的抗原多肽。如果把两个或更多个不同的DNA片段依次插入表达载体，则可通过基因表达产生融合多肽形式的抗原多肽，该融合多肽包含由所插入的DNA片段编码的多肽。另外，利用已插入了图2(1)至图2(16)所示的整个开放读码(ORF)区的表达载体，能产生完整的NANBV颗粒。此外，利用已插入了开放读码的表达载体，而该开放读码只在编码RNA聚合酶的NS5区有缺陷，则能产生不含RNA基因组的不完整NANBV颗粒。
作为可用于此步骤的可复制表达载体，可以使用任何常见的或市售的表达载体。表达载体的例子包括肠细菌质粒载体pSN508(美国专利4，703，005)、酵母质粒载体pBH103及其系列(日本专利申请公开说明书63-22098)、质粒pJM105(日本专利申请公开说明书62-286930)、减毒水痘病毒基因(日本专利申请公开说明书53-41202)、减毒Marek氏病病毒(The Journal of Japanese Society of Veterinary，2720-24，1974;Gan Monograph on Cancer Research，1091-107，1971)、质粒pTTQ系列(英国Amersham公司制造并销售)、质粒pSLV系列(瑞典Pharmacia LKB公司制造并销售)、等等。
按常规方法把已插入了NANBV DNA的表达载体分别导入或转染到对该载体敏感的宿主细胞中，得到转化体。然后从这些转化体中选择出已产生NANBV抗原多肽或NANBV颗粒的转化体。可以用前面步骤(Ⅴ)中提到的免疫测定法检测NANBV抗原多肽(或NANBV颗粒)的产生。如果用动物病毒基因作表达载体，则可得到其表面带有NANBV抗原多肽的重组病毒。这种重组病毒可以便利地用作一种多功能疫苗的原料，这种疫苗不仅具有病毒载体固有的抗原性，而且具有NANBV的抗原性。
按通常方法培养上面得到的转化体或重组病毒，能够以工业规模在该转化体或重组病毒的培养物中生产NANBV抗原多肽。关于用动物病毒基因作表达载体的方法，其细节可参考欧洲专利申请公开0 334 530 A1。
因此，本发明的另一方面提供一种生产非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽的方法，该方法包括(a)把一个脱氧核糖核酸插入选自质粒和动物病毒基因的可复制表面载体中，如果该可复制表达载体为质粒，则得到一个可复制的重组DNA，该DNA包含质粒和插入其中的脱氧核糖核酸;如果该表达载体为动物病毒基因，则得到一个重组病毒，该病毒包含动物病毒基因和插入其中的脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包含至少一个选自如下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序的333至9362位核苷酸编码区的至少一部分;另一个核苷酸顺序则是由上述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸而得到的;
(b)如果步骤(a)所用的可复制表达载体为质粒，则用重组DNA转染微生物细胞或真核细胞培养物，从而形成转化体，接着从亲本微生物细胞或真核细胞培养物中选择出转化体;
(c)培养步骤(b)得到的转化体，从而表达脱氧核糖核酸，产生单一形式的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽;或者培养步骤(a)得到的重组病毒，从而表达脱氧核糖核酸和动物病毒基因，以增殖重组病毒形式产生非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽，该重组病毒包含动物病毒和其表面上所含有的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽;
(d)分离出非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽或经过增殖的重组病毒。
如果核苷酸顺序为333至9362位核苷酸或333至6371位核苷酸的核苷酸顺序，则可得到完整的或不完整的非甲非乙型肝炎病毒颗粒。
此外，用图2(1)至图2(16)的cDNA的部分或全部作模板，可按标准方法体外转录合成出相应的RNA或mRNA。例如，用限制酶HindⅢ消化质粒pDM-18(实施例2中构建)，然后利用T7 RNA聚合酶和降解物基因活化蛋白类似物进行体外转录，制得cDNA，用该cDNA的整个区域作为模板，可合成出相应于图2(1)至图2(16)的整个cDNA区的RNA或mRNA。这样合成出的RNA或mRNA覆盖了整个NANBV基因区，即，该RNA或mRNA几乎是裸露的NANBV基因组。因此，如果把该mRNA转染到动物细胞中，就能得到感染性NANBV颗粒。上述mRNA可以利用(例如)市售的mRNA Capping Kit(美国Stratagene公司制造并销售)以常规方式合成。关于这种合成的操作步骤，其细节可参考《分子生物学的现行方案》一书(“Current Protocols in Molecular Biology”，10.17.1-10.17.5，John Wiley & Sons出版，1989)。可以用图2(1)至图2(16)的cDNA的部分或全部制得的RNA，是NANBV基因组的部分或全部，因此，该RNA不仅可用于生产不完整NANBV颗粒、完整NANBV颗粒或NANBV抗原，而且可用来研究NANBV和它所引起的感染性疾病。
步骤(Ⅶ)NANBV抗原多肽的纯化转化体或重组病毒培养物中产生的NANBV抗原多肽，可以用适当组合的通常技术来纯化，这些技术选自例如，盐析;用硅胶、活性碳等吸附和解吸附;用有机溶剂进行沉淀;用超离心法分级分离;用离子交换层析法或亲和柱层析法进行分离;用高效液相色谱法或电泳法进行分级分离;等等。
如果从大肠杆菌转化体或酵母转化体的培养物中纯化NANBV抗原多肽，那么，由于大肠杆菌和酵母产生的变应原会使NANBV抗原多肽终产物的量显著降低，所以从有效除去这些变应原的角度来说，最好采取以下步骤进行纯化，例如(1)用硅胶进行吸附和解吸附，通过在活性炭上吸附去除杂质;(2)用密度梯度离心法以此顺序进行分级分离(日本专利申请公开说明书63-297)。如果从重组病毒的培养物(例如被重组病毒感染的细胞培养物)中纯化NANBV抗原多肽，那么，把含有抗原的粗溶液用超离心法和密度梯度离心法进行反复纯化，即可制得高纯度NANBV抗原多肽。
这样，便得到含有纯化的本发明NANBV抗原多肽的溶液。如果需要，可把该溶液冷冻干燥而得到干燥形式的纯化NANBV抗原多肽。
可用如下方法得到本发明的混合抗原多肽使具有不同核苷酸顺序的至少两种不同类型的cDNA进行基因表达，得到至少两种不同类型的NANBV抗原多肽，并将它们混合。
如上所述，NANBV的核心蛋白(C蛋白)、基质蛋白(M蛋白)和被膜蛋白(E蛋白)包含在图2(1)至图2(3)所示的第1位(Met)至第389位(Gly)氨基酸区域中。所以，这一区域中所含的上述抗原决定基，尤其是分别由906至953位核苷酸、1020至1046位核苷酸和1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序所编码的那些抗原决定基，是极为有用的抗原。这些抗原决定基可通过多肽合成来得到。多肽合成可以利用市售多肽合成仪来进行，例如用COUPLER 2100型多肽合成仪(美国杜邦公司制造并销售)和430A型多肽合成仪(美国Applied Biosystems公司制造并销售)。合成出的抗原多肽可用于例如生产疫苗、诊断剂和抗体。
本发明的另一方面提供一种可复制的重组DNA，该DNA包含一个选自质粒和动物病毒基因的可复制表达载体和一个脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序的1至9416位核苷酸编码区中的至少一部分;另一个核苷酸顺序则是由所述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸而得到的。
该可复制重组DNA不仅可用于生产本发明的NANBV抗原多肽，而且可用于通过复制而扩增本发明的NANBV基因组cDNA。
就用于通过复制而扩增NANBV基因组cDNA的可复制重组DNA而言，本发明的一个优选方案中所述核苷酸顺序包含1至9416位核苷酸的核苷酸顺序中的至少6个核苷酸。
就用于生产NANB抗原多肽的可复制重组DNA而言，本发明的一个优选方案中所述核苷酸顺序包含333至9362位核苷酸的核苷酸顺序中的至少12个核苷酸。
就用于生产NANBV抗原多肽的可复制重组DNA而言，本发明的另一个优选方案中所述核苷酸顺序选自以下核苷酸顺序333至422位核苷酸、333至677位核苷酸、333至1499位核苷酸、333至6371位核苷酸、474至563位核苷酸、678至905位核苷酸、906至953位核苷酸、906至1499位核苷酸、1020至1046位核苷酸、1020至1121位核苷酸、1194至1232位核苷酸、1209至1322位核苷酸、1500至2519位核苷酸、2520至3350位核苷酸、3351至5177位核苷酸、4485至4574位核苷酸、5178至5918位核苷酸、5544至5633位核苷酸、5919至6371位核苷酸、6372至9362位核苷酸、333至9362位核苷酸。
本发明的纯化NANBV抗原多肽可用作检测NANB肝炎的诊断剂。
本发明的NANBV抗原多肽可以如下法配制成一种诊断剂。把前述步骤(Ⅶ)得到的纯化NANBV抗原多肽溶液置于一个容器(如管瓶或安瓿)中，并密封。密封前，可以以与上述方法相同的方式将装在容器中的抗原多肽溶液冷冻干燥。装在容器中的NANBV抗原多肽的量一般为约1μg至约10mg。也可以使NANBV抗原多肽吸附在常用载体的表面上，常用载体的例子有微量滴定板、聚乙烯珠、滤纸或膜。
血清与NANBV抗原多肽反应性的测定，可以按与上述步骤(Ⅴ)所述基本相同的方式来进行。即，反应性的测定可以用常规免疫测定法进行，例如放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光抗体技术(FA)、被动血细胞凝集法(PHA)、反向被动血细胞凝集法(rPHA)等。上述免疫测定法应采用的NANBV抗原多肽的量一般约为每毫升血清0.1-100mg。具体说来，RIA、ELISA、FA、PHA和rPHA所应采用的NANBV抗原多肽的量一般分别为0.1-1mg/ml、0.1-1mg/ml、1-100mg/ml、1-50mg/ml、1-50mg/ml。
本发明的NANBV抗原多肽还可用于筛选输血用血液。该筛选方法包括a)从全血中分离出血清;
b)使未知血液的血清与一种分离的NANBV抗原多肽接触，该多肽包含至少一个氨基酸顺序，该顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，所述脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的NANBV核苷酸顺序中的333至9362位核苷酸编码区;
c)测定该血清是否与NANBV抗原多肽反应;
d)根据该反应性将血清归类为对非甲非乙型肝炎呈阳性还是阴性;
e)按鉴定结果来区分血液。
未知血液的血清与本发明的NANBV抗原多肽的接触，以及该血液的血清与NANBV抗原多肽反应性的测定，可以按照与前面所述的NANB肝炎诊断方法相同的方式进行。用上述方法能够选择出不含NANBV的输血用血液。
特异于本发明NANBV抗原多肽的多克隆抗体和单克隆抗体，可以作为从输血用血液中除去NANBV的试剂使用。就是说，这种多克隆抗体或单克隆抗体能通过抗原抗体反应而有效地除去血液中存在的NANBV。
另外，本发明的NANBV抗原多肽可以便利地用作NANB肝炎疫苗的活性成分。NANB肝炎疫苗可如下法制备取一种含有重组噬菌体或质粒的转化体，所述重组噬菌体或质粒携有编码NANBV抗原多肽的cDNA;或者取一种用重组病毒感染的细胞，所述重组病毒携有编码NANBV抗原多肽的cDNA。按与上述相同的方式，对所述转化体或细胞进行培养，从而在培养物中产生NANBV抗原多肽。为使培养物中的NANBV抗原多肽去毒以确保该抗原多肽的安全性，并使该抗原多肽固定以稳定该抗原多肽的免疫原性和抗原性，最好在转化体或重组病毒感染细胞的培养物中，或者在去除转化细胞或重组病毒感染细胞后得到的培养基中，加入一种常规失活剂。例如，可以加入数量为0.0001-0.001%(V/V)的失活剂如福尔马林，接着在4-37℃下保温5-90天。然后按与上述相同的方式对所得培养物或培养基进行纯化。这样便得到一种含有纯化NANBV抗原多肽的原始NANB肝炎疫苗溶液。
按标准方法用微量过滤器把原始NANB肝炎疫苗溶液过滤，使该溶液灭菌。滤液用生理盐水稀释，使得用Lowry法测得的蛋白浓度约为1-500μg/ml。然后在所得的溶液中加入氢氧化铝凝胶作为佐剂，使所加入的凝胶的浓度变为约0.1-1.0mg/ml。佐剂还可采用沉淀性沉积佐剂，例如磷酸钙凝胶、磷酸铝凝胶、硫酸铝、氧化铝和膨润土;以及诱导抗体生成的佐剂，例如胞壁酰肽衍生物、多核苷酸、Krestin(日本吴羽化学工业株式会社制造并销售)和溶链菌(二者都是抗肿瘤剂)。另外，可以在该混合物中加入至少一种稳定剂。作为稳定剂，可以使用任何市售稳定剂。稳定剂的例子包括明胶及其水解产物;清蛋白;糖类，如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和乳糖;氨基酸类，如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。
然后，把所得到的含有凝胶吸附NANBV抗原多肽的NANB肝炎疫苗溶液装入一个小容器(如安瓿或管瓶)中，并密封。这样便得到包含吸附NANBV抗原多肽的、纯化的吸附NANB肝炎疫苗。
所得到的NANB肝炎疫苗溶液可以经冷冻干燥而得到干燥形式的NANB肝炎疫苗，从而使该产品能运输至气候恶劣的地方(如热带地区)贮存。一般可以在液态吸附NANB肝炎疫苗装入容器(如管瓶或安瓿)后，按标准方法进行冷冻干燥。冷冻干燥后，在装有干燥疫苗的容器中通入氮气，然后再密封。顺便提一句，检验疫苗产品质量的根据是日本厚生省第159号通知《生物制品的最低要求》中所规定的“吸附乙型肝炎疫苗”、“干燥日本脑炎疫苗”和“吸附百日咳疫苗”。
NANB肝炎疫苗可以以混合疫苗的形式制备，这种混合疫苗中含有上述吸附NANBV抗原多肽和至少一种本发明NANBV抗原多肽以外的抗原。作为本发明NANBV抗原多肽以外的抗原，可以采用通常作为相应疫苗活性成分使用的任何抗原，其前提是由这些其它抗原和NANBV抗原多肽引起的副作用和不良反应，不会由于NANBV抗原多肽和这些其它抗原的共用而累积增加或协同增加;而且，NANBV抗原多肽和这些其它抗原的抗原性和免疫原性，不会由于NANBV抗原多肽和其它抗原间的相互干扰而减小。可与NANBV抗原多肽混合的抗原的数目和类型不受限制，只需达到上述前提，即，副作用和不良反应不会累积增加或协同增加，NANBV抗原多肽和上述抗原各自的抗原性和免疫原性不会减小。一般可以用2-6种类型的抗原与NANBV抗原多肽混合。可以与本发明NANBV抗原多肽混合的抗原的例子包括去毒抗原、失活抗原或类毒素，其来源有日本脑炎病毒、HFRS(伴有肾综合症的出血热)病毒、流感病毒、副流感病毒、乙型肝炎病毒、登革热病毒、艾滋病病毒、百日咳博德特氏菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌等。
一般来说，包含本发明NANBV抗原多肽的疫苗可以装在管瓶、安瓿等中密封起来。本发明的疫苗一般可以以液体或悬浮液形式接种。如果疫苗为干燥形式，则在接种前把疫苗溶于或悬浮于无菌蒸馏水中，蒸馏水的量应使终体积达到冷冻干燥前的原始体积。该疫苗一般可以皮下接种。每人的疫苗剂量一般可以是约0.5ml。每位儿童的疫苗剂量一般可以是每位成人疫苗剂量的一半。该疫苗一般可以以大约一周至一个月的间隔接种两次，在大约半年后再接种一次。
另外，NANBV抗原多肽可用于制备特异于NANBV抗原多肽的抗体，如多克隆抗体和单克隆抗体。例如，可以按如下的常规方法制备特异于NANBV抗原多肽的多克隆抗体。以皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内途径给一种动物如小鼠、豚鼠和兔接种本发明的纯化NANBV抗原多肽。NANBV抗原多肽的接种一般以1-4周的间隔进行若干次，从而使动物完全免疫。为增强免疫效果，可以使用一种常规的市售佐剂。然后从免疫动物体内收集血清，并按标准方法从该血清中分离纯化出抗NANBV抗原多肽多克隆抗体。
另一方面，可以用文献所述的常规方法(例如Cell Technology，123-29，1982)来制备特异于NANBV抗原多肽的单克隆抗体。例如，从用纯化NANBV抗原多肽免疫的小鼠取得脾细胞，利用细胞融合技术使这些脾细胞与市售的小鼠骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤。对这些杂交瘤进行筛选，得到一种能够产生与NANBV抗原多肽反应的抗体的杂交瘤。用标准方法培养所得到的杂交瘤。用标准方法从培养上清液中分离纯化出抗NANBV抗原多肽单克隆抗体。
上述多克隆抗体和单克隆抗体还可以作为诊断NANB肝炎的诊断剂使用。用抗体进行NANB肝炎的诊断时，可以按照与前面所述的采用NANBV抗原多肽诊断NANB肝炎的方法基本相同的方式，用免疫测定法进行。利用多克隆抗体或单克隆抗体，能够对存在于肝组织和血液中的NANBV抗原多肽进行鉴定和定量。
用适当的限制酶消化本发明所限定的NANBV基因组cDNA克隆，即可制得本发明的NANBV基因组cDNA。本发明的NANBV基因组cDNA也可以按本申请的图2(1)至图2(16)所示的核苷酸顺序用DNA合成技术来制备。通过DNA合成技术制备NANBV基因组cDNA时，可以利用通常的DNA合成仪来进行，例如用380B型DNA合成仪(美国Applied Biosystem公司制造并销售)和8700型DNA合成仪(美国Biosearch公司制造并销售)。本发明的NANBV基因组cDNA可用来进行NANBV感染的遗传学诊断。就是说，本发明的NANBV基因组cDNA可以作为聚合酶链反应(PCR)的引物而用于检测患者体液或细胞中的NANBV基因。对利用聚合酶链反应进行诊断来说，NANBV基因组cDNA的用量为10-100ng。
本发明的NANBV基因组cDNA还可以用来以杂交技术诊断NANB肝炎。具体说就是，用例如生物素、碱性磷酸酯酶、放射性同位素32P等标记NANBV基因组cDNA，并作为杂交探针使用。用于以杂交技术进行诊断的cDNA可用标准方法来制备，例如如下方法。取含有上述步骤(Ⅴ)所得NANBV cDNA的重组噬菌体，用适当的限制酶消化，切下含NANBV cDNA的DNA片段。把所得的DNA片段连接到一个市售的可复制克隆质粒中，得到含有该DNA片段的重组质粒。将重组质粒导入宿主细胞形成转化体，并培养该转化体使重组质粒增殖。从转化体中分离出已增殖的重组质粒，并用限制酶消化。所得的消化液进行低熔点琼脂糖电泳，分离纯化出编码NANBV抗原多肽的cDNA。所得cDNA用生物素、碱性磷酸酯酶、放射性同位素32P等标记。cDNA的标记可以利用市售的缺口转译试剂盒或多引物DNA标记系统(英国Amersham公司、日本基因株式会社等制造并销售)来进行。把标记的cDNA放入容积大约为5-20ml的容器(如管瓶或安瓿)中并密封。放入容器中的标记cDNA的量一般为每个容器1-100μg。标记cDNA可以以溶液形式装在容器中，也可以冻干态装在容器中。利用标记cDNA诊断NANB肝炎时用标准杂交方法进行。即，使从患者体内得到的血浆、血清或白细胞与标记cDNA接触，并检测与标记cDNA杂交的RNA。检测与标记cDNA杂交的RNA时可用标准方法进行。如果cDNA是用酶标记的，则用酶免疫测定法进行检测。如果cDNA是用放射性同位素标记的，则用(例如)闪烁计数法进行检测。
本发明的NANBV基因组cDNA具有良好的可靠性，并含有NANBV基因的整个开放读码区。
本发明的NANBV抗原多肽能特异地与NANBV反应。因此，在用该NANBV抗原多肽作诊断剂时，很容易以高度的可靠性进行NANB肝炎的诊断。另外，用本发明的NANBV抗原多肽来筛选输血用血时，很容易以高度的可靠性选择出被NANBV感染的血液，并将其从未被NANBV感染的血液中剔除。因此便可以预防输血后NANB肝炎。
另外，本发明的NANBV抗原多肽可以便利地用作预防NANB肝炎的疫苗中的活性成分。
另外，利用本发明的NANBV抗原多肽，很容易制备出一种特异于NANBV的抗体，特别是单克隆抗体。特异于NANBV的抗体可以便利地不仅作为检测NANB肝炎的诊断剂使用，而且作为从输血用血中除去NANBV的试剂使用。
此外应该注意，本发明的NANBV抗原多肽不是通过用病毒感染动物而产生的，而是通过使编码本发明抗原多肽的DNA在宿主细胞中进行基因表达而产生的。因此，在生产本发明抗原多肽的步骤中，基本上避免了感染的可能性。另外，还可以降低生产成本。此外，由于生产过程中所用的所有材料，例如保温系统的介质，其组成是公知的，所以便于进行纯化，并能得到高纯度的抗原多肽产品。
现将参照下列实施例详细叙述本发明，这些实施例不应被误认为是限制本发明的范围。
实施例1步骤1(制备得自血浆的RNA，用于生产与NANBV基因组RNA互补的cDNA)为从血浆中得到NANBV，取4.8升谷丙转氨酶(GPT)活性为35IU/升或更高的人血浆(活性用Wroblewski，F和J.S.LaDue的方法测定“心脏和肝脏疾病中的血清谷丙转氨酶”，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，91569，1956)，将其铺在30%(W/W)蔗糖水溶液上，在4℃下以48，000×g离心13小时，得到沉淀物。将该沉淀悬浮在含有50mM Tris·HCl(pH8.0)和1mM EDTA的水溶液中，在4℃下以250，000×g再次离心3小时，从而得到沉淀物。将所得沉淀溶于75ml 5.5M GTC溶液中，该溶液含有5.5M硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠(pH7.0)、0.05%月桂基肌氨酸钠和0.1M2-巯基乙醇。将所得溶液铺在16ml CsTFA-0.1M EDTA溶液(ρ＝1.51)上，在15℃下以140，000×g离心20小时，从而得到RNA沉淀。吸出含蛋白和DNA的上清液，将沉淀溶于200μl TE(10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA)溶液中。在该溶液中加入20μl 3M氯化钠和乙醇，在-70℃下静置90分钟。将该混合物在4℃下以12，000×g离心30分钟，得到沉淀物。将沉淀溶于TE中，按与上述相同的方式加入氯化钠和乙醇。在-70℃下静置该混合物，得到沉淀物。将该沉淀溶于10μl TE中，从而得到纯化的RNA。
步骤2(制备得自肝脏的RNA，用于生产与NANBV基因组RNA互补的cDNA)从NANBV肝炎患者体内切除肝组织，用Okayama等人的方法由该肝组织制备NANBV基因组RNA(见H.Okayama，M.Kawaichi，M.Brownstein，F.Lee，T.Yokota和K.Arai全长cDNA的高效克隆;哺乳动物细胞cDNA表达文库的构建和筛选，Methods in Enzymology，1543-28，1987)。
举例来说，取1g肝组织切成小块。把这些小块悬浮在100ml如步骤1中所用的5.5M GTC溶液中，利用特氟隆-玻璃匀浆器进行匀浆。然后，反复把匀浆液吸入带18号针头的注射器再把匀浆液经针头从注射器中排放出，从而机械断裂DNA。把所得匀浆液在4℃下以1，500×g(较低的离心力)离心15分钟，从而得到上清液。把上清液铺在CsTFA溶液上，并按与步骤1所述基本相同的方式离心，从而得到作为RNA部分的沉淀。把所得沉淀悬浮在0.4ml 4M GTC溶液中。在该悬浮液中加入10μl 1M乙酸和300μl乙醇，并在-20℃的温度下静置至少3小时，从而得到RNA沉淀。在4℃的温度下以12，000×g离心10分钟，分离出沉淀并将其溶于TE溶液中。在该溶液中加入100μl 2M氯化钠溶液和3ml乙醇，并将该混合物在-20℃下放置3小时。离心收集所得的沉淀并将其溶于10μl TE中，从而得到得自肝脏的纯化RNA。
步骤3(利用cDNA合成试剂盒制备双链cDNA)利用市售的cDNA合成试剂盒(英国Amersham International公司制造并销售)制备双链cDNA。
举例来说，将0.75μg步骤1得到的纯化RNA和从试剂盒中包括的试剂中取出的2μl无规六核苷酸引物和2μl反转录酶，置于一个反应管中。然后加入一定量的蒸馏水使所得混合物的总体积变为20μl。将该混合物于42℃下保温40分钟，从而制备cDNA的第一条链。随后在反应混合物于冰水中冷却的同时如下所述合成cDNA的第二条链。在20μl反应混合物中加入从试剂盒中所包括的试剂中取出的37.5μl第二链合成反应缓冲液、1μl大肠杆菌核糖核酸酶H和6.6μl DNA聚合酶Ⅰ，接着加入34.9μl蒸馏水。将该混合物于12℃下保温60分钟，于22℃下保温60分钟，于70℃下保温10分钟。然后将混合物再次用冰水冷却。加入1μl T4 DNA聚合酶，于37℃的温度下保温10分钟，再加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)，从而使反应终止。将该反应混合物与苯酚和氯仿的混合物充分混合，以12，000×g离心1分钟，从而分出水层。水层再进行与上述同样的提取并加入等量的氯仿。将该混合物充分搅拌并离心分出水层。随后在水层中加入等量的4M乙酸铵和二倍量的乙醇，并将该混合物冷却至-70℃，从而获得纯化的双链cDNA的沉淀。将沉淀溶于50μl 2M乙酸铵中。在该混合物中加入100μl乙醇，将所得混合物冷却至-70℃，从而得到沉淀。以12，000×g离心10分钟收集沉淀。将所收集的沉淀干燥后溶于20μl TE中。
步骤4(用聚合酶链反应(PCR)法制备双链cDNA)以步骤1和步骤2制备的RNA作模板，利用反转录酶制备cDNA，把这些cDNA分别用PCR法扩增(见Saiki，R.K.，Gelfand，D.H.，Stoffer，S.，Scharf，S.J.，Higuchi，R.，Horn，G.T.，Mullis，K.B.和Erlich，H.A.，用耐热DNA聚合酶进行引物指导的DNA酶促扩增，Science 239487-491，1988)。具体来说，取5-1，000ng RNA，于37℃下在20μl反转录酶溶液中保温30分钟，该溶液中含有50mM Tris·HCl(pH8.3)、40mM KCl、6mM MgCl2、1μM3′引物G(由图2(14)中7949至7973位的25个核苷酸组成的合成寡核苷酸)、10mM dNTP、0.5单位反转录酶(美国新英格兰Biolab公司的产品)。在所得混合物中加入80μl PCR反应溶液，该溶液中含有18mM Tris·HCl(pH8.3)、48mM KCl、1.5mM MgCl2、5′引物(由图2(13)中7612至7636位的25个核苷酸组成的合成寡核苷酸)和上述3′引物各0.6μM、10mM dNTP、2.5单位Taq DNA聚合酶(美国Perkin Elmer Cetus公司制造并销售)。将该混合物于94℃下保温1分钟，于50℃下保温2分钟，于72℃下保温3分钟。重复这一保温操作40次。用琼脂糖凝胶对所得混合物进行电泳，从而得到经过扩增的cDNA。对扩增的cDNA进行苯酚处理、乙醇沉淀和干燥。将干燥的cDNA溶于10μl TE中。
步骤5(用λgt11制备cDNA文库)用市售的cDNA克隆试剂盒(英国Amersham International公司制造并销售)制备cDNA文库。具体说，在130ng从步骤3中制得的cDNA中，加入从克隆试剂盒中所包括的试剂中取出的2μl L/K缓冲液、2μl EcoRI适配接头和2μl T4 DNA连接酶。在该溶液加入一定量的蒸馏水，使所得混合物的总体积变为20μl。将该混合物于15℃的温度下保温16-20小时，向其中加入2μl 0.25M EDTA从而终止反应。然后使该混合物通过包括在试剂盒中的筛析柱，从而除去未与cDNA连接的EcoRI适配接头。在700μl连有EcoRI适配接头的cDNA中加入83μl L/K缓冲液和8μl T4多核苷酸激酶。将混合物于37℃的温度下保温30分钟。对所得混合物进行苯酚提取两次，利用丁醇浓缩至350-400μl，然后进行乙醇沉淀，从而得到沉淀物。将沉淀溶于5μl TE中。
随后，为了将连有EcoRI适配接头的cDNA插入克隆载体λgt11的EcoRI位点，在1μl(10ng)上述连有EcoRI适配接头的cDNA中加入1μl L/K缓冲液、2μl(1μg)λgt11臂DNA和2μl T4 DNA连接酶。在该混合物中加入一定量的蒸馏水，使混合物的总体积变为10μl。将该混合物在15℃的温度下保温16-20小时。这样便制得重组λgt11 DNA溶液。另外，利用包含有Gigapack Ⅱ Gold溶液A和B、SM缓冲液和氯仿的市售体外包装试剂盒(美国Stratagene公司制造并销售)通过体外包装得到重组λ噬菌体。具体说，在4μl上述重组λgt11 DNA溶液中加入10μl Gigapack Ⅱ Gold溶液A和15μl Gigapack Ⅱ Gold溶液B。将该混合物于22℃下保温2小时。保温后，加入470μl SM缓冲液和10μl氯仿，从而得到重组噬菌体，在4℃下贮存。
步骤6(用大肠杆菌质粒pUC 19克隆cDNA)利用包含有溶液A和B的市售DNA连接试剂盒(日本Takara Shuzo公司制造并销售)，把cDNA插入大肠杆菌质粒pUC 19中(C.Yanishi-Perron，J.Vieira，J.Messing，Gene 33103，1985)，并在大肠杆菌中克隆。具体说，在5μl由步骤4的聚合酶链反应(PCR)制得的cDNA和5μl(50ng)已用限制酶SmaⅠ消化并去磷酸化的质粒pUC 19 DNA中，加入40μl溶液A和10μl溶液B。将该混合物在15℃的温度下保温16小时。按氯化钙法(见Mandel，M和A.Higa，J.Mol.Biol.，53154，1970)用前面得到的质粒DNA转化大肠杆菌JM 109株(见Messing，J.，Crea，R.和Seeburg，P.H.，Nucleic Acids Res.9309，1981)。这样便得到转化的大肠杆菌，其中含有连有cDNA的质粒。
步骤7(从cDNA文库中筛选带有NANBV基因的克隆)于37℃的温度下，在50ml LBM培养基中培养大肠杆菌Y1090株(见Richard A.Young和Ronald W.Davis，Science，222778，1983)，培养基中含有1%胰胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠、50μg/ml氨苄青霉素和0.4%麦芽糖。将处于对数生长期的大肠杆菌细胞悬浮于15ml用冰冷却的10mM硫酸镁中。取步骤5中得到的噬菌体溶液用SM缓冲液稀释，该缓冲液含有0.1M氯化钠、8mM硫酸镁、50mM Tris·HCl(pH7.5)和0.01%明胶。取0.1ml经过稀释的噬菌体溶液与等体积的上述大肠杆菌细胞悬浮液混合，将该混合物于37℃的温度下保温15分钟。在该混合物中加入4ml加热至45℃的软琼脂培养基，该培养基中含有1%胰胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、0.25%硫酸镁和0.7%琼脂(pH7.0)。将该混合物铺在含有1%胰胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠和100μg/ml氨苄青霉素(pH7.0)的L琼脂平板上，并在42℃的温度下保温3小时。随后，使10mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷)渗入一片硝酸纤维素滤膜中，再取一片干燥的硝酸纤维素滤膜与其接触。将上述平板在37℃的温度下保温3小时。把滤膜分开，用TBS缓冲液洗涤三次。把洗过的滤膜浸入到2%牛血清清蛋白溶液中，并在室温下保温1小时。在采自NANB肝炎患者的血清中，加入1/20体积的包括在市售免疫筛选试剂盒(英国Amersham International公司制造并销售)中的大肠杆菌溶菌液，并在室温下保温30分钟。然后用已加入0.2%牛血清清蛋白的TBS缓冲液把上述血清稀释50倍，把滤膜浸入稀释的血清溶液中，在室温下保温1小时。
所得滤膜用含有0.05%吐温20的TBS缓冲液洗涤4次。把洗过的滤膜浸入一种抗体溶液中1小时，该溶液是通过把用过氧化物酶标记的抗人IgG(德国Cappel公司制造并销售)稀释1000倍而制备的。滤膜用上述吐温TBS缓冲液洗涤，将其浸入一种通过在50ml TBS缓冲液中加入0.4ml DAB(3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐)和15μl 30%过氧化氢水溶液而制成的溶液中，然后在室温下保温5-30分钟使其显色。所得滤膜用蒸馏水彻底洗涤以终止反应。
用上述方法对所得的噬菌斑进行纯化。结果分离出11个阳性克隆，分别命名为BK102、BK103、BK104、BK105、BK106、BK107、BK108、BK109、BK110、BK111、BK112。所有这些克隆都不与健康人的血清反应，但与NANB肝炎患者的血清反应。见表1。
表1得自NANB肝炎患者的血清与重组λgt11噬菌体克隆之间的反应性克隆 健康人血清 NANB肝炎患者血清BK 102 0/10＊10/11BK 103 0/10 9/11BK 104 0/10 11/11BK 105 0/10 11/11BK 106 0/10 11/11BK 108 0/10 9/11BK 109 0/10 9/11BK 110 0/10 9/11BK 111 0/10 9/11BK 112 0/10 10/11＊阳性样品数/标本数步骤8(所得克隆核苷酸顺序的测定)收集克隆BK102至BK112的重组噬菌体DNA，用限制酶EcoRI消化所收集的DNA。然后分离出NANBV的cDNA片段，把分离出的cDNA分别插入质粒pUC 19的EcoRI位点。用这些质粒按与步骤7基本相同的方式转化大肠杆菌JM 109株。从转化的大肠杆菌中得到质粒DNA并进行纯化。利用7-DEAZA测序试剂盒(日本Takara Shuzo公司制造并销售;见Mizusawa，S.，Nishimura，S.和Seela，F.，Nucleic Acids Res.，141319，1986)测定每个NANBV cDNA的核苷酸顺序。所得cDNA克隆的各核苷酸顺序间的相互关系示于图1(1)中。
步骤9(通过基因组行走从cDNA文库中克隆NANBV cDNA克隆)取步骤8中得到的克隆BK102、克隆BK106和克隆BK112的cDNA片段，用32P-dCTP标记，制得探针。用这些探针与步骤5中得到的克隆载体λgt11的cDNA文库杂交，得到含有NANBV cDNA的噬菌体克隆。即，由步骤8得到的用克隆BK102、克隆BK106和克隆BK112转化的大肠杆菌，用碱法制备质粒DNA(见T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook噬菌体和质粒DNA的分离“分子克隆”75-96页，冷泉港实验室)。
用限制酶NcoⅠ和HincⅡ消化克隆BK102的质粒DNA，将得到的已位于DNA 5′端的0.7kb片段用琼脂糖凝胶进行电泳并收集。用限制酶NcoⅠ消化克隆BK106和克隆BK112的质粒DNA。按与上述相同的方式，从克隆BK106中收集1.1kb DNA片段，从克隆BK112中收集已位于3′端的0.7kb片段。利用市售的DNA标记试剂盒(日本基因株式会社制造)，将25ng至1μg DNA片段与〔α-32P〕dCTP(3000居里/毫摩尔;英国Amersham公司制造)一起于37℃的温度下保温3-5小时。这样便制得杂交探针。
随后，如步骤7所述，将步骤5得到的cDNA文库噬菌体在L琼脂培养基中于42℃的温度下保温3小时。再将该噬菌体在37℃的温度下保温3小时，然后冷却。将一块硝酸纤维素滤膜铺在该混合物上，静置30-60秒。这样便使噬菌体吸附到滤膜上。
用含有0.5N氢氧化钠和1.5M氯化钠的水溶液使滤膜进行碱变性1-5分钟，再用含0.5M Tris·HCl(pH8.0)和1.5M氯化钠的水溶液中和1-5分钟。滤膜用含有0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠的2×SSC溶液洗涤，空气干燥，在80℃的温度下烘烤2小时。
将滤膜在42℃的温度下置于杂交溶液中保温6小时，杂交溶液中含有50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhart溶液、50mM磷酸-柠檬酸缓冲液(pH6.5)、100μg/ml鲑鱼精DNA和0.1%SDS。然后把滤膜浸入300ml加有1ml约4×108cpm/ml上述探针的杂交溶液中，在42℃的温度下保温16-20小时。滤膜用含有0.1%2×SSC的SDS溶液洗涤4次，用含有0.1%0.1×SSC的SDS溶液洗涤两次。洗涤后，把滤膜干燥并进行放射自显影。这样便分离出杂交阳性克隆。结果得到27个能与得自克隆BK102的探针反应的克隆、14个能与得自克隆BK106的探针反应的克隆、13个能与得自克隆BK112的探针反应的克隆，分别命名为BK114至BK169。
按步骤8所述的方法测定克隆BK114至BK169各自的核苷酸顺序，然后对每个克隆进行图谱分析。结果得到长度约为9.5kb的核苷酸顺序图谱〔见图1(2)〕，这一长度被认为是NANBV基因组的大致总长度。
用限制酶KpnⅠ消化位于5′端的克隆BK157，从而收集已位于5′端的0.55kb片段。另外，用限制酶HpaⅠ和EcoRⅠ消化位于远3′端的克隆BK116，从而收集已位于3′端的0.55kb片段。按与上述相同的方式制备用32P标记的探针，并对步骤5得到的cDNA文库噬菌体进行噬菌斑杂交。结果用得自克隆BK157的探针分离出三个额外的新克隆。这些新克隆分别命名为BK170、BK171和BK172克隆。
步骤10(cDNA核苷酸顺序的分析)由步骤8和9得到的各克隆的核苷酸顺序确定NANBV基因的整个核苷酸顺序，并示于图2(1)至2(16)。由附图推测，所克隆的NANBV基因组cDNA由9416个核苷酸组成，其中有一个由9030个核苷酸组成的开放读码，这9030个核苷酸编码一个由3010个氨基酸残基组成的多肽。这个蛋白的亲水性/疏水性分布与已报道的黄热病病毒的相似(见H.Sumiyoshi，C.Mori，I.Fuke等，日本脑炎病毒基因组RNA的完整核苷酸顺序，Virology，161497-510，1987)。参见图2(1)至2(16)中的代表性克隆BK157(1至1962位核苷酸)、克隆BK172(5至366位核苷酸)、克隆BK153(338至1802位核苷酸)、克隆BK138(1755至5124位核苷酸)、克隆BK129(4104至6973位核苷酸)、克隆BK108(6886至8344位核苷酸)、克隆BK166(8082至9416位核苷酸)。它们的保存形式分别为大肠杆菌BK108(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2971)、BK129(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2972)、BK138(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2973)、BK153(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2974)、BK157、BK166(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2975)、BK172(保藏在日本发酵研究所，登记号为FERM BP-2976)。
步骤11(在大肠杆菌中生产NANBV相关抗原，该抗原与伴随NANBV感染的抗体反应相关)取分别得自步骤8的克隆BK106、克隆BK111和克隆BK112各自的cDNA及步骤9得到的克隆BK147的cDNA，分别插入质粒中，所得的质粒DNA用常规碱法收集。随后，用限制酶EcoRI和ClaⅠ消化所收集的克隆BK106 DNA，从而得到0.5μg长度为0.34kb的DNA片段。将所得的DNA片段置于T4 DNA聚合酶溶液中，于37℃下保温60分钟，从而使DNA片段的两个末端变平。所述聚合酶溶液中含有67mM Tris·HCl(pH8.8)、6.7mM氯化镁、16.6mM硫酸铵、10mM2-巯基乙醇、6.7μM EDTA、0.02%牛血清清蛋白、0.3mM dNTP、2-5单位T4 DNA聚合酶。用限制酶BamHI消化克隆BK102的DNA，从而收集0.5μg长度为0.7kb的DNA片段，利用T4 DNA聚合酶，按与上述基本相同的方式使所述DNA片段的末端变平。用限制酶Sau3AI消化克隆BK147的DNA，从而得到0.5μg长度为1kb的DNA片段，并按与上述相同的方式使该DNA片段的末端变平。另外，用限制酶EcoRI消化克隆BK111的DNA，从而得到0.5μg长度为1kb的DNA片段，并按与上述基本相同的方式使该DNA片段的末端变平。随后用限制酶HindⅢ消化表达载体pKK233-2的DNA(Amann，E.和J.Brosius，供克隆基因在大肠杆菌中高水平调控表达的ATG载体，Gene，40183，1985)。将2μg所得DNA在S1核酸酶溶液中于37℃下保温20分钟，所述溶液中含有0.3M氯化钠、50mM乙酸钠(pH4.5)、1mM硫酸锌、100-200单位S1核酸酶。加入各1/10体积的0.12M EDTA和1M Tris·HCl溶液(pH9.0)终止反应。然后进行苯酚提取，用乙醇沉淀出带平末端的载体DNA，并收集之。另一方面，用限制酶PstⅠ消化载体pKK233-2的DNA，经过消化的DNA用苯酚提取和乙醇沉淀法进行纯化。取2μg已用限制酶PstⅠ切割的纯化载体DNA，利用上述T4 DNA聚合酶反应使其末端变平。所得到的得自克隆BK106和克隆BK111的DNA片段分别用限制酶HindⅢ切割。取切割后的DNA片段各0.5μg与0.5μg带平末端的载体DNA混合。得自克隆BK102和克隆BK147的DNA片段分别用限制酶PstⅠ切割。取切割后的DNA片段各0.5μg与0.5μg末端已变平的载体DNA混合。加入2μl 10×连接溶液把每个混合物的体积调整到20μl，连接溶液中含有500mM Tris·HCl(pH7.5)、100mM氯化镁、100mM DTT和10mM ATP、300-400单位T4 DNA连接酶及蒸馏水。把各混合物在14℃下保温12-18小时，从而得到几个质粒，分别命名为pCE-06、pE-11、pB-02和pS-09。按与步骤6所述基本相同的方式，用上述质粒DNA中的每个DNA转化大肠杆菌JM109株，从而得到转化的大肠杆菌。将转化的大肠杆菌于37℃下培养在含有1%(W/V)胰胨、0.5%(W/V)酵母提取物和1%(W/V)氯化钠的LB培养基(pH7.5)中，当其处于对数生长期时，在培养基中加入1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)。再继续培养3小时。然后离心(10，000×g，15分钟)收集大肠杆菌细胞，并使收集的细胞在50mM Tris·HCl(pH8.0)中溶解。将该混合物进行超声处理(20KH2，600W，5分钟)，以10，000×g离心15分钟，从而得到上清液部分和沉淀部分。把每个部分溶于含有20%(V/V)甘油、0.1M Tris·HCl(pH6.8)、2%(W/V)SDS、2%(V/V)2-巯基乙醇和0.02%BPB的样品缓冲液中，于100℃下加热30分钟，用0.1%SDS-7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使蛋白质分离。电泳后，利用印迹转移槽(trans blot cell)(美国BIO·RAD公司制造并销售)把蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上。把该滤膜浸入3%明胶溶液中并静置60分钟。使滤膜在室温下与已稀释100倍的NANB肝炎患者血清一起保温2-3小时。滤膜用蒸馏水洗涤，然后再用含有0.02M Tris·HCl(pH7.5)、0.5M氯化钠和0.05%(V/V)吐温20的TTBS溶液洗涤。随后把洗过的滤膜浸入稀释2，000倍的过氧化物酶标记的抗人IgG抗体溶液中，在室温下保温90分钟。滤膜用蒸馏水洗涤，然后用TTBS溶液洗涤。如步骤7所述，把洗过的滤膜浸入加有着色剂DAB和30%(以底物计)过氧化氢的缓冲液中5-30分钟，然后用水洗涤终止反应。
结果如表2所示，由这些质粒产生的所有抗原都能与NANB肝炎患者的血清起特异反应，从而证实，由插入这些质粒中的cDNA产生的蛋白在临床上很重要。
表2用Western吸印法测定的由各种质粒所产生的蛋白与NANB肝炎患者血清之间的反应性NANA肝炎质粒 cDNA来源 提取液 患者血清 健康人血清pCE-066 BK 106 S ± -P + -pE-11-89 BK 111 S ± -P + -pB-02-10 BK 102 S + -P - -ps-09-07 BK 109 S ± -P + -pKK233-3 - S - -P - -S离心上清液P离心沉淀+阳性±略呈阳性-阴性步骤12(由大肠杆菌产生的NANBV相关抗原的纯化及其与肝炎患者血清的反应性)纯化出由插入表达载体中的cDNA产生的蛋白，并用该纯化蛋白作抗原进行ELISA或放射免疫测定，从而证实该蛋白的有用性。具体说，取步骤11得到的转化的大肠杆菌的溶菌产物，以10，000×g离心15分钟，从而得到上清液和沉淀。例如，把由转化体JM109/pCE066得到的沉淀悬浮在100mM Tris·HCl(pH8.0)和0.1%Triton X-100的溶液中，所得悬浮液以20KH2(600W)频率超声处理1分钟，然后以21，000×g离心15分钟，从而得到沉淀。把沉淀再悬浮于100mM Tris·HCl(pH8.0)和6M脲的溶液中，然后进行超声处理，随后离心。
所得上清液对10mM磷酸缓冲液(pH7.5)和6M脲的溶液透析，从而得到抗原溶液。取20ml该抗原溶液使其通过已用上述缓冲液平衡的羟磷灰石填充柱(21.5×250mm)，使抗原吸附到填充物上。对该柱进行高速液相层析(HPLC)，用加有氯化钠的上述缓冲液进行洗脱，洗脱液中氯化钠的浓度以线性浓度梯度从0变化至2M，从而得到含抗原的部分。所得部分对50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)和0.05%十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液透析。
另外，将由转化体JM109/pB-02-10的溶菌产物离心(10，000g，15分钟)得到的上清液用35%饱和硫酸铵处理，将所得沉淀溶于50mM Tris·HCl(pH8.5)和100mM 2-巯基乙醇的溶液中。所得溶液对上述缓冲液透析。随后取100ml透析后的溶液，使其通过已用上述缓冲液平衡的DEAE纤维素填充柱(22.0×220mm)，使抗原吸附到填充物上。对该柱进行高效液相层析，用加有氯化钠的50mM Tris·HCl(pH8.5)和100mM 2-巯基乙醇的溶液进行洗脱，其中氯化钠的浓度从0至2M以线性浓度梯度变化，从而收集含抗原的部分。
将该部分对10mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)和100mM2-巯基乙醇的溶液透析。使透析后的溶液通过已用上述缓冲液平衡的羟磷灰石柱高效液相层析柱，使抗原收附到填充物上。对该柱进行高速液相层析，用磷酸进行洗脱，磷酸的浓度从10至400mM以线性浓度梯度变化，从而收集含抗原的部分。将所得部分对50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)和0.05%SDS的溶液进行透析。
将由转化体JM109/pE-11-89的溶菌产物离心得到的沉淀悬浮于10mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)中。对该悬浮液进行上述超声处理1分钟，然后以21，000×g离心15分钟。将所得沉淀悬浮于100mM碳酸盐缓冲液(pH10.5)、500mM氯化钠和10mM EDTA的溶液中。所得悬浮液再进行超声处理1分钟，然后离心。所得上清液对30mM磷酸盐缓冲液和6M脲的溶液透析。然后取20ml经过透析的溶液使其通过已用与上述透析所用缓冲液相同的缓冲液平衡的CM纤维素高效液相层析(HPLC)柱(22×200mm)，从而使抗原吸附在填充物上。对该柱进行高效液相层析，用加有氯化钠的上述缓冲液进行洗脱，氯化钠的浓度从0至1.5M以线性浓度梯度变化，得到含有抗原的部分。将该部分对含有50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)和0.05%SDS的溶液透析，从而得到含抗原的溶液。
用以上制备的抗原作为ELISA的抗原，对非甲非乙型肝炎病毒的感染进行临床诊断。把每种上述纯化抗原的蛋白浓度调至1μg/ml，并置于供ELISA用的微量滴定板Immulone 600(德国Greiner公司制造并销售)的各小孔中，使该小孔于4℃下静置过夜。把各小孔的内容物用含10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、0.8%氯化钠和0.05%吐温20的PBS-T缓冲液充分洗涤三次，加入用PBS-T缓冲液稀释的样品血清，加入量为100μl/孔，然后在37℃下反应1小时。把各小孔的内容物用PBS-T缓冲液洗涤三次，加入已用含10%胎牛血清的PBS-T缓冲液稀释8000倍的过氧化物酶标记抗人IgG抗体(德国Cappel公司制造并销售)，加入量为100μl/孔。使各小孔的内容物在37℃下反应1小时，再用PBS-T缓冲液洗涤4次。以100μl/孔的量加入底物显色剂溶液，该溶液的组成为9ml 0.05M柠檬酸-磷酸盐缓冲液和其中所含的0.5μg邻苯二胺及20μl过氧化氢水溶液。使该板在室温下避光静置60分钟。每小孔加入75μl 4N硫酸，测定490nm处的光吸收。结果示于表3。从该表明显可见，所有得自转化体的抗原都能与NANB肝炎患者的血清起特异反应，从而证实了由转化体产生的抗原可用于临床诊断。
表3得自各种转化大肠杆菌的纯化抗原与NANB肝炎患者血清在ELISA中的反应性输血肝炎患者的血清抗原来源(转化大肠杆菌) 急性 慢性 肝硬变 肝肿瘤 健康人血清JM109/pCE-066 2/3＊ 7/8 3/4 3/3 0/10JM109/pB-02-10 2/3 8/8 4/4 3/3 0/10JM109/pE-11-89 2/3 8/8 2/4 3/3 0/10
＊阳性样品数/所检查的样品总数用上述抗原进行放射免疫测定也得到与表3所示同样的结果。即，在0.2ml浓度为1μg/ml的上述纯化抗原溶液中，各放入一个直径1/4英寸的聚苯乙烯球(德国Pesel公司制造并销售)，并于4℃下静置过夜。然后将该聚苯乙烯球用与上述ELISA中所用相同的PBS-T缓冲液洗涤5次，并加入用PBS-T缓冲液稀释20-2500倍的样品血清，加入量为200μl/球。反应在37℃下进行60分钟。将该聚苯乙烯球用PBS-T缓冲液洗涤5次，并以200μl/球的量加入125I标记的抗人IgG抗体。反应在37℃下进行1小时，把该球用PBS-T缓冲液洗涤5次。测量与聚苯乙烯球结合的125I的cpm数，从而得到与表3所示相同的结果。这样便证实了前面得到的纯化抗原可用于对NANB肝炎病毒感染进行临床诊断。
应用实施例1(合成多肽反应性的测定)抗体分子与抗原分子上存在的称为“抗原决定基”的特异结构区反应，从而在二者之间形成连键。这样一种特异区可在抗原分子的亲水区中找到。据信具有这样一种特异区的抗原多肽可用于简便地制备具有高度反应特异性的重要临床诊断剂。NANBV的抗原决定基是从由图2(1)至2(16)所示NANBV基因组cDNA编码的氨基酸顺序的亲水性/疏水性分布来推测的。即，制备出多肽BKP-106-1、BKP-106-2、BKP-102-1和BKP-147-1，它们分别由以下核苷酸所编码的氨基酸残基组成图2(1)所示的333至422位核苷酸、图2(1)至图2(2)所示的474至563位核苷酸、图2(8)所示的4485至4574位核苷酸、图2(10)所示的5544至5633位核苷酸。把制得的每个多肽的浓度调整到1μg/ml，按与步骤12所述相同的方法加到ELISA用的微量滴定板上，从而形成固相，用ELISA法检查它们与NANB肝炎患者血清的反应性。结果示于表4。由该表明显可见，所制得的所有多肽都与NANB肝炎患者的血清特异反应，从而证实了上述核苷酸顺序中的特定区域在临床诊断中的重要性。
表4合成多肽与NANB肝炎患者血清的反应性NANB肝炎患者血清合成多肽 急性 慢性 健康人BKP-106-1 2/5 5/5 0/5BKP-106-2 2/5 5/5 0/5BKP-102-1 3/5 5/5 0/5BKP-147-1 2/5 5/5 0/5此外，为推测NANBV被膜蛋白的抗原决定基，制备了三种类型的蛋白。即，制备了由以下核苷酸编码的蛋白图2(2)所示的906至953位核苷酸、图2(2)所示的1020至1046位核苷酸、图2(2)至图2(3)所示的1194至1232位核苷酸。所制得的所有多肽都相应于被膜的某些区域，据信在这些区域中随NANBV株的类型而发生抗原变异，并验证了它们在ELISA中与NANB肝炎患者血清的反应性。这些事实证实了上述蛋白在免疫监督、临床诊断和接种中的重要性和有用性。
应用实施例2〔按PCR(聚合酶链反应)法检测NANBV核酸〕
对预防由输血引起的NANB肝炎来说，重要的是要确定供输血用的血液中是否存在有NANBV感染。另外，对诊断肝炎来说，在临床上极为重要的是研究肝组织中是否存在NANBV感染。本发明的NANBV cDNA可以便利地用于生产用于检测NANB肝炎的聚合酶链反应(PCR)引物。即，如步骤1所述，由1ml血清进行RNA的纯化和cDNA的制备。同样，如步骤2所述由肝细胞制备cDNA。随后，如步骤4所述进行PCR和电泳。利用从得自NANBV cDNA克隆BK108的cDNA制得的32P标记探针，用Southern杂交法按通常步骤研究扩增出的cDNA是否来自NANBV。
结果示于表5。由该表明显可见，利用由按本发明得到的NANBV cDNA核苷酸顺序制得的引物，以及以克隆的NANBV cDNA片段作探针，都能够检测出血清中的NANBV核酸，并能诊断血清的NANBV感染。
表5利用PCR检测NANBV核酸样品 抗NANBV抗体 PCR慢性肝炎患者的血清NANB 1 + +2 + +HBV 携带者 1 - -2 - -健康人 1 - -2 - -从NANB肝肿瘤切除 +的肝脏-1
表5(续)样品 抗NANBV抗体 PCR癌部位 +非癌部位 +从NANB肝肿瘤切除 +的肝脏-2癌部位 +非癌部位 +实施例2表达NANBV基因组cDNA整个编码区的质粒的构建及NANBV基因组cDNA在大肠杆菌中的表达从步骤8和9得到的克隆BK112、BK146、BK147、BK157和BK166中分别分离出cDNA，按步骤11所述的方法如下制备供表达整个NANBV基因编码区的质粒。
用限制酶BamHⅠ消化克隆BK157的质粒DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到长度为1.3kb的DNA片段。将该DNA片段插入质粒pUC19的BamHⅠ位点，从而得到质粒pBam 157。用限制酶XbaⅠ和NcoⅠ消化质粒pBam 157，从而得到长度约3.9kb的DNA片段。另外，把连有XbaⅠ接头顺序的噬菌体T7 RNA聚合酶的20bp启动子区顺序(TAATACGAC TCACTATAGGG)，与连有NcoⅠ接头顺序的图2(1)所示1至73位核苷酸顺序连接，合成出一个93bp的寡核苷酸(3′端有4个核苷酸缺失)。把所得的寡核苷酸与上述3.9kb DNA片段连接，从而得到质粒pDM-16。然后用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化pDM-16，得到约3.5kb的DNA片段。另外，用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK146的DNA，得到长度为4.1kb的DNA片段。把上述约3.5kb的DNA片段与所得的4.1kb DNA片段连接，从而得到质粒pDM-9。然后用SacⅡ消化质粒pDM-9，从而得到一个2.7kb的DNA片段和一个4.9kb的DNA片段。用T4 DNA连接酶使4.9kb DNA片段在其SacⅡ位点处连接，然后用BamⅡ和EcoRⅠ消化，从而得到约7.5kb的DNA片段。另外，用BamⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK147的DNA，从而得到约2kb的DNA片段。使所得的DNA片段与上述7.5kb DNA片段连接，从而得到质粒pBE147。用SacⅡ消化质粒pBE147。将得自pDM-9的上述2.7kb DNA片段插入已用SacⅡ消化的pBE147中，从而得到质粒pDM-B3。用XbaⅠ和EcoRⅠ消化质粒pDM-B3，从而得到6.7kb的DNA片段。
用BamHⅠ消化克隆BK166的DNA，得到1.3kb的DNA片段。将该片段插入pUC19的BamHⅠ位点，得到pBam166。用NdeⅠ和HindⅢ消化pBam166，从而得到2.8kb的DNA片段。用EcoRⅠ和NdeⅠ消化克隆BK112的DNA，得到约1.6kb的DNA片段。用EcoRⅠ和HindⅢ消化pUC19，得到约2.6kb的DNA片段。将上面得到的三种类型的DNA片段与T4 DNA连接酶混合并反应，从而得到质粒pEN112，上述片段在此质粒中以其EcoRⅠ位点、NdeⅠ位点和HindⅢ位点连接在一起。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化质粒pEN112，得到2.7kb的DNA片段。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化pSac4629，得到6.7kb的片段。使上述2.7kb片段与6.7kb片段连接，将所得的连接DNA片段插入pUC19的XbaⅠ位点中，从而得到质粒pDM-22和pDM-18。质粒pDM-18可用于转化动物细胞等，使该细胞能产生NANBV抗原多肽。利用体外转录试剂盒(日本Berlinger Manhein山之内株式会社制造并销售)转录pDM-18，利用所制得的RNA也可以进行上述转化。质粒pDM-22中cDNA和pDM-18是以相反取向插入的，用HindⅢ和ClaⅠ消化质粒pDM-22，得到约9kb的DNA片段。
用BamHⅠ消化克隆BK106的DNA，得到约1.0kb的DNA片段。把此片段插入质粒pUC19的BamHⅠ位点中，得到质粒pBam106。用NcoⅠ消化所得到的质粒DNA，用绿豆核酸酶(日本Takara Shuzo公司制造并销售)使粘性末端变平。所得质粒用XbaⅠ进一步消化，从而得到约3.6kb的片段。把图2(1)所示的333至372位核苷酸顺序与XbaⅠ接头的下游连接，制备出一个合成寡核苷酸，将其与上述片段连接，从而得到质粒pXb106。用HindⅢ和ClaⅠ消化质粒pXb106，得到0.4kb的DNA片段。将此片段与得自质粒pDM-22的上述约9kb片段连接，从而得到质粒pORF-24。用XbaⅠ消化质粒pORF-24，得到约9.0kb的DNA片段。将此片段与连有T7 RNA聚合酶基因启动子的表达载体(见F.William Studier和B.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189113，1986)连接，从而得到表达质粒pJF-22。用此质粒DNA按与步骤6基本相同的方式转化大肠杆菌JM109(DE3)株(美国Promega公司制造并销售)，从而得到转化体JM109(DE3)/pJF-22。
如实施例1所述对转化体大肠杆菌JM109(DE3)/pJF-22进行后续的步骤。即，把该大肠杆菌培养在LB培养基上，然后向其中加入0.5mM IPTG，然后再培养3小时。在此之后，收集培养细胞并在含有2%SDS和2%2-巯基乙醇的缓冲液中于100℃下加热3分钟。对所得细胞进行Western吸印分析，以鉴定所得到的蛋白质。在Western吸印分析中利用了特异性的抗血清，这些抗血清的制备方法是由步骤11得到的转化体制备NANBV相关抗原，纯化该抗原并用它使豚鼠免疫。Western吸印分析的结果发现，由转化体JM109(DE3)/pJF-22产生的蛋白与所有抗血清都发生反应。这便证实，在此转化体中实现了从编码核心蛋白的基因组5′端到编码非结构蛋白NS5的基因组3′端的整个NANBV基因编码区的表达。由这些结果明显可见，这种转化体能提供一种极为有用的抗原，这种抗原不仅可用于生产NANBV感染的诊断剂，而且可用于生产NANBV疫苗。
实施例3通过NANBV基因组cDNA在动物细胞中的表达生产NANBV颗粒用XbaⅠ部分消化实施例2得到的质粒pORF-24，并进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，得到长度约9kb的DNA片段。用Bal31消化所得的DNA片段，并使XhoⅠ接头与其连接。把分别连有该接头的各DNA片段分别插入已用NheⅠ和XhoⅠ切割的质粒pMAM-neo(可从美国Clontech公司得到)中，从而构建出表达质粒。从这些表达质粒中，通过使用合成引物的常规测序方法验证编码RNA聚合酶的NS5区缺陷，来选择出不含NS5区的表达质粒pDEL-NS5。利用磷酸钙法(《分子克隆》，16.33-16.39，冷泉港实验室，1989)，把选择出的表达质粒分别转染到人肝细胞Chan Liver(ATCC CCL13)和黑猩猩肝细胞(购自日本大日本制药株式会社)中。使已导入了质粒pDEL-NS5的肝细胞对氨基葡糖苷类抗生素G418具有抗性。利用这种抗性作标准选择出转化体，然后进行克隆。利用实施例2所用的特异性抗血清，用荧光抗体技术对由前面得到的每个克隆的细胞培养物所产生的多肽进行抗原性测定。结果发现，G418抗性细胞克隆中产生的多肽与除一种抗血清外的所有抗血清反应，例外的这种抗血清是用实施例1的步骤11所得的质粒pE-11-89表达产生的多肽来使豚鼠免疫而得到的抗血清。这一事实意味着，所表达的是除NS5区以外的NANBV基因编码区，即从核心蛋白到NS4的区域。另外，相信这些抗原多肽部分凝集而形成病毒样颗粒，即RNA缺陷型NANBV颗粒。
权利要求
1.一种分离的脱氧核糖核酸，它包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸的至少一部分；另一个核苷酸顺序则与所述核苷酸顺序互补，或包含至少一个由所述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸所得到的核苷酸顺序。
2.按照权利要求1的脱氧核糖核酸，其中所述核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少6个核苷酸。
3.按照权利要求1的脱氧核糖核酸，其中所述核苷酸顺序选自333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、1至9416位核苷酸的核苷酸顺序。
4.一种分离的抗原多肽，该多肽包含至少一个氨基酸顺序，该氨基酸顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，所述脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序中333至9362位核苷酸的编码区。
5.按照权利要求4的抗原多肽，其中所述部分包含一个至少4个氨基酸的氨基酸顺序，该氨基酸顺序由333至9362位核苷酸的核苷酸顺序中至少12个核苷酸的核苷酸顺序编码。
6.按照权利要求4的抗原多肽，其中所述部分包含一个由选自以下顺序的核苷酸顺序编码的氨基酸顺序333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、333至9362位核苷酸的核苷酸顺序。
7.一种生产非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽的方法，该方法包括(a)把一个脱氧核糖核酸插入选自质粒和动物病毒基因的可复制表达载体中，如果所述可复制表达载体为质粒，则得到一个可复制的重组DNA，该DNA包含所述质粒和插入其中的所述脱氧核糖核酸;如果所述表达载体为动物病毒基因，则得到一个重组病毒，该病毒包含所述动物病毒基因和插入其中的所述脱氧核糖核酸，所述脱氧核糖核酸包含至少一个选自如下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序的333至9362位核苷酸编码区的至少一部分;另一个核苷酸顺序由所述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸而得到;(b)如果步骤(a)所用的所述可复制表达载体为质粒，则用所述重组DNA转染微生物细胞或真核细胞培养物，从而形成转化体，接着从亲本微生物细胞或真核细胞培养物中选择出所述转化体;(c)培养步骤(b)得到的所述转化体，从而表达所述脱氧核糖核酸，产生单一形式的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽;或者培养步骤(a)得到的所述重组病毒，从而表达所述脱氧核糖核酸和所述动物病毒基因，以已增殖重组病毒形式产生非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽，该重组病毒包含动物病毒和其表面上所含有的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽;(d)分离出所述非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽或所述已增殖的重组病毒。
8.按照权利要求7的方法，其中所述核苷酸顺序包含333至9362位核苷酸的核苷酸顺序中的至少12个核苷酸。
9.按照权利要求7的方法，其中所述核苷酸顺序选自333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、333至9362位核苷酸的核苷酸顺序。
10.按照权利要求9的方法，其中所述核苷酸顺序为333至9362位核苷酸的核苷酸顺序或333至6371位核苷酸的核苷酸顺序，从而产生一个完整的或不完整的非甲非乙型肝炎病毒颗粒作为非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽。
11.一种由权利要求10的方法产生的完整的或不完整的非甲非乙型肝炎病毒颗粒。
12.一种可复制的重组DNA，该DNA包含一个选自质粒和动物病毒基因的可复制表达载体和一个脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序的1至9416位核苷酸编码区中的至少一部分;另一个核苷酸顺序是由所述核苷酸顺序按遗传密码的简并性置换至少一个核苷酸而得到的。
13.按照权利要求12的可复制重组DNA，其中所述核苷酸顺序包含1至9416位核苷酸的核苷酸顺序中的至少6个核苷酸。
14.按照权利要求12的可复制重组DNA，其中所述核苷酸顺序包含333至9362位核苷酸顺序中的至少12个核苷酸。
15.按照权利要求12的可复制重组DNA，其中所述核苷酸顺序选自333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、333至9362位核苷酸的核苷酸顺序。
16.一种用于通过杂交或聚合酶链反应来检测非甲非乙型肝炎的诊断剂，它包含对杂交或聚合酶链反应来说为有效量的一种分离的脱氧核糖核酸，该脱氧核糖核酸包含至少一个选自以下两个顺序的核苷酸顺序一个核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少一部分;另一个核苷酸顺序与所述核苷酸顺序互补。
17.按照权利要求16的诊断剂，其中所述核苷酸顺序包含非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少6个核苷酸。
18.一种用于利用抗原抗体反应来检测非甲非乙型肝炎的诊断剂，它包含对抗原抗体反应来说为有效量的一种分离的抗原多肽，该抗原多肽包含至少一个氨基酸顺序，该氨基酸顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，所述脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序中333至9362位核苷酸的编码区。
19.按照权利要求18的诊断剂，其中所述部分包含一个至少4个氨基酸的氨基酸顺序，该氨基酸顺序由333至9362位核苷酸的核苷酸顺序中至少12个核苷酸的核苷酸顺序编码。
20.按照权利要求18的诊断剂，其中所述部分包含一个由选自以下顺序的核苷酸顺序编码的氨基酸顺序333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、333至9362位核苷酸的核苷酸顺序。
21.一种非甲非乙型肝炎疫苗，它包含有效致免疫量的一种分离的抗原多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂，所述抗原多肽包含至少一个氨基酸顺序，该氨基酸顺序包含至少一部分由一个脱氧核糖核酸编码的氨基酸顺序，所述脱氧核糖核酸包含图2(1)至图2(16)所示的非甲非乙型肝炎病毒核苷酸顺序中的333至9362位核苷酸编码区。
22.按照权利要求21的疫苗，其中所述部分包含一个至少4个氨基酸的氨基酸顺序，该氨基酸顺序由333至9362位核苷酸的核苷酸顺序中至少12个核苷酸的核苷酸顺序编码。
23.按照权利要求21的疫苗，其中所述部分包含一个由选自以下顺序的核苷酸顺序编码的氨基酸顺序333至422位核苷酸的核苷酸顺序、333至677位核苷酸的核苷酸顺序、333至1499位核苷酸的核苷酸顺序、333至6371位核苷酸的核苷酸顺序、474至563位核苷酸的核苷酸顺序、678至905位核苷酸的核苷酸顺序、906至953位核苷酸的核苷酸顺序、906至1499位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1046位核苷酸的核苷酸顺序、1020至1121位核苷酸的核苷酸顺序、1194至1232位核苷酸的核苷酸顺序、1209至1322位核苷酸的核苷酸顺序、1500至2519位核苷酸的核苷酸顺序、2520至3350位核苷酸的核苷酸顺序、3351至5177位核苷酸的核苷酸顺序、4485至4574位核苷酸的核苷酸顺序、5178至5918位核苷酸的核苷酸顺序、5544至5633位核苷酸的核苷酸顺序、5919至6371位核苷酸的核苷酸顺序、6372至9362位核苷酸的核苷酸顺序、333至9362位核苷酸的核苷酸顺序。
24.一种RNA，它是用非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少一部分或全部作为模板而合成的。
25.一种mRNA，它是用非甲非乙型肝炎病毒整个核苷酸顺序即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸中的至少一部分或全部作为模板而合成的。
26.大肠杆菌BK108株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2971。
27.大肠杆菌BK129株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2972。
28.大肠杆菌BK138株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2973。
29.大肠杆菌BK153株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2974。
30.大肠杆菌BK166株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2975。
31.大肠杆菌BK172株，它携有非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，保藏于日本发酵研究所，登记号为FERM BP2976。
全文摘要
公开了一种分离的非甲非乙型肝炎病毒基因组cDNA，它覆盖了病毒基因核苷酸顺序的整个区域，即图2(1)至图2(16)所示的1至9416位核苷酸，其中编码区为333至9362位核苷酸，5′和3′非编码顺序分别含有332个核苷酸和54个核苷酸。该cDNA的部分或全部，以及作为其表达产物的抗原多肽，可以作为非甲非乙型肝炎的诊断剂使用。该抗原多肽还可作为非甲非乙型肝炎病毒疫苗的活性成分使用。
文档编号C12N15/40GK1057861SQ9110057
公开日1992年1月15日 申请日期1991年1月31日 优先权日1990年6月25日
发明者冈山博人, 福家功, 森千里, 高见泽昭久, 吉田岩 申请人:阪大微生物病研究会